脐血间充质干细胞分离培养与鉴定-新桥医院

脐血间充质干细胞分离、培养与鉴定

李启明1程天民1李宁2*粟永萍1冉新泽1

(1.第三军医大学全军复合伤研究所，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室

2.第三军医大学新桥医院, 高压氧中心重庆400038)

摘要：目的研究脐带血(HUCB)中含有的间允质干细胞(MSCs)体外分离、培养条件，探讨其作为种子细胞用于下一步实验研究的稳定性与实用性。方法无菌条件下取正常足生产的脐带血，经CPDA-1复合抗凝剂抗凝，然后经过去红细胞处理，再用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞，DMEM/F12培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层，采用定向诱导分化方法检测鉴定获得的MSCs 结果来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现形态学上可见间充质样的细胞，问充质样细胞为类似成纤维样的细胞形态，但偏向半月形弯曲状，经过成肌、成脂肪、成神经细胞诱导分化成功后确定为间充质干细胞。结论脐血来源的间充质干细胞能够在体外分离、培养出有用的进一步实验所需要的种子细胞。

关键词：脐带血；间充质干细胞；细胞培养；诱导分化鉴定

中图法分类号：文献标识码：

THE ISOLATION CULTURE AND IDENTIFICATION OF HUCA MSCs

LI Qi-ming, CHEN Tian-min LI ning, SU Yong-ping, RUAN xin-ze

(1.State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Institute of Combined Injury,

2. Hyperbaric oxygen Center Xinqiao Hospital,

Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China)

Abstract: Objective To investigate the isolation，cultivation, differentiation and identification of human umbilical cord blood(HUCB) mesenchymal stem cells(MSCs) in vitro，and to observe the feasibility of using MSCs as seed cells in experimental furthermore．Methods HUCB were collected from full term childbirth scheduled for Cesarean section and vagina deliveries, a11 specimens was obtained sterilely with Preservative-free CPDA-1 compound natrium citricum. After lyse red blood cell, the cord blood mononuclear cell was isolated by human lymphocyte separating medium. culture with dulbecco's modified eagle's medium(DMEM/F12) medium to produce adherent layer and identification with orientation differentiation results. Results The UCB-derived mononuclear cells，when set in culture，gave rise to adherent cells, which exhibited either a fibroblast-1ike but crescent-shaped or bending-shaped morphology or mesenchymal-like phenotype. It can be affirmed as the MSCs which characterized with multi-differentiating potentiality after the myogenic、lipogenic and neurogenic differentiation. Conclusion MSCs in HUCB can be isolated and cultivated in vitro，which could be regarded as an alternative source of MSCs for further experimental tests。

Key words: umbilical cord Blood；mesenchymal stem cells；culture in vitro；differentiation and identification

*通信作者

目前认为，成体干细胞实际上主要是指在不同组织中的间充质干细胞,(MSCs)，它是广泛存在生物体尤其骨髓内的一类干细胞，以前被称为基质干细胞，它最初是由Fnedemteinr 发现的易于贴附于塑料培养板表面的细胞，它可在体外培养条件下大量增殖，又能保持高度末分化状态，具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下可以定向分化为成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞等。因为1.骨髓的来源受到很大限制，2.由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能替代骨髓MSCs，并可弥补其缺陷的间充质干细胞,同时也为了获得足够量的研究需要的种子细胞；因此，我们探讨了从人脐带血中分离、培养具有多向分化潜能的间充质干细胞的方法。

1材料与方法

1.1 主要试剂和仪器：

二氧化碳孵养箱(美国Queue产品Forma 3111型)，超净工作台(苏州净化设备厂

SW-CJ-2FD)，倒置相差显微镜、荧光显微镜(日本Olympus产品)，高速冷冻离心机(Beckman)，超低温冰箱（SANYO日本），BA61型电子天平（Sartorius公司，德国）。DMEM/F12培养基(Gibco BRL公司产品)，胎牛血清(Hyclone)，Percoll梯度分离液(Pharmacia)，人淋巴细胞分离液(1.077 g/ml，天津TBD公司)，牛血清白蛋白、地塞米松磷酸钠、吲哚美辛（Sigma美国）胰蛋白酶（Amersco美国）四环素（上海生工）；免疫组织化学染色试剂盒、骨骼肌肌球蛋白(myosin均为武汉博士德），D-Hank氏液（Hyclone美国），β-甘油磷酸钠、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、5-氮杂胞苷（5-Aza）和胰岛素均系Sigma美国产品。

