植物内生菌研究进展及应用
植物内生细菌研究进展
植物内生细菌研究进展 摘要:植物内生细菌是植物微生态系统的重要组成部分，具有广阔的理论研究价值和开发应用前景。本文从植物内生细菌的概念、生物学作用及其应用等方面对近年来植物内生细菌的研究现状进行了综述,并展望其应用前景，以便为进一步研究和应用这类微生物提供信息。 关键词: 植物内生细菌，固氮作用，绿色菌肥 引言: 植物内生细菌系统地分布于植物体内，与植物在长期系统发育共进化过程中建立了一种和谙联合的关系。植物内生细菌有丰 富的种群多样性，对宿主植物具有内生固氮、生物防治以及促 进生长等多种生物学作用，可应用于防治植物病害、植物内生 细菌联合的生物修复以及作为外源基因的载体等具有广泛的 开发和应用价值，已成为国内外研究的热点。在人们日益重视 人与自然和谐相处的今天,研究和利用植物内生细菌对于替代 或减少农药和化肥的使用,改善农业生态系统,保持植物微生 态系统的生物多样性以及维护农田生态平衡实现可持续发展 都有重要意义。 正文: 1.植物内生菌的发展及概念 植物内生细菌名称的由来是经历了几十年的发展才逐渐形成的。1876 年, Pasteur 从无菌葡萄果汁中提取出内生细菌, 内生细菌由
此逐渐引起了人们的关注[1], 传统观念曾认为健康植物体内不含细菌,从健康植物体内分离获得的细菌是由于消毒不严而受污染引起。直至上世纪20～50 年代, 人们陆续从 30 多种健康植物体内分离到多种内生细菌, 植物体内含有细菌的事实才被肯定。1866 年 De Bary 为将植物组织内生活的微生物与植物表面生长的表生菌(Epiphyte)区别开来, 首先提出了内生菌的概念[2]。1992年Kloeooer 首次提出了“植物内生细菌”(endophytic bacteria)的概念[3]。1995年Wilson将植物内生菌的概念概括为: 植物内生菌是指能在整个或部分生活周期中侵染活植物体, 但对植物组织不引起明显症状的微生物, 包括真菌和细菌[4], 1997 年 Hallmann 等又对植物内生细菌的概念进行了补充, 认为植物内生菌可从植物表面或从植物内部获得, 且它们的存在未使植物的表型特征和功能有任何改变[5]。.综上所述,植物内生细菌至今尚无统一的定义.但普遍认可它应具有如下特征:一是能在活体植物内定殖;二是不引起寄主植物组织结构发生明显变化;三是在正常情况下，一般不引起寄主植物出现病害症状.符合这3个特征的微生物基本上属于内生菌的范畴[6]。 2.内生细菌的种类 内生细菌具有丰富的物种多样性。通过对棉花、水稻、玉米、甘蔗、马铃薯、柑橘等50多种农作物以及果树、蔬菜、杂草中的内生细菌进行的研究[7一15]，发现了包括革兰氏阳性和阴性菌共计54个属。各种农作物及果树等经济作物中发现的内生细菌已超过120种,
植物内生菌的研究
植物内生菌的研究 摘要：植物内生菌是植物微生态系统的重要组成部分，在长期的协同进化过程中，与植物形成了互惠互利的关系。植物内生菌能够产生活性物质，可作为生物防治资源、外源基因的载体和新药的来源，在农业、医药卫生领域有着巨大的应用潜力。但是虽然经过几十年的研究，目前植物内生菌的研究仍处于起步阶段，对其开发和应用刚刚展开。 关键词：植物内生菌，发展，应用，问题 植物体内普遍存在着内生菌，由于其生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，因此植物内生菌的存在和作用长期以来未被发现。直到20世纪30年代，由于牲畜食了感染内生真菌的牧草，给畜牧业造成重大损失，才开始对植物内生菌有了初步认识。内生菌一词“endophyte”最早是由德国科学家yDeBerr于1886年提出。1986年，Carrol将植物内生菌定义为生活在地上部分、活的植物组织内不引起明显症状的微生物。1991年，Petrini提出植物内生菌是指生活史的一定阶段生活在活体植物组织内不引起植物明显病害的微生物。1992年，K1eopper等认为植物内生菌是指能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物，并首次提出了“植物理内生细菌”的概念，他认为能在植物体内定殖的致病菌和菌根菌不属于内生菌。 目前，植物内生菌较被公认的定义是指那些在其生活史的一定阶段或者全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或者细菌，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在症状，是一个生态学概念，而非分类学单位。 植物内生菌的研究现状 1. 植物内生菌的生物多样性 植物内生菌的生物多样性主要包括寄主植物种类多样性、内生菌在寄主植物不同部位分布多样性和内生菌自身种类多样性。研究发现植物内生菌广泛存在，地球上300000种植物中都有内生菌的存在。农业上对内生菌研究较多的植物有水稻、小麦、棉花、高粱、牧草、马铃薯、玉米、甘蔗、甜菜、黄瓜、柠檬等。研究发现植物内生菌几乎存在于植物的所有组织中，不仅存在于植物的根、茎、叶、花、果、胚、种子中，在植物的根瘤中也分离到了内生菌。 植物内生菌的种类也十分繁多，主要包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌三大类。目前已报道在各种农作物及经济作物中发现的植物内生细菌已超过129种，分属于54个属，主要为假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、甲基杆菌属(Methylobacterium)等。植物内生真菌主要在药用植物、羊茅属植物、热带树木中研究较多，现在发现的内生真菌主要为子囊菌类(As comycet)及其无性型，包括核菌纲(Pyrenomyetes)、盘菌纲(Discomyetes）和腔菌纲(Loculoascomyetes)等。