植物生理学--兰花种子萌发因素 wk

兰花种子萌发影响的因素综述

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2011

兰科（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）是被子植物中第一大科，全世界分布约２５０００种，它不仅在植物学上具有重要价值，作为一种重要的观赏植物资源，在园林植物及观赏园艺的发展中也占据十分重要的地位。兰科植物在受保护的濒危植物中占很大比例，在《野生动植物濒危物种国际贸易公约》中，我国被列为重点保护的植物约为１３００种，而兰科植物则占了１２００余种。此外，所有我国分布的野生兰科植物均被列进“国家重点保护野生植物名录”（ｈｔｔｐ：／／ｖ２ ｃｖｈ ｏｒｇ ｃｎ／ｂａｏｈｕ／Ｌｉｓｔ ａｓｐ）。兰科植物在自然状态下的授粉、萌发等概率都比较低，并且大多数兰科植物在从种子萌发到长出绿叶之前，都需要特殊种类的细菌与之共生，为其提供生长和发育所需要的营养。但自然森林和林下荫庇等兰科植物的原生环境一再遭到人为的破坏，更加加重了兰科植物资源的流失和生物资源灾难的程度。因此，无论出于生物多样性保护，还是育种和科研等方面的需要，兰科植物种质资源保存都刻不容缓。

兰花种子在一个果实内有1300-4000000粒，胚仅是未分化的细胞群，不具有发芽时供营养用的胚乳，因此，不像其他种子那样容易发芽。从20世纪前半期兰花栽培兴盛时期开始，经营兰化栽培与研究工作者们就十分关心兰花种子发芽问题。到20世纪末，证实了兰花自然实生苗的根部存在根菌，由此考虑到其根菌与种子发芽的关系。上世纪初期，法国Bernard和德国Burgeff从根部分离出兰花种子与菌共生而发芽的真菌，研究了所为共生发芽（Symbiotic germination）。由于用人工方法进行发芽需要专门的技术，能否取得成功并获得较高的发芽率虽存在一些问题，但已为兰花种子在人工条件下发芽开辟了一条途径。

美国康奈尔大学Knudson对这一研究很感兴趣，开始探讨其发芽的机理。采用无机盐、糖、琼脂、水等组成的人工培养基，使兰花种子发芽获得了成功。从这一试验结果尅推论：真菌的作用一方面在于使兰花种子能利用蔗糖、淀粉等

物质；另一方面是供给生长促进物质。Bernard的意见则认为侵入的菌体在胚内

使淀粉糖化，提高了渗透压的物理化学刺激作用而引起了发芽，因此主张兰花种子的发芽必须有真菌的存在。Knudson的研究虽然以探索种子发芽的机理为目的，但是所用的实验方法及获得的结果，也包含了实际应用的意义。从而由Knudson 开创了不借助真菌的发芽，及无菌发芽（non-symbiotic or asymbiotic germination）的方法。这一具有实用价值的研究进展，被经营兰花栽培者所采用，对兰花品种的改良与扩大栽培做出了很大贡献。此后，许多研究者继续对无机盐的种类与组合、糖的浓度与种类、维生素、植物激素和天然物质等添加物，以及PH的影响进行了许多研究。现在，合成培养基在国外市场上已有销售。

兰属（Cymbidium）植物种子的萌发，已经积累了许多材料，但是兰属植物中的一些地生兰的种子不易人工使之萌发，一般将这类种子称为难萌发的种子。为了杂交育种以及大量繁殖兰花，应了解各种地生兰与附生兰种子萌发是所需要的外界条件及它们的差异，加速种子的萌发过程和提高它们的萌发率。