1.2 主要试剂配制：

红细胞溶解缓冲液：155mM NH4Cl; 10mM KHCO3和0.1mM EDTA. 并进行过滤、消毒。完全培养基为：DMEM/F12培养基加10%胎牛血清，PH值调整为7.2±偏酸性。油红O贮存液：油红O干粉0.5g加入100ml异丙醇中，60℃水浴，玻璃棒搅拌至完全溶解，封口4℃保存。成脂肪诱导培养系统：常规传代细胞培养液＋10－6mol/L地塞米松＋0.5mmol/L IBMX＋10μg /ml胰岛素＋10-5mol/L吲哚美辛，pH7.2。成肌诱导培养系统中5-氮杂胞苷(5-Aza)贮存液：5-Aza分子产品包装250mg即1.024mmol，将其完全溶解于102.4ml DMEM/低糖培养液中，配制成1.0×10-2mmol/L的贮存液，-20℃冻存。成骨诱导培养系统：常规传代细胞培养液＋10－8mol/L地塞米松＋10 mmol/L β-甘油磷酸钠＋50mg/L维生素C，pH7.2。

1.3 脐带血的收集和单个核细胞的分离

无菌条件下取正常足月剖腹产或足月正常产乙肝病毒检测阴性孕妇的脐带血底50

一80ml，放于含CPDA-1复合抗凝剂的采血袋中，4保存，所有样本均在采集后12h内进行分离；将一份脐血溶解于5～10倍的红细胞溶解缓冲液中，室温下孵育5分钟，20℃时，300?g ／mln离心10 min,弃去上清，再用缓冲液洗细胞2次，200?g／mln离心10 min,再弃去上清，沉淀用培养基稀释、混匀，细胞悬液沿管壁缓慢加入含Ficoll—Hypaque人淋巴细胞分离液上层，其相对密度为1．077g/L，进行梯度离心(2000r/min×20min)，然后缓慢吸取中间交界面细胞悬液至另一离心管，获得含hMSCs的单个核细胞悬液，用15ml DMEM/F12培养基洗涤1次(1500 r/min×5min)。加入DMEM/F12完全培养基，吹打计数。48h首次换液，以后每2～3d换液。换液用DMEM/F12完全培养基。

1.4细胞的培养、纯化及扩增

孵箱内培养条件：37℃、5%CO2的空气、饱和湿度；待细胞长至瓶底90%面积时，进行消化传代。依据可贴壁筛选进行纯化，吸出培养液，D-Hank液洗涤2次，加入3ml 0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA，消化3～5min，加入3ml含血清培养液，离心后去上清液，加入DMEM/F12

完全培养基吹打计数；调整细胞浓度，以1×104/cm2的密度接种于75cm2培养瓶，48h后全量换液，以后每3d换液。换液用DMEM/F12完全培养基；待细胞长满至瓶底面积时，重复进行细胞消化、接种的传代培养。

1.5 脐血MSCs的诱导分化与鉴定

成脂分化：将第4代细胞以5×104/ml浓度接种于预置有盖玻片的6孔板中；细胞贴壁后用1μmol/L胰岛素，0.5mmol/LIMBX，100mmol/L吲哚美辛，10mg/L地塞米松诱导3天，置于37℃，5%CO2，饱和湿度孵箱内孵育；吸取培养基，然后改用含10mg/L胰岛素的维持培养基继续培养15天，每周换液2次；吸去培养基，4%多聚甲醛固定，用油红O染色观察脂肪滴的形成；每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化至脂滴出现。成肌分化：将细胞以5×104/ml浓度接种于预置有盖玻片的6孔板中；细胞贴壁后，置37℃，5%CO2，饱和湿度孵箱内孵育，以5-氮杂胞苷3μmol/L 诱导，24小时后换成常规完全培养基，以后每3天换一次液；约2周后，用4%多聚甲醛固定，用ABC免疫组化试剂盒检测骨骼肌肌球蛋白(myosin)的表达；每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化。成骨分化：将培养细胞以5×104/ml浓度接种于预置有盖玻片的6孔培养板中。细胞贴壁后，更换为含成骨添加剂（100nmol/L地塞米松，10mmol/L甘油磷酸钠，50μmol/L维生素C）的新鲜培养基，置37℃，5%CO2，饱和湿度孵箱内孵育，隔日更换成骨诱导培养液；每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化；培养3～4周后，将盖玻片取出进行四环素染色，四环素染色在荧光显微镜下观察。