植物内生放线菌主要在红树林、热带多年生树木及一些药用作物中研究较多，主要为链霉菌属(Streptomyces)、链轮丝菌属(Streptoverticillum)、游动放线菌属(Antinoplanes)、诺氏卡菌属(Nocardia)、小单胞菌属(Micromono sp.ora)。 2. 植物内生菌的动力学研究 植物内生菌的动力学主要指内生菌在植物体内的定殖、分布和运动。内生菌一旦进入植物体内就寻找适合自已生存的组织定殖下来，而不是在各组织间到处扩散。Posada和Vega 认为植物内生细菌主要定殖在细胞间隙。刘忠梅等采用链霉素和利福平抗性标记B946菌株发现B946向茎基部和叶内转移。植物内生菌可以定殖于植物的根毛、叶片、维管组织、木质部的表皮细胞、细胞间隙、细胞质中等。内生菌可以很容易地穿过植物皮层进入木质部导管中，随着植物的生长可以将内生菌运送到植物上部营养器官或繁殖器官中。而有些内生菌定殖在植物种子内，成为“种生内生菌”，成为下一代植物新植株内生菌的重要来源。
植物内生菌
植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和 器官内部的微生物，被感染的宿主植物不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。它不仅包括互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。 1. 内生真菌 从牧草中分离得到的内生真菌香柱菌，所产生的波胺碱和黑麦草碱类物质对昆虫具有杀伤作用，对牲畜等脊椎动物无毒。Strobel等从雷公藤的茎中分离得到一株内生真菌，能产生一种肽类抗生素Cryptocandin，它能抑制灰葡萄孢）等一些植物病原真菌，分离自同一内生真菌的一种新酰胺生物碱cryptocin对稻瘟病菌（及其他多种植物病原真菌有强的抑杀作用。纪丽莲等人从黄海海岸低盐药用植物芦竹中分离得到一株木霉属的内生真菌，它对黄瓜灰霉病菌有较强的抑菌活性。 2. 内生细菌 从辣椒中分离出的一株内生枯草芽孢杆菌，该菌株分泌的抗菌多肽对热稳定，在中性PH范围较稳定，并抗紫外线照射，对植物炭疽病菌和番茄青枯病菌等多种植物病原真菌和细菌有强的抑制作用。 3. 内生放线菌 链霉菌属于放线菌，它占具有生物活性的植物内生放线菌的绝大部分。澳大利亚Coombs研究小组从小麦根部分离的60多株放线菌中筛选到防治小麦全蚀病的菌株，在温室试验中可使小麦全蚀病的危害降低70%。Strobel等在蛇藤中分离到一株新的链霉菌，它能产生4种新的广谱抗生素Munumbicins A、B、C和D，这些抗生素对多种人体和植物致病霉菌、细菌及疟原虫具有广泛的抑杀活性。最近，Strobel等又从一种有叶蕨类植物中分离到一株新内生链霉菌，它能产生一种被称为kakadumycins的新型抗菌素，对炭疽芽孢杆菌和疟原虫均具有抑杀活性，其生物活性比棘霉素强。从卫矛科植物分离的内生链霉菌产生的新chloropyrrol抗生素对多种耐药性细菌和分枝杆菌有抑制活性。从杜鹃花植物中分离的链霉菌产生新的抗真菌物质fistupyrone，对植物病原真菌甘蓝黑斑交链格孢有抑制作用。李萌等从油菜和芹菜的茎和叶中分离得到215株内生菌，18株对蔬菜立枯丝核菌、直啄镰刀菌、苹果黑腐皮壳有很好的拮抗作用，其中有8株为放线菌；从油菜茎中分离出的内生放线菌CHSH19A经鉴定为一株链霉菌Streptomyces sp．，活性筛选结果证明其具有极强的抗立枯丝核菌活性。 植物内生菌是一类次生代谢产物丰富、应用前景广阔的资源微生物。近年来，植物内生菌由于能够产生丰富多样的具有农药活性的次生代谢产物，在自然界中具有重要的生态学作用，引起了人们广泛的关注并取得很大进展。从微生物中寻找发现新型先导化合物，是新农药研制的重要途径。内生菌作为微生物中的重要类群，其物种丰富，数量庞大，这为新农药的研究和开发提供了巨大的资源库。最近一个全面的研究显示，51%的从植物内生菌分离的生物活性物质是以前没有发现的化合物，而从土壤微生物发现的新物质仅为38%。由此
细菌对植物病害生物防治研究进展_许彦君
■ No.5.2011 摘要：细菌作为重要的生防因子在植物病害防治上具有重要作用，文章介绍了生防细菌研究进展，包括细菌作为生防因子的优势、细菌对植物病害的作用机制、生防细菌定殖、生防细菌鉴定、影响生防细菌效果的环境因素、重要的生防细菌假单胞菌和芽孢杆菌应用研究及生防细菌菌剂开发，并对未来生防细菌的遗传改造等生物工程进行了展望。 关键词：细菌；生物防治；假单胞菌；芽孢杆菌；鉴定Abstract:Bacteria plays a important action as biological control factor on plant diseases.Advance in the bacteria biological con ?trol for plant diseases were reviewed in this paper ，with particu ?lar reference to the advantage to control plant diseases,mecha ?nism,colonization,identification,environment factors,applica ?tion of Pseudomonas spp.and Bacillus spp.and development of bacterial agent,with expectation in the future studies on the gene engineering of bacteria.Key words:Bacterial;Biological control;Pseudomonas spp.; Bacillus spp.;Identification 利用生防细菌来防治植物病害成为国内外在生物防治研究中的一个热点。