噬菌体展示技术解析
噬菌体展示技术解析
噬菌体展示技术经过近20年的发展和完善，已被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。噬菌体展示系统模拟了自然免疫系统，使我们有可能模拟体内抗体生成过程，构建高亲和力抗体库。由于噬菌体展示技术实现了基因型和表型的有效转换，使研究者在基因分子克隆基础上实现了蛋白质构象体外控制，从而为获取具有良好生物学活性的表达产物提供了强有力手段。另外，噬菌体展示技术已成为不经过免疫获取特异性人源抗体的新途径，为获取对人类和动物疾病有诊断和治疗价值的单克隆抗体提供了重要手段。
应用面这么高大上，那么原理到底是什么呢？那接下来将由小编为您揭开其神秘的面纱！
一、噬菌体展示技术的原理
噬菌体展示技术（phage display）是将多肽或蛋白质的编码基因插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。展示到噬菌体表面的多肽或蛋白保持相对独立的空间结构和生物活性，可以与靶分子结合和识别。噬菌体展示的肽库或蛋白库与固相抗原结合，洗去未结合的噬菌体，然后用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。下图粗略展示了技术筛选的过程：
二、噬菌体展示系统的分类
1.M13噬菌体展示系统
M13噬菌体属于单链环状DNA病毒，其基因组为6.4kb，编码10种蛋白，其中5种为结构蛋白，包括主要衣壳蛋白的PⅧ和次要衣壳的pⅢ、pⅥ、PⅦ和PⅨ。其中，pⅢ和PⅧ是噬菌体展示中最常用的两种蛋白，构建了pⅢ和PⅧ展示系统。pⅢ蛋白分子量为42 kDa，
分布在噬菌体颗粒的一端。一般一个噬菌体有3-5个拷贝的pⅢ蛋白，可在N端的柔性连接区插入外源蛋白或者多肽。pⅢ系统的主要优点是对展示的外源蛋白大小无严格的要求，该系统可以用来展示分子量较大的蛋白。PⅧ蛋白的分子量为5.2 kDa，主要分布在噬菌体颗粒的两侧。由于该蛋白的分子量很小，只适合用来展示外源短肽。外源肽段的太大会影响病毒包装，不能形成有功能的噬菌体。但由于pⅢ蛋白拷贝数较多，该系统比较适合用来筛选低亲和力的配体。
2.λ噬菌体展示系统
λ噬菌体是长尾噬菌体科的一种温和噬菌体，有直径55nm的二十面体头部，末端有细长尾丝。基因组为48.5kb的线性双链DNA分子，有黏性末端即单链延伸12个核苷酸，感染后线性基因组可立即环化。噬菌体的头部由D蛋白和V蛋白构成，可以构建D蛋白和V 蛋白的展示系统。λ噬菌体是在宿主细胞内完成装配的，无需将外源肽或蛋白分泌到细菌胞膜外，可展示有活性的大分子蛋白质(100 kDa以上蛋白质)及宿主细胞有毒性的蛋白质，适用范围极广。
3. T4噬菌体展示系统
T4 噬菌体基因组DNA 为双链线形，呈环状排列，噬菌体衣壳的有两种非必需外壳蛋白：SOC(small outer capsid protein)和HOC(highly antigenic outer capsid protein)。T4 噬菌体表面展示是将外源多肽或蛋白质分别与SOC位点的C末端和HOC 位点的N末端融合而展示于T4 噬菌体表面。T4噬菌体的主要优点是可以实现SOC位点和HOC位点同时展示，展示的拷贝数也较多。
4. T7噬菌体展示系统
T7 噬菌体基因组为线性双链DNA，其衣壳蛋白通常有两种形式，即10A(344个氨基酸残基)和10B(397个氨基酸残基)，10B衣壳蛋白区存在于噬菌体表面，所以被用来构建噬菌体展示系统。T7噬菌体展示系统可以高拷贝展示50个氨基酸的多肽，以低拷贝量(0.1-1/噬菌体)或以中拷贝量(5-15/噬菌体)展示1200个氨基酸残基的多肽或蛋白质。因此，广泛应用于筛选不同分子量，不同亲和力的蛋白质。
三、噬菌体展示技术的应用
1. 抗体筛选
将抗体可变区的基因插入噬菌体基因组中，表达的抗体展示到噬菌体的表面，构建噬菌体展示抗体库，可以在体外模拟抗体生成的过程，筛选针对任何抗原的抗体。相对于杂交瘤技术，通过噬菌体展示抗体库技术筛选抗体，可以不经过免疫，缩短抗体生产的周期。也可以筛选在体内免疫原性弱，或者有毒性的抗原的抗体，适用范围广。噬菌体展示抗体库技术不受种属的限制，可以构建各种物种的抗体库。从人天然库中筛选到的抗体，可以不经过人源化过程，直接用于抗体药物研究。