Knudson1922年发现可以将兰花种子用无菌发芽法获得幼苗，但兰花栽培产生了极大的作用。Morel1960年应用组织培养技术将兰花茎尖分生组织诱导形成原球茎并分化成为植株，导致了兰花栽培技术变革，建立了兰花工业。我国的兰花幽香清远，一支在室，满屋飘香，在国际市场享有一定声誉，但目前仍采用传统的分株繁殖，速度极慢。王熊等人曾进行兰花快速无性繁殖系的研究，提高了兰花繁殖速度，并观察到兰花在试管中开花的现象。但由于对兰花生在发育规律了解尚不够清楚。

1.磁场处理对紫苏种子萌发的影响

磁生物学在农业上应用广泛，磁场处理对种子萌发的促进或抑制是生物磁学效应中最主要、最基本的宏观表现之一。目前，中国已用磁场对水稻、小麦、大豆、玉米、番茄、绿豆、花生、水萝卜、莴笋、西兰花、棉花等农作物种子进行过试验，均证实了磁场对农作物种子的萌发有良好的促进作用。张玲慧等人2013年通过试验研究了磁场对紫苏种子发芽的影响，从磁场强度的选择、处理时间以及紫苏种子干湿两种处理方法进行了比较，结果发现20.9 mT磁场强度处理紫苏干种子，发芽率以处理3 h 为最高，可以达到57% ，低于或高于3 h 种子的发芽率明显下降，处理紫苏湿种子与处理干种子的发芽率有相似的表现效应，种子

萌发率最大值也出现在3 h，表现出“低—高—低”的响应趋势，因激素和种子处理对种子萌发的影响保存条件对种子萌发的影响此，在选择磁处理的最佳条件时必须注意筛选合适的磁处理时间；另外，所有湿种子处理后的发芽率都比干种子直接进行磁场处理有显著提高，发芽率最高可达89% 。在42.5 mT磁场强度处理下，1~5 h 内种子发芽率都达到90%以上，远远高于对照的34%。

在磁场促进植物生长方面也进行了诸多研究，有关报道表明恒定磁场0.2 T 处理玉米种子可显著地促进根系的生长，株高、茎粗、茎叶鲜重及叶面积均与对照有显著差异，并提高了作物产量。祝建等研究发现，适当电磁场强度对洋葱根尖细胞的分裂能力有着促进作用，有利于根的伸长。本试验研究了42.5 mT的磁场强度处理紫苏种子对株高、根长和须根数的影响，可能与磁场改变了根细胞膜离子透性有关，有必要对其原理进行更深入的研究。

2.激素和种子处理对种子萌发的影响

采用合适的培养基是蝴蝶兰种子萌发的关键,KC、MS、V &W、KYO TO等多种基本培养基都可使种子萌发,但萌发所需的时间、萌发率及小苗长势不同。杨美纯等研究发现MS培养基最适合蝴蝶兰种子萌发,王慧俞等认为KC为最适宜培养基,曾宋君等以花宝一号、花宝二号为主要成分自制成G3 培养基的播种效果优于1/ 2MS、MS和KC等培养基。不同的蝴蝶兰品种对培养基的要求不同,我们在改良KC培养基上附加适量蛋白胨和香蕉汁,对多种蝴蝶兰品种进行胚培养取得良好效果,但对一些小花、多花品种却基本无效。

蝴蝶兰种子在基本培养基上也可萌发,但附加适当比例的激素或其他有机无机附加物可显著促进萌发。曾宋君等研究认为低浓度6 - BA利于蝴蝶兰种胚萌发,6 - BA 浓度超过1 mg/ L时则有抑制作用;低浓度NAA( < 1 . 0 mg/ L)可促进已萌发的蝴蝶兰原球茎生长,但对胚萌发的作用不明显;蝴蝶兰种子萌发的激素浓度配比以6 - BA 0 . 2 mg/ L + NAA 015mg/ L为佳。杨美纯等以MS为基本培养基并附加不同浓度的6 - BA进行诱导蝴蝶兰种子萌发试验,结果发现6 - BA浓度在1～5 mg/ L范围时其萌发率均在70 %以上,其中在MS + 6 - BA 3 mg/ L +