近年来，利用生防细菌或其代谢产物调控寄主植物根际周围益害微生物的平衡从而达到控病保产的目的，这也是防治土传病害的重要途径（郭荣君等，1998）。大量的研究表明，生防细菌不仅在其生长发育过程中产生多种拮抗性或竞争性的代谢产物，通过直接或间接作用，达到阻碍或杀死病原菌的效果，而且 细菌大多对植物具有较好的亲合性，易于定殖（R.Grosch，1999）。 1细菌作为生防因子的优势 生防细菌主要优势有：（1）生防细菌的种类和数量众多，在植物根际和地上部大量存在；（2）生防细菌对病原菌的作用方式较广，可以通过竞争、拮抗和寄生、诱导植物产生抗性等方式对病原菌产生影响；（3）具有惊人的繁殖速度；（4）多数生防细菌可从植物根际和叶部分离得到，接种后易于在植物上定植，生防效果持久稳定；（5）细菌大多可以人工培养，便于控制，在实践中易于操作（程亮等，2003）；（6）其遗传和生化分析简单，容易产生大量的次生代谢物；（7）有些细菌不仅能防治病害而且可以增加作物产量。2生防细菌作用机制 目前认为生防细菌主要是通过对营养和位点的竞争以及产生抗生素的拮抗作用来达到生防效果。主要的作用模式包括：抗生物质的产生；通过产生噬铁素对铁原子的竞争（L.Cindy 等，2002）；对位点和营养的竞争（O.G.G.Knox 等，2000）；诱导植物抗性机制的表达（L.C.Van Loon 等，1998；杨海莲等，2000）；降解病原菌产生的致病物质，如毒素等；分泌细胞壁降解酶，如几丁质酶和?-1,3葡聚糖酶等（J.M.Whipps，2001）。有的拮抗菌株以一种机制为主，有的同时依赖多种机制，但是对不同的病害又可能表现出不同的 收稿日期：2011-10-08*基金项目：黑龙江省“十一五”科技攻关项目（GA06B101-1-5）；黑龙江省“十一五”重点项目（GB06B105） **通讯作者：许艳丽，女，研究员，博士生导师，研究方向为植物线虫病害、作物病虫害生物生态控制。E-mail：xyll@https://www.360docs.net/doc/8913564456.html, 细菌对植物病害生物防治研究进展 * 许彦君1，刘海龙2，刘新晶3，许艳丽4** （1.黑龙江省双城市朝阳乡农业服务中心，黑龙江双城150134；2.黑龙江倍丰农业生产资料集团有限公司，哈尔滨150020； 3.黑龙江生态工程职业学院，哈尔滨 150025；4.中国科学院东北地理与农业生态研究所，哈尔滨150081） 中图分类号：S476+.8 文献标志码：A 文章编号：1674-3547(2011)05-0018-06 病虫防治 18
植物内生真菌的分离
植物内生真菌的分离 一、实验目的 1．理解内生真菌存在的普遍性和多样性 2.掌握常规的微生物分离纯化方法 3.掌握分菌过程中的一些基本操作技能 二、实验原理 植物内生真菌( Ｅnｄophｙte) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，而宿主植物一般不表现出外在的症状。所有植物中几乎都存在内生菌. 由于植物内生真菌与宿主在长期的进化过程中形成了特殊的生态关系,因而内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物越来越成为微生物次生代谢产物的研究热点之一。 采用微生物学常规的组织分离法从植物中分离内生真菌 三、实验材料 板蓝根新鲜健康的叶片 试剂:次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素 培养基：PDA培养基、分离培养基 四、实验步骤 （一)、配制PDA培养基 10月27号晚上：
(1）配置ＰDA培养基,用电子称称取去皮的土豆10０g，煮沸30min，4层纱布过滤，滤液加热,加入琼脂７.5克，琼脂完全融化后加入葡萄糖10g，待稍冷却后加水至5０0毫升。 (2)准备1０瓶无菌水，每瓶150ml左右。 (3)包好烧杯,培养皿，涂布棒等实验仪器，等待消毒。 (二)、配制分离培养基 28号中午： （1）配置分离培养基，将PDA培养液均分成两份，一份备用,另一份待高温灭菌后,加入青霉素１0０mg／L、链霉素200mg/L的混合液20mｌ，即得到分离培养基。 （2）用消毒后的培养皿在通风橱中倒平板,注意在整个过程中保证无菌操作。 (三)、采集新鲜板蓝根叶片 ２8号晚上到实验室外采集新鲜健康叶片完整的板蓝根叶片。(四)、植物组织表面消毒 2８号晚上将新鲜、健康的板蓝根叶片于自来水下冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小段(片）做如下表面消毒处理:75%酒精漂洗3ｍin，无菌水冲洗4~5次,5％次氯酸钠溶液漂洗叶3ｍin,无菌水冲洗4~5次，无菌滤纸吸干水分。 （五）、接种并培养 28号晚上: (1）将上述表面消毒后的材料剪切成0.５ｃm 2 小块,放入含
植物内生细菌3