2. 新受体和配体的发现
将随机多肽序列展示到噬菌体的表面，获得噬菌体展示多肽库。用细胞作为筛选靶标，经过差异筛选，获得出识别特定细胞的多肽。通过研究该多肽序列，可以进一步得到细胞表面特异性表达的受体蛋白。用HCT116细胞筛选12肽库，从库中筛选出了可以特异性行识别结肠癌细胞的多肽。进一步分析分析发现，该多肽可以特异性识别a-enolase。该蛋白有望作为结肠癌治疗的靶标，筛选结肠癌治疗药物。获得的多肽序列，也可以作为抗癌药物的运送载体。
3. 蛋白质相互作用研究
蛋白质的相互作用是生命过程中所不可缺少的，噬菌体展示的多肽文库是由特定长度的随机短肽序列组成。用靶蛋白质(如受体)对该随机文库进行亲和淘选，就可以获得与之结合的短肽序列。对所得序列测序分析，并合成相应的短肽，从而可以来研究两个蛋白质之间的相互作用。利用这种方法已经成功鉴定出多个重要大分子，如生长激素受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体和TNF-a 受体的激动剂和颉颃剂等。
4. 抗原表位分析
用抗体作为筛选的蛋白，从噬菌体展示的随机多肽库中，筛选出可以与抗体特异性结合的噬菌体，经测序分析，获得该抗体识别的抗原表位。该技术为抗原抗体反应机制研究，诊断试剂开发，疫苗制备等提供依据。
目前的表位鉴定技术能够实现：
①单抗药物及诊断用单抗的制备；
②研制包括“通用”目标在内的治疗性和预防性重组多价肽疫苗；
③研制单表位或重组多表位肽检测抗原；
④筛选基于表位基序的疾病、肿瘤等新的特异诊断标志物；
⑤高通量发现同源蛋白中全部保守性和特异性表位；
⑥筛选功能性抗体表位或者抗体中和性及可及性表位；
⑦为表位水平分析病毒遗传进化和变异，提供抗原漂移和转移的直接证据。
5. 抗体人源化改造
单抗人源化比例不断升高，单抗的药物靶位逐渐多样化，除了传统的细胞表面抗原，还包括了常见的细胞因子，部分研制中的单抗药物甚至可以识别多个抗原表位，而且单抗药物的结构也不限于完整的单抗分子。联合小分子等的治疗方案逐渐增加，日益受到医疗工作者的重视。因此，作为一种高科技含量的药物，单抗药物企业的科技水平决定了其竞争力，也决定了药物的治疗效果和市场价值。
6. 双特异性抗体（BsAb）制备
通过基因工程手段将两个分别靶向不同抗原的抗体片段组合在一起，具有两种抗原结合位点，可以发挥协同作用，进而提高治疗效果。但是双特异性抗体的种类较多，选择时根据最终的应用来做判断。
7. 酶抑制剂筛选
β- 酮脂酰-ACP 还原酶是原核生物脂肪酸生物合成代谢中高度保守和广泛存在的酶，用此蛋白为筛选的靶蛋白，从噬菌体肽库中筛选出了该酶的抑制剂，可以作为新型的抗菌剂。已针对乙酰胆碱酯酶、海藻糖酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰CoA 羧化酶和谷氨酰胺合成酶等靶标酶，开发和研制了一系列高效的杀虫剂和除草剂。
8. 蛋白质的定向改造
蛋白质的定向改造是指用盒式突变、错误倾向PCR等方法来突变蛋白质或者结构域的某一特定编码序列，产生蛋白质或结构域的突变文库呈现在噬菌体表面，通过亲和筛选获得所需的已定向改变的噬菌体克隆，他们的一级结构可以从DNA的序列中推导出来，可用来筛选具有更强受体结合能力的细胞因子、新的酶抑制剂、转录因子的DNA结合新位点、新的细胞因子拮抗剂、新型酶和增强生物学活性的蛋白质等。
三、金开瑞噬菌体展示定制服务类型
1. 天然/免疫抗体库构建（人、小鼠、兔、羊驼等）
2. 抗原表位鉴定
3. 蛋白质相互作用研究
4. 抗体筛选
5. 抗体人源化
6. 抗体亲和力成熟
7. 重组抗体改造
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噬菌体展示总结技术
噬菌体展示总结技术 各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢篇一：噬菌体展示技术 噬菌体展示技术 关键词：噬菌体展示组装融合蛋白2008-07-21 00:00 来源：互联网点击次数：3662 噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。本文主要概述了噬菌体展示技术的基本原理、噬菌体展示系统研究以及技术特点等，并跟踪了目前该领域的最新研究进展和发展前景。 关键词：噬菌体展示；组装；融和