NAA0105 mg/ L 培养基上的萌发率高达100 %。我们以KC为基本培养基附加15 %香蕉汁和各种激素配比,发现低浓度的GA3 和KT对诱导蝴蝶兰种子萌发有

促进作用,但效果不如6 - BA ,而不同浓度的NAA和2 ,4 - D对蝴蝶兰种子萌发都有抑制作用,且浓度越高抑制越明显。研究还表明,培养基中添加适量的椰子汁、蛋白胨、香蕉汁、番茄汁、苹果汁等营养物质,对蝴蝶兰种子萌发和生长都有明显的促进作用;添加适量活性炭可防止褐变,对幼苗成长有利,但对种子萌发无明显影响。

有关研究表明,一般在不加激素的播种培养基上蝴蝶兰种苗会自动生根,但添加椰汁、香蕉汁、活性炭等对生根有明显促进作用,而添加激素对生根影响极大。据试验,添加较高浓度6 - BA( > 1 . 0 mg/ L)对生根有明显抑制作用,低浓度6 - BA( < 0 . 5 mg/ L)对生根有一定促进作用,而NAA对生根有明显促进作用,蝴蝶兰无根实生苗在KC + 10 %香蕉汁+ 0 . 2 %白糖+ 6 - BA 0 . 2 mg/ L + NAA 3 mg/ L 培养基上培养生根较好。此外, 研究表明加入M E T(多效唑) 115mg/ L可抑制小苗根、茎、叶的伸长,增加根数和根粗,使叶片变厚变短变绿、植株健壮、移栽成活率高。其中,将适龄生根苗置于室温下开盖炼苗1周,然后洗去根部培养基,用低浓度KMnO4 或多菌灵浸泡后进行移栽,其栽培基质以水苔为佳。蝴蝶兰的种子极小,采用无菌播种方法进行快繁具有操作简单、繁殖速度快等优点,至今仍是蝴蝶兰种苗繁殖的一个重要方式。但因无菌播种方法为有性繁殖,其获得的植株与母株基因型不同,分离现象严重,有可能出现大量劣质种苗而造成损失,所以在选择母本进行杂交时应特别注意,尽量了解亲本的遗传规律,增加无菌播种后代性状的预见性,减少市场风险。

3.保存条件对种子萌发的影响

兰花种子或圆球茎超低温保存技术的操作程序为：（１）选择发育时期适合的圆球茎或成熟度适合的种子为超低温保存材料；（２）对保存材料进行预处理，通过物理或化学的方式降低细胞内含水量，使材料达到适于超低温条件下保存的状态；（３）放入液氮中进行超低温保存；（４）从液氮中取出材料，放入３６～４０℃水浴中解冻；（５）材料解冻后，进行活力检测，观察恢复生长后保存材料的再生能力、形态特征和遗传性状等的变化。依据冷冻降温的具体手段、是否进行预处理以及预处理方法的不同，兰花圆球茎及种子超低温保存主要方法可分为干燥法（ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎｏｒａｉｒ ｄｒｙｉｎｇｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔ

ｉｏｎ）、速冻法（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）和玻璃化法（ｖｉｔｒｉｆｉ ｃａｔｉｏｎｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）。

控制脱水速度与脱水程度，通过干燥预处理增强细胞抗冻性。干燥法的关键在于确定兰花植物种子超低温保存的最佳含水量，不同种类的兰科植物最佳含水量不同。干燥法已成功保存部分兰科植物种子或圆球茎。ＨＩＲＡＮＯ等含水量５％的鹤顶兰种子保存６个月后存活率较高。刘福平、陈丽璇研究表明蝴蝶兰圆球茎脱水前用水浸泡和慢速脱水（５２％相对湿度脱水５ｄ）成活率较好。林伟强等试验证明含水量大于或等于１.０ｇ／ｇ（ＤＷ）样品冻后不能存活，含水