植物内生细菌3 冯永君① 宋 未② ①博士生,首都师范大学生物系,北京100037 ②研究员,博士生导师,首都师范大学生物系,北京100037 3国家自然科学基金资助项目(批准号:39770023) 关键词 植物内生细菌 植物微生态学 内共生固氮 植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内,并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物,有生物防治、植物促生和内共生固氮作用.在农业生产过程中,由于农药和化肥的大量使用以及农田耕作的单一化,使植物和土壤中微生物的多样性大为减少.在人们日益重视人与自然和谐相处的今天,研究和利用植物内生细菌对于替代或减少农药和化肥的使用,改善农业生态系统,保持植物微生态系统的生物多样性以及维护农田生态平衡实现可持续发展都有重要意义. 一、引 言 植物内生细菌名称的由来是经历了几十年的发展才逐渐形成的.起初,人们对健康植物组织中存活的微生物并未引起重视,但后来越来越多的微生物(特别是细菌)从植物的根、茎、叶、穗中分离出来,人们才意识到这些从植物中分离的微生物可能与植物存在某种相互关系.随着对这类微生物研究的不断深入,1992年克洛珀[1]第一次提出了“植物内生细菌”(endophytic bacteria)的概念.植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内,并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物.内生细菌在植物体内的定殖是一个主动过程,定殖细胞必须是活的和能增殖的;定殖后的内生细菌不会对植物造成实质性的危害症状[2]. 虽然植物内生细菌概念提出的时间尚短,然而这一概念一经提出就立刻引起了微生物学家、植物学家和微生态学家以及作物学家的广泛关注.首先,这是因为内生细菌概念的提出完全打破了人们对植物组织的传统认识:传统的观念一直认为健康的植物组织内是无菌的.虽然在1992年克洛珀提出内生细菌的概念之前的几十年的发展时间里,已从植物组织内越来越多地分离了许多微生物,但人们还是认为这是一些潜在的植物病原菌,因而始终未引起广泛关注和高度重视.克洛珀总结了前人的工作将这些“内生细菌”作为一个概念提出后,才使人们意识到不得不抛弃以前的所谓“潜在的植物致病菌”的片面性见解,重新面对这个新鲜事物.因而可以说植物内生细菌概念的提出是植物微生物学学科发展的一次革命.内生细菌的研究已成为植物微生态学和微生物学学科交叉的新的生长点. 其次,人们不禁要问,为什么植物体内要含有这些细菌呢?它们的行为是怎样的,有何应用价值?一些初步的研究已经证实,内生细菌在植物体内不仅积极地生存着,而且还能产生多种生物学作用,如固氮作用,促进植物生长作用和对病虫害的防治作用等[3].这些研究结果的公布立即让生态学家和作物学家兴奋起来.人们注意到植物-内生细菌这种和谐共生,互利共栖的生命形式,可能是未来生态型农业发展的一条重要思路.所以,开展植物内生细菌的研究不仅对植物微生物学科的基础研究有重要的理论价值,而且对农业可持续发展也有重要的实践意义. 二、植物内生细菌和植物之间的关系 目前关于植物内生细菌和植物之间的关系的认识上,主要有两种观点.一种是传统的观点,认为植物内生细菌是潜在的植物致病菌.研究者从植物病理学的角度着手,研究重心是单个微生物及其致病性,目的在于分离内生细菌,鉴定致病性,阻止其进入周围环境.通过这方面的研究发现,多数植物内生细菌有潜在的植物致病性,它们在侵染健康植物时,不表现实质性的致病症状,但当无病症的健康植物偶然受到来源于生物的或非生物的胁迫条件的威胁,以及受到突然恶劣的环境变化的冲击而造成植物自身的防御功能严重削弱时,一部分内
内生真菌研究进展
植物内生真菌研究进展 植物内生真菌（Endophytic fungus）是指在生活史中某一阶段或整个阶段存在于健康植物组织内部，对植物组织没有引起明显病症或对宿主没有造成明显伤害的真菌。内生真菌在植物组织中普遍存在，具有丰富的物种多样性。它是生活在植物组织内的一类微生物, 是植物微生态系统中的天然组成成分，且长期生活在植物体内的特殊环境中, 与寄主协同进化, 根据内共生理论, 内生真菌可能产生与宿主相同或相似的具有生物活性的次生代谢产物。1898年，Vogl等人从黑麦草Lolium temulentum L. 种子内分离出第一株内生真菌，引起了人们对植物内生真菌的注意。特别是美国学者从短叶红豆杉Taxus brevifolia的韧皮部分离到一株产抗癌物质紫杉醇的内生真菌，更是掀起了各国学者对内生真菌的研究热潮。 1 植物内生真菌的研究方向 内生真菌活性成分的筛选有两条思路。一是根据部分内生真菌具有合成和宿主植物相同或相似活性成分的能力这一特点，从药用植物中寻找具有合成确定化合物的内生真菌，常用方法是对分离得到的内生真菌培养液提取物通过色谱技术、单克隆抗体免疫检测等手段来确定该内生菌是否有产生目的化合物的能力。这一思路目标明确、针对性强、工作量相对较小，是目前从内生真菌中筛选活性物质的主要方法，采用这种方法已从多种资源缺乏的药用植物的内生菌中分离得到了和宿主植物相同或相似的活性物质。这种思路具有一定的偶然性，因为不能证实所有的植物中都存活着具有合成和宿主植物相同或相似活性物质的内生真菌。二是按照传统的化合物分离纯化鉴定的思路，寻找未知但具有特定活性的化合物。首先是按照目的选择不同的筛选模型进行活性菌株的筛选。其次是对筛选出的活性菌株发酵培养、分离纯化活性物质，再对活性物质进行理化研究及结构鉴定。 2 内生真菌药用活性物质及其生物学作用 2.1 抗肿瘤活性物质 2.1.1萜类化合物 紫杉醇是存在于各种紫杉属植物树皮和树叶中的萜类化合物, 被当今世界上认为是广谱、活性最强的抗癌药物。由于紫杉属植物中紫杉醇含量极低，加之紫杉属植物生长极其缓慢，自然资源非常缺乏。1993 年美国学者Stierle 等首次从短叶紫杉( Taxus brevifolia) 的韧皮部中分离出一种新的内生真菌( Taxomyces an2dreanae)，可在半合成培养液中产生紫杉醇和紫杉烷类化合物。这一发现为用微生物发酵法生产紫杉醇以解决紫杉醇药源危机提供了一条新途径，并成为从药用植物中分离内生菌热潮的开端。2006年, 田仁鹏等从生长在