油红O染色：成脂肪细胞诱导组，成脂肪诱导液诱导15d后，将盖玻片取出；以PBS 洗涤3次，4％多聚甲醛固定20min；取油红O贮存液6ml加入重蒸水2ml，混匀后室温下静置15min，用Whatman滤纸过滤；取出多聚甲醛固定的细胞爬片，0.01 mol/L PBS洗涤2次；再将玻片入过滤后的0.3％异丙醇油红O染液染色10～15min；再用60％酒精分色至背景清晰，自来水轻轻冲洗；玻片再用苏木素淡染胞核，用1％磷酸氢二钠冲洗至变蓝，甘油封片，摄相记录。检测成肌诱导细胞内骨骼肌肌球蛋白(myosin)的表达：采用ABC法，细胞爬片用PBS洗涤3次，每次5min; 4％的多聚甲醛室温固定15min，PBS洗涤3次，每次 5min；用0.1％Triton（以增加细胞膜的通透性）和3％过氧化氢（以消除内源性过氧化物酶的活性）孵育10min；蒸馏水冲洗，PBS漂洗5min；加20％马血清以封闭非特异性结合位点，37℃孵育15min，倾去血清（不洗涤），分别加I抗，置于湿盒中于37℃孵育30min后4℃过夜；阴性对照用0.01mmol/L的PBS代替一抗，实验对照用未诱导的细胞爬片直接进行免疫组织化学染色；PBS冲洗，5min×3次；滴加二抗（兔抗鼠1︰400），37℃孵育30min；PBS冲洗，5min×3次；DAB显色，酒精内梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，普通光镜下观察、照相。四环素荧光标记：成骨诱导细胞组，待培养板中出现圆形或卵圆形结节后，吸取成骨

诱导培养基；加入含0.1mg/ml四环素的成骨诱导培养液37℃培养，30min后更换为成骨诱导培养液，再培养30min；取出盖玻片，以PBS洗涤3次，75％酒精固定30min；将玻片在荧光显微镜下观察，摄相记录。

2结果

2.1 人脐血MSCs分离与体外培养、

本研究中确定了进行人脐血MSCs分离及体外纯化、扩增的方法。即以Ficoll—Hypaque 人淋巴细胞分离液密度梯度离心后。从脐血中分离单个核细胞，将之接种于偏酸性的间充质干细胞培养基（DMEM/F12)中。原代分离的脐血单个核细胞经过6小时的体外培养后仅有极少量细胞贴壁，早期贴壁的细胞形态异质性较大，以梭形和多角形为主，有的细胞甚至接近圆形，细胞体积较大。48—72h后出现较多贴壁的间充质干细胞，并开始可以有集落的形成，细胞呈单层贴壁生长，细胞体积较大，形态主要为梭形、多角形、半月形弯曲状类似成纤维细胞，但细胞稍弯曲，当细胞融合后，部分细胞可增殖形成单层生长的细胞克隆，倒置显微镜下可以见多个细胞克隆，后才逐渐融合在一起。进一步传代培养后，细胞体积进一步增大，形态不规则，成分枝状，细胞胞浆内可见有小颗粒，同时也可见类似破骨样细胞的混杂(图1)，破骨样细胞胞体较大。多个核，圆形。MSCs为成纤维样的长梭形细胞，单个核，有较长的突起，折光性较强：随后在继续本条件培养基的环境下培养，4—5周后细胞生长可以进一步达80％一90％融合。传代后。大部分细胞其它杂细胞(包括破骨样细胞)逐渐被去除。剩下形态较为单一的成纤维样细胞，即为脐血源性的MSCs(图2)。形态上类似于骨髓MSCs，将这些细胞继续进行低密度传代培养后，l一3周左才可以达到逐步融合(图3)。细胞在未融合前未见有集落样生长，此后才开始表现出较强的传代扩增能力，并且细胞传至15代以后部分开始有了明显的衰老征象。。