量为0.１ｇ／ｇ（ＤＷ）样品冻后存活率显著高于０.５ｇ／ｇ（ＤＭ）的样品，铁皮石斛圆球茎超低温保存最适含水量为０.１～０.５ｇ／ｇ（ＤＷ）之间。

将材料从０℃或预处理温度直接投入液氮，其降温速度在１０００℃／ｍｉｎ以上。使细胞内水分子在冷冻过程中尚未形成冰晶就降到－１９６℃的安全温度，避免细胞内结冰的危险。ＨＩＲＡＮＯ等快冻法成功保存白芨授粉后２，３，４个月的种子，含水量分别为８４％，５７％，３３％，冻后存活率分别为０％，９％，２３％。ＨＩＲＡＮＯ等认为不同成熟时期种子细胞中液泡体积不同为冻后存活率差异的主要原因。ＭＡＮＮＩＮＧ和ＶＡＮＳＴＡ ＤＥＮ，ＹＥＵＮＧ和ＬＡＷ证明兰花种子胚发育过程中，液泡随成熟期接近而慢慢消失。何明高等用快冻法成功保存束花石斛种子，冻后萌发率约为６５％。

保存材料添加冰冻保护剂后快速投入液氮。由于细胞内冰晶未形成，玻璃化法保存使器官和组织各部分都进入了相同的玻璃化态，因此被一些研究者认为是目前最有效的超低温保存方法。尤其对于不能通过干燥法而成功保存的兰花种子，玻璃化法是一种尤为有效的保存方式。ＨＩＲＡＮＯ等将授粉后２，３，４个月白芨种子，用玻璃化法保存３个月后，存活率分别为４４％，８２％和７２％。陈勇研究表明玻璃化法保护剂明显提高铁皮石斛圆球茎冻后存活率，存活率为８８％。何明高等采用玻璃化法成功保存束花石斛种子，冻后存活率为８０％。王君晖等发现铁皮石斛圆球茎最佳玻璃化脱水时间为１５ｍｉｎ，冻后存活率高达８８％。ＳＵＲＥＮＥＩＳＫＩ等通过玻璃化法成功保存Ｃｙｒｔｏｐｏｄｉｕｍｈａｔｓｃｈｂａｃｈｉｉ授粉后１２０ｄ种子，冻后存活率为６４％。超低

温保存后的材料，首先要通过解冻处理，才能进行恢复生长。目前所采取的水浴快速解冻方式适用于兰花圆球茎和种子。经超低温保存的材料，当其细胞处于－５０～－１０℃时，细胞内水分极易再次结冰伤害，快速解冻方式有利于细胞渡过这一危险的温度范围。玻璃化法保存材料，冻后需进行洗涤，以除去冷冻保护剂（例如ＤＭＳＯ），减少冷冻保护剂的毒害作用，以免影响超低温保存后材料的活力检测结果。常用洗涤方法为：“ＭＳ＋１ ２ｍｏｌ／Ｌ蔗糖”培养基，２５℃下洗涤１０ｍｉｎ。

通过检测超低温保存后种子或圆球茎活力判定材料超低温保存效果。兰花圆球茎及种子的活力检测方法主要有ＴＴＣ染色法和恢复培养法两种。ＴＴＣ检测法，即先用质量浓度５％的次氯酸钙溶液浸泡种子３０ｍｉｎ，而后用蒸馏水清洗３次，再在质量浓度为１％的２，３，５－一氯化三苯基四氮唑溶液，在３０℃黑暗条件下染色２４ｈ，随后在显微镜下观察。其中，胚被染成红色的为具有活力的圆球茎或种子，不染色或者染色很浅的为没有活力的圆球茎或种子，一般重复３个视野。恢复培养法，即将冻后材料在超净工作台里接种于恢复培养基上，黑暗培养３ｄ后，改为光照培养，能正常生长和增殖的，记作恢复率计算。