植物内生菌研究进展
植物内生菌研究进展 李能章,彭远义 3 (西南农业大学动物科技学院,重庆400716) 摘要:就近年来在环境因子对内生菌的影响,代谢物质的多样性,基因工程在植物内生菌方面的应用,宿主-内生菌-内生菌间的关系等方面的研究作一简要综述。 关键词:植物内生菌;环境因子;代谢物质;基因工程;相互关系 中图分类号:Q935,Q945117 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2004)02-0069-03 收稿日期:2003-06-27;修回日期:2003-09-30 作者简介:李能章(1975-),男,硕士生,专业方向:分子微生物学;3联系人:彭远义(1965-),男,博士,硕士生导师。 植物内生菌的研究起始于19世纪中叶,De Bary (1886)首先提出植物内生菌一词“endophyte ”,在其后的几十年中,先后在几种牧草植物中发现了内生真菌,对植物内生菌并没有进行更深入的研究,直到1977年Bacon 等人发现高羊茅内生真菌与牛的中毒症状相关后,才引起广泛关注,在其后的十几年时间,侧重于草本植物内生菌研究,特别是对感染内生菌的牧草对草食动物的影响以及对食叶虫的影响方面研究。20世纪90年代以后,在植物内生菌方面的研究范围扩大了,不仅仅局限于牧草植物内生菌的研究,也从其他不同植物中分离内生菌,研究其生物多样性,生物学作用,侵染途径以及与宿主之间的关系等,特别是1993年S trobel 首次报道了从短叶紫杉(Taxus brevifo 2lia )的树皮中分离出一株内生真菌(Taxomyces andreanae )能产生紫杉醇(tax ol )[1],对植物内生菌又有了更深的了解,掀起了从植物内生菌中寻找新物质的热潮,一些新的抗肿瘤、抗菌、抗虫物质先后从内生菌中分离出来,在研究植物内生菌的过程中引入了现代分子生物技术,从而使对内生菌的研究进入了分子水平。植物内生菌来源于外界环境微生物,以不同方式进入植物组织中,通过水平和垂直方式进行传播,其遗传与代谢都由于与宿主在长期共同进化过程中相互作用而有别于外界环境微生物。几乎所有的植物中都有生活的内生菌,现仅仅对极少数植物内生菌进行了完全的研究,因此从植物内生菌中寻找到新物质几率是很大的,并且植物内生菌本身作为新的微生物资源也具有广泛的研究价值。 1 环境因子对植物内生菌的影响 植物内生菌生活在活体植物组织中,其生长代谢受多方面因素制约,不仅受到宿主植物的影响,外界环境因子也是其重要影响因素,外界环境变化影响植物生长代谢,间接影响到内生菌生物多样性与生长代谢。1.1 对其生物多样性的影响:自然环境因素如季节温度变化、光照、雨水、空气湿度等都会影响到植物内生菌的多样性,M o 2 cali S (2003)等[2] 人调查研究两株榆树不同季节内生菌的动态变化,以4、6、9、12月作为调查时间,通过植物器官和植物的纤维蛋白酶的变化参数,揭示了其内生菌的波动变化是受温度(冷热)的影响。环境污染物质同样会影响植物内生菌的生物多样性,Danti R (2002)[3]在研究植物Fagus sylvatia L 的枝梢暴露于S DBS 浮质中其内生真菌的多样性和数量的变化时,发现枝梢中内生真菌的多样性和数量随其暴露时间的延长而减少,S DBS 作为一种人工合成的阴离子去垢剂,可能是被S DBS 处理的植物其叶的蜡质层被降解,同化能力和叶片水分蒸腾作用的变化导致内生菌的减少,这是环境作用于植物而影响其内生菌的多样性,还有一些化学物质并不影响植物的生长代谢,但却直接影响内生菌的数量和多样性,如一些人工合成的杀虫剂、杀菌剂。现今工业污染物不仅对动物植物造成极大的伤害,同时也对植物内生菌资源造成极大的破坏,一种植物的灭绝就意味着大量的内生菌的消失。1.2 对内生菌生长代谢的影响:环境因子影响植物内生菌的多样性的同时影响着内生菌的生长代谢,Maccheroni Jr W (1998)等[4]研究了植物内生菌刺盘孢霉在营养缺陷时其磷酸酶的合成与分泌状况,研究表明,pH5.0酸性磷酸酶和Mg 2+-depen 2dent pH7.5磷酸二酯酶在任何生长状况下都恒量表达,在磷饥饿时,pH6.0酸性磷酸酶表达分泌胞外,而碱性磷酸酶的表达为另一独特模式,在磷丰富或氮饥饿时,表达pH 10.0胞内碱性磷 酸酶,但在又缺氧或硫源时,其表达就会被阻。T ejera NA (2003)[5]等调查了一些非生命因素如干燥、热、盐等对内生菌G luconacetobacter diazotrophicus 的生长和生物学活性影响,结果表明,这株菌可以忍耐热处理和耐盐,但其固氮酶活性和碳代谢酶类活性会受到高NaCl 浓度的影响。环境除对内生菌酶的产生极其活性的影响之外,还影响着内生菌的次生代谢,如降低对感染内生真菌的高酥油草和多年生黑麦草的收割次数和增加其牧草的高度会使内生真菌生物碱代谢增加(Salminen S O ,et al .2002,2003)[6] 。 2 代谢物质的多样性 植物内生菌的生物多样性决定其代谢物质的多样性。现有研究表明,从植物中分离出的内生菌能代谢多种活性物质,其中一些是新物质,具有特殊生物活性。2.1 抗癌类物质:从某些植物中分离出的某些内生菌能代谢具有抗肿瘤活性的物质,美国的S trobel (1993)等首次从短叶紫杉(Taxus brevifolia )的树皮中分离出能产生紫杉醇(tax ol )的内生真菌(Taxomyces andreanae ),其后,其他学者又从其它植物中分离到内生菌能产生不同作用机理的抗癌新物质。