2.2 人脐血MSCs的诱导分化与鉴定

成肌分化：经5-Aza 诱导后，细胞生长速度明显减缓，诱导9 天后，发现部份细胞体明显增粗，类短杆状，折光性好，12天后，部分细胞呈管状样形态，至14~16天可见有类肌管样细胞出现（附图4）。经免疫组化检测，可见在部分细胞胞浆内有沿细胞长轴分布的纤细的骨骼肌肌球蛋白（myosin）表达

成脂分化：细胞在经过一周诱导后，生长明显减慢，细胞形态开始变得丰满，胞体变大，胞浆丰富，诱导15天左右在细胞核周围的细胞浆内出现一些折光性强的圆形脂肪小滴(附图5、6)，随时间的延长，脂肪滴逐渐增多，并融合成大脂肪滴。油红O染色可见细胞内有红染脂滴，大小不等，部分脂滴发生融合，主要分布在细胞核周围及其附近

成骨分化：细胞在经过诱导后，生长相对减缓，细胞逐渐在10天左右融合，随培养时间延长，细胞呈现聚集生长，其上逐渐出现无定形的折光物质沉集，并逐渐增大，约在三周左右形成明显的圆形或卵圆形钙化结节，四环素荧光标记呈金黄色。

3讨论

目前。对于脐带来源血的MSCs的存在及能否稳定传代扩增，仍有一定的争议；并且在

进行体外培养的过程当中，由于其它杂细胞例如破骨样细胞等的存在，以及本身分泌各种细胞因子的影响，能否得到顺利地取得比较为纯的MSCs，也成为制约从脐血来源获得MSCs的障碍：我们进行实验是为了从脐血进行MSCs的体外分离、纯化、扩增，探索一条更为有效、可行的途径；我们现在的研究结果不仅证实脐带血中存在大量的MSCs，而且可以利用从本实验室配制的条件培养基可得到形态较为均一的脐血间充质干细胞群。

目前，多数使用的种子细胞主要为来源于骨髓的MSCs，但其数量随着标本来源人群年龄的增长而明显下降。脐带血来源的MSCs优势主要在于：1.脐血中含有的丰富干细胞，与人骨髓中数目相当，且更为原始，具有更强的分化能力。2.脐血从分娩后的胎盘、脐带残端收集，其过程比从骨髓或胚胎获取干细胞简单，对于新生儿及产妇没有任何痛苦和不良影响，而易于接受；因此，也不会涉及社会、伦理及法律方向的更多争论。3.脐血受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的机率低。4.脐血包含丰富的间质干细胞，不仅可用于造血系统疾病，也可用于非造血系统疾病的治疗。5.脐血免疫系统的原始性，降低了移植后受体的排斥反应；因此，所收集的脐血不但可以用于异基因移植的供体，而且还可可能进行低温保存数后，用于患者的自体移植治疗相关疾病治疗；即进行自身脐血库的建立。

MSCs主要可以为骨、软骨、肺、脑、肝、心肌细胞等的修复和重建提供种子细胞来源，也可以用于各种损伤后如战伤、创伤、烧伤、复合伤的难愈性伤口的促进愈合的因素之一；虽然目前另一种看法认为：MSCs用于组织修复中的主要作用可能是它的营养，而不是其多向分化的干细胞潜能。但无论如何，获得大量免疫源性低的种子细胞即成体间充质干细胞还是我们要达到的主要目的。

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图1培养早期，图2、3贴壁筛选培养后

图4成肌肉诱导分化组化染色，图5、6成脂肪诱导分化与红油O 染色；图7成骨诱导分化荧光染色图8、9为阴性对照