2.1.1 引起癌细胞凋亡类物质:从植物Pinus species 的针叶活组织中分离出的内生真菌Hormonema dematioides 产生一种新的真菌物质horm onmate (1),能诱导结肠癌细胞系C O LO -320程序化细胞死亡,同时对结肠癌细胞系D LD -1和HT -29和五种其它的人的癌细胞系H L -60、JURK AT 、HEP -G 2、MCF -7、HeLaS 2 都有毒作用(Filip P ,et al ,2003)[7] 。2.1.2 破坏癌细胞微丝物质:从植物Ficus Microcarpa L 的树皮中分离到的内生真菌产生一种新的生物碱nom ofungin ,能破坏哺乳动物细胞的微纤丝(Ratnayaka As ,et al ,2001)[8]。2.1.3 癌细胞分裂抑素:Wagenaar M M (2000)等[9]从来源于传统药用植物雷公藤的内生真菌Rhinocladiella sp.的培养液中分离出3种新的生物碱(cytochalasins ),是具有细胞毒作用的细胞分裂抑素,实验结果表明它们对多种人肿瘤细胞有很强的抑制作用。2.1.4 酶抑制剂:从内生菌中分离的物质具有抑制引起细胞产生癌变的病毒的酶的活性,从而起到防止癌症,G uo B (2000)等人[10]就从内生菌Cytonama sp.的固态发酵中分离出两种新的人细胞巨化病毒蛋白酶抑制剂cytonic acidA (1)和B (2)。 2.1.5其它类抗癌物质:S tierle DB (1999,2003)等[11] 从北美红杉中分离的内生真菌寄生曲霉(Aspergillus parasiticus )产生系列抗肿瘤活性物质sequoiatone A -F 和另一类新的C 架系列物质se 2 quoiam onascinsA -D 。Wagenaar M M (2001)等[12] 从濒临灭绝的薄荷Dicerandra frutescens 中分离出的内生菌Phomopsis longicolla 产生3种新的具有抗肿瘤活性的二聚物dicerandrolsA 、B 和C 。 Brady SF (2000)等[13] 从一种内生真菌中分离出二种新物质cy 2toskyrinsA 和B ,破坏DNA 和抑制DNA 合成,具有在抗癌方面应用的潜力。张玲琪等分别从植物长春花(Catharanthus roseus )、桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum )等植物中分离到产抗癌药物长春新碱和鬼臼毒素类似物的内生菌,从美登木叶中分离到1株球毛壳菌,从该菌的发酵产物中提取出抗癌活性物质球毛壳甲素A 。 从以上可以看出,植物内生菌代谢多种抗肿瘤物质,它为寻找新的抗肿瘤物质提供了新的微生物资源,具有广阔应用前景。2.2 产生抗菌类物质:作为产生抗菌类物质的微生物,植物内生菌是一大类群,能产生多种具有不同抗菌活性的物质,对植物、人和动物病原菌有抑制活性。产生抗植物病原菌物质的内生菌由于产生的抗生素类物质存在于植物体内,所以更有利于 第14卷第2期:692004年4月 生 物 技 术BI OTECH NO LOGY V ol 114,N o 12:69 Apr 12004
(完整word版)植物内生菌DNA提取方法
在提取植物内生菌之前，植物需要表面灭菌，其具体操作为将植物浸泡在添加了0.02%的Tween-20的质量分数为1%的次氯酸钠溶液中1 min，再将植物浸泡在70%酒精中1 min，然后用硫代硫酸盐/Ringer’s（林格氏液）清洗3次，每.次1 min。根和茎（土表面以上1 cm处）都要灭菌处理，将根茎切成片状。为了更好地分析细菌的位置，灭菌后茎表皮撕下，茎内部按照之前的方法灭菌。表皮组织和根最后一次淋洗液中的细胞都用来提取DNA。 植物不同组织的内生菌群落DNA提取通过直接研磨植物组织，步骤为溶解、提取和纯化步骤（方案一），或者在DNA提取前从片状植物组织中淋洗出细胞（方案二）。 东南景天表面灭菌方法：整株植物用自来水冲洗30 min，用蒸馏水洗3次，每次3 min。用吸水纸吸去植物表面水分，用无菌剪刀在根基部将根系剪下，与植物地上部分开。将根系用70 %酒精浸泡2 min，无菌水洗3次，3 % NaClO浸泡2次，每次1 min，然后用无菌水冲洗3次，每次2 min，最后一次清洗液涂LB平板。 1. 将2 g左右消毒后植物组织于无菌研钵中，加5 mL磷酸钠缓冲液（19.9 g Na2HPO4·H2O，1.27 g NaH2PO4·2H2O，H2O 定容到1 L）研磨至匀浆。 2. 将植物匀浆转移至50 mL无菌离心管中，摇床200 rpm振荡1-2 h，使细菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来。 3. 取4 mL悬液于新的无菌离心管中，12 000×g离心10 min收集菌体细胞。 4. 弃上清，将收集的菌体细胞重新溶于550μL 1×TE buffer（Tris-EDTA；pH8）中加入10 mg mL-1溶菌酶10μL，37℃水浴1-4h。 5. 加入50μL 20% SDS和8μL 20 mg mL-1蛋白酶K，混匀，65℃水浴3h，期间轻轻上下颠倒混匀数次。 6. 加入200μL 5 M NaCl，涡旋振荡15 s，12000×g离心10 min。 7．取上清液，并向上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），彻底混匀，12000×g离心10 min。 8. 上清液转移至新的无菌离心管中，重复步骤7一次。 9. 上清液转移至新的无菌离心管中，加入0.6倍体积（0.6 vol）的冰冷的异丙醇，4℃放置1 h。 10. 4℃，12000×g离心10 min，弃上清。 11. 沉淀用70 %冰乙醇清洗，离心，弃上清。 12. DNA沉淀室温风干后，用无菌超纯水溶解。 13. DNA纯化采用TIANquick Midi Purification Kit。
药用植物内生真菌研究现状及其应用前景
药用植物内生真菌研究现状及其应用前景 发表时间：2018-11-07T14:26:43.093Z 来源：《中国误诊学杂志》2018年第26期作者：代娇朱卫波代雨通讯作者 [导读] 简要综述了近年来在内生真菌的分离鉴定、发酵、次生代谢产物、与宿主的关系等方面的研究进展。 曲靖医学高等专科学校云南曲靖 655000 摘要：随着对药用植物内生真菌研究的深入，从药用植物内生真菌中寻找新的生物活性成分已成为研究热点。内生真菌对药用植物的生长及活性成分的形成都有影响，内生真菌活性成分已成为发现新颖结构化合物及新药物的潜在资源。简要综述了近年来在内生真菌的分离鉴定、发酵、次生代谢产物、与宿主的关系等方面的研究进展。 关键词：内生真菌；分离鉴定；发酵；代谢产物；药用价值 1 药用植物内生真菌研究现状 内生真菌（endophytic fungi）是指生活在健康植物的各种组织和器官内部的真菌，被感染的植物不表现明显的外在病症，可通过组织学方法、从严格表面消毒的植物组织中分离的方法，以及从植物组织内直接扩增微生物 DNA 的方法来证明其内生性。内生真菌不但可以自身合成药物活性成分，还具有促进宿主植物合成活性成分的能力[1]。药用植物内生真菌代谢产物的多样性和新颖性，将为利用其进行工业发酵，生产新型活性化合物开辟新的途径。 2 药用植物内生真菌的多样性 内生真菌的分离培养是菌株鉴定及其活性物质研究的基础。由于环境的改变，内生真菌的生长及次生代谢产物的数量、种类等都会受到影响[2]。通过形态学观察和繁琐的生理生化实验，以及分子生物学鉴定方法进行分类鉴定。 3 内生真菌的次生代谢产物及生物活性 3.1抗肿瘤活性物质 某些抗肿瘤药用植物中部分内生真菌能够产生与宿主相同或相似的生理活性成分，已有不少学者从具有抗肿瘤作用的药用植物中寻找能产生抗肿瘤成分的内生真菌，并从中发现了一些具有潜在应用前景的抗肿瘤化合物。1993 年 Stierle 等[11]首次从短叶红豆杉（Taxus brevifolio）的韧皮部分离到一株能产紫杉醇的内生真菌，随后许多学者从不同种红豆杉中也分离得到产紫杉醇的内生真菌。除紫杉醇外，人们还研究了可以产其他抗肿瘤活性物质的内生真菌，陆续从长春花（Catharanthus roseus）、桃儿七（Sinopodophyllum hexandrum Ying）、美登木（Maytenus hookeri）等药用植物中分离出了能产生抗肿瘤活性物质的内生真菌菌株。这为药用植物内真菌发酵生产抗肿瘤药物奠定了基础。 3.2抗生素类活性物质 药用植物内生真菌可产多种抗生素，能抑制病原体、细菌、真菌、病毒等。李雅等发现，杜仲内生真菌对植物病原真菌有抑制作用。Castillo 等从蛇藤（Kennedia nigriscans）中分离到一株能抑制多种致病霉菌的内生真菌。Thongchai 等从 Zingiber officinale Rosc 中分离到的内生真菌能够产生明显的抑菌活性，并得到了具有该抑菌活性的单体化合物[3]。 3.3其他活性物质 研究发现内生真菌还能产生其他活性物质，如降血糖活性物质、免疫抑制剂、抗氧化剂等。Salituro 等从非洲热带雨林植物的内生真菌 Pseudomassaria sp.中分离到一种非肽类代谢物，可使人的胰岛素受体酪氨酸 β- 亚基磷酸化，并使胰岛素受体的作用底物也磷酸化，从而激活蛋白激酶 B，具有模拟胰岛素的作用，能明显降低血糖浓度。周生亮发现4株薯蓣（Dioscorea zingiberensis）菌丝和发酵液具有不同的抗氧化活性。 4 内生真菌与宿主的相关性 4.1药用植物内生真菌与宿主的相互关系 内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，植物以其内生真菌的组织、细胞及其代谢产物为内环境；而内生真菌则以宿主植物的组织、细胞及其代谢产物为外环境，吸收宿主植物的营养，并得到保护。内生真菌能够参与植物活性成分的合成，或通过诱导物胁迫宿主植物产生丰富的次生代谢产物，是天然活性产物的重要来源。内生真菌在体外培养时可产生植物生长激素，内生真菌可促进宿主植物对氮、磷等营养元素的吸收，内生真菌也可通过与病原菌竞争营养和空间或直接产生拮抗物质而抑制病原菌，从而促进植物生长。此外，内生真菌还能增强宿主植物的抗逆性[4]。 4.2内生真菌产生与宿主相同或相似成分机制的探索 药用植物内生真菌是一个多样性十分丰富的生物类群，其产生的次级代谢产物也十分丰富，很多实例证明内生真菌能够产生与宿主相同或相似的代谢产物。目前，解释内生真菌能产生与宿主相同或相似成分机制的理论主要有二：一是生物间的“基因水平传递”，即认为具有相同次级代谢产物生物合成的途径，是获得了相关基因的直接传递；另一个是“内共生理论”，认为在共生体生物相互作用过程中，一旦在其次级代谢中出现了有用生化的途径，它就能被其他生物所利用，表现出相互作用和“协同进化”。 5 内生真菌在药用植物发育中的应用 一些内生真菌与植物的生长、发育、抗病性有关，深入研究可能对药用植物的人工种植有重要作用。由于内生真菌对植物的促进生长作用，可将相应内生真菌接种于生长缓慢、自然繁殖困难、濒危的药用植物中，促进其生长，提高药用植物产量。开唇兰小菇、石斛小菇、兰小菇等 3 种小菇属植物的内生真菌对兰科濒危药用植物铁皮石斛、金线莲的生长具有促进作用，对铁皮石斛和金线莲的成功栽培具有实际应用价值。一些珍稀名贵中药的形成也与其体内的内生真菌有关。沉香、降香等名贵药材的形成也与内生真菌有关。由此可见，将植物内生真菌接种于与微生物关系密切的中药，可以提高中药有效成分含量和产量，克服传统中药有效成分含量低的问题和资源不足的限制。 6 内生真菌研究开发新药的前景与展望 近年来化学合成药物所带来的毒副作用使人们望而却步，人类对天然药物的需求愈来愈大。目前超过40%的临床药物是天然产物或是
植物内生菌作用
植物内生菌的作用 摘要植物内生菌近年来已成为微生物学领域研究的热点，其潜在的可开发利用价值越来越深受重视，尤其在对植物内生菌对宿主的作用关系方面已出现许多相关的成功报道。根据研究和掌握的资料就植物内生菌的作用作出初步评述和前景展望，希望能对内生菌的进一步开发探究提供参考。 关键词植物内生菌；对宿主作用；开发利用 植物内生细菌指其生活史的一定阶段生活在活体植物组织内、又不引起植物明显病害的 微生物[1] ，广泛分布于低等植物和高等植物中，常见的有假单胞菌属（Pseudomonas）、芽 孢杆菌属（Bacillus）、微杆菌属（Microbacterium）以及土壤杆菌属(Agrobacterium)等[2]。 虽然内生细菌的概念自从1886年Bary提出至今已有百余年的时间，然而在这期间并没引起相应的重视，研究进展缓慢，直到上世纪末期终于受到微生物学家、植物学家和微生态学家以及作物学家的广泛关注，成为植物微生物学学科发展的一次革命，目前内生细菌的研究已成为植物微生态学和微生物学学科交叉的新的生长点[3]，也是我国当前微生物研究领域的热点[4] ，当前植物内生菌的研究无论从深度还是广度上都有很大进展，特别是关于植物内生细菌的作用研究上更是日新月异，近年来，一些研究结果表明内生细菌能够作为外源基因的载体，又具有促进植物生长，抗逆境，抗病害，增加宿主植物的他感作用[5]以及对病虫害的防治作用等[6]。 1植物内生菌的作用 1.1促进宿主植物生长 感染内生菌的植物一般具有比未感染植株生长快速的特点，人工接种某些内生菌还能提高植物的存活率，促进发芽[1]，已有相关报道内生菌的这种促植物生长作用可从两方面来理解:一方面，许多内生菌可产生生长素(IAA) 、细胞激动素等植物生长激素，从黄花篙中分离到的一株内生真菌在发酵液中也能积累IAA。另一方面，内生菌可增进宿主植物对氮、磷等营养元素的吸收，禾本科农作物如水稻、甘蔗、玉米上的内生细菌具有很强的固氮能力。感染内生真菌的牧草对氮、磷的摄取能力也有所提高[7]。1991年Mcinroy等从玉米、棉花上分离到具有促进植物生长作用的内生细菌[8]。 1.2增加宿主植物的他感作用 他感作用（alleloparthy）的概念是德国学者H．Molisch于1937年提出的，他认为植物的他感作用就是一种植物通过向体外分泌代谢过程中的化学物质，对其他植物产
药用植物内生真菌研究现状及其应用前景
药用植物内生真菌研究现状及其应用前景 摘要：随着对药用植物内生真菌研究的深入，从药用植物内生真菌中寻找新的 生物活性成分已成为研究热点。内生真菌对药用植物的生长及活性成分的形成都 有影响，内生真菌活性成分已成为发现新颖结构化合物及新药物的潜在资源。简 要综述了近年来在内生真菌的分离鉴定、发酵、次生代谢产物、与宿主的关系等 方面的研究进展。 关键词：内生真菌；分离鉴定；发酵；代谢产物；药用价值 1 药用植物内生真菌研究现状 内生真菌（endophytic fungi）是指生活在健康植物的各种组织和器官内部的 真菌，被感染的植物不表现明显的外在病症，可通过组织学方法、从严格表面消 毒的植物组织中分离的方法，以及从植物组织内直接扩增微生物 DNA 的方法来证 明其内生性。内生真菌不但可以自身合成药物活性成分，还具有促进宿主植物合 成活性成分的能力[1]。药用植物内生真菌代谢产物的多样性和新颖性，将为利用 其进行工业发酵，生产新型活性化合物开辟新的途径。 2 药用植物内生真菌的多样性 内生真菌的分离培养是菌株鉴定及其活性物质研究的基础。由于环境的改变，内生真菌的生长及次生代谢产物的数量、种类等都会受到影响[2]。通过形态学观 察和繁琐的生理生化实验，以及分子生物学鉴定方法进行分类鉴定。 3 内生真菌的次生代谢产物及生物活性 3.1抗肿瘤活性物质 某些抗肿瘤药用植物中部分内生真菌能够产生与宿主相同或相似的生理活性 成分，已有不少学者从具有抗肿瘤作用的药用植物中寻找能产生抗肿瘤成分的内 生真菌，并从中发现了一些具有潜在应用前景的抗肿瘤化合物。1993 年 Stierle 等[11]首次从短叶红豆杉（Taxus brevifolio）的韧皮部分离到一株能产紫杉醇的内生 真菌，随后许多学者从不同种红豆杉中也分离得到产紫杉醇的内生真菌。除紫杉 醇外，人们还研究了可以产其他抗肿瘤活性物质的内生真菌，陆续从长春花（Catharanthus roseus）、桃儿七（Sinopodophyllum hexandrum Ying）、美登木（Maytenus hookeri）等药用植物中分离出了能产生抗肿瘤活性物质的内生真菌菌株。这为药用植物内真菌发酵生产抗肿瘤药物奠定了基础。 3.2抗生素类活性物质 药用植物内生真菌可产多种抗生素，能抑制病原体、细菌、真菌、病毒等。 李雅等发现，杜仲内生真菌对植物病原真菌有抑制作用。Castillo 等从蛇藤（Kennedia nigriscans）中分离到一株能抑制多种致病霉菌的内生真菌。Thongchai 等从 Zingiber officinale Rosc 中分离到的内生真菌能够产生明显的抑菌活性，并得 到了具有该抑菌活性的单体化合物[3]。 3.3其他活性物质 研究发现内生真菌还能产生其他活性物质，如降血糖活性物质、免疫抑制剂、抗氧化剂等。Salituro 等从非洲热带雨林植物的内生真菌 Pseudomassaria sp.中分 离到一种非肽类代谢物，可使人的胰岛素受体酪氨酸β- 亚基磷酸化，并使胰岛素 受体的作用底物也磷酸化，从而激活蛋白激酶 B，具有模拟胰岛素的作用，能明 显降低血糖浓度。周生亮发现4株薯蓣（Dioscorea zingiberensis）菌丝和发酵液