蛋白 1985年，Smith G P[1]第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。 另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。近年来，随着噬菌体展示技术的日益完善，该技术在众多基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显。 一、噬菌体展示技术的原理 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳
蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。思想汇报专题被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集 [2]。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。 二、噬菌体展示系统 单链丝状噬菌体展示系统 （1）PⅢ展示系统。 丝状噬菌体是单链DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个～5个拷贝
噬菌体展示技术操作步骤
筛选多肽 试剂及配制 （1）LB培养基： 胰蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 5g 溶于去离子水，至1L，高压灭菌，4℃保存。 （2）IPTG/Xgal： 称取1.25g IPTG，1.0g Xgal，溶于二甲基甲酰胺，至总体积25ml，-20℃避光保存。（3）LB/IPTG/Xgal平板： 1L LB培养基+15g琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃以下，加入1ml IPTG/Xgal，立即铺板，4℃避光保存。 （4）顶层琼脂糖凝胶： 胰蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 5g MgCl2.6H2O 1g 琼脂糖7g 溶于适量去离子水中，至总体积为1L。高压灭菌，分装为50ml/份，室温保存，使用时于微波炉内融化。 （5）2×M9盐： Na2HPO412g KH2PO46g NaCl 1g NH4Cl 2g 溶于适量去离子水中，至终体积为1L。 （6）小型平板： 500ml 2×M9盐 500ml 3%琼脂粉 20ml 20%葡萄糖 2ml 1M MgSO4 0.1ml 1M CaCl2 1ml 硫胺素（10mg/ml） 在混合之前，将上述成分分别高压灭菌并冷却至70℃以下，葡萄糖和硫胺素采用过滤除菌。平板储存于4℃。 （7）封闭缓冲液： 0.1M NaHCO3(PH 8.6) 5mg/ml BSA 0.02% NaN3 过滤除菌，储存于4℃。 （8）TBS： 50mM Tris-HCl (PH 7.5) 150mM NaCl
高压灭菌，室温储存。 （9）PEG/NaCl： 20%（w/v）聚乙二醇-8000 2.5M NaCl 高压灭菌，室温储存。 （10）碘化物缓冲液： 10mM Tris-HCl (PH 8.0) 1mM EDTA 4M NaI 室温避光保存。 操作步骤： 1．第一天 （1）以0.1M NaHCO3(PH 8.6)制备 100μg/ml的靶分子溶液。如果需要稳定靶分子，可以用含有金属离子的相似离子强度缓冲液。 （2）在每孔内加入1.5ml 靶分子溶液，重复涡旋直至表面完全湿润（这一步要多注意，尽量避免溶液形成液珠）。 （3）在湿盒中，4℃温和振荡孵育过夜。4℃保存于湿盒中备用。 2．第二天 （4）将ER2537（滴度测定时用来铺板的细菌培养物）接种至10ml LB培养基中。如果是在同一天扩增洗脱的噬菌体，也可以将ER2537过夜培养物接种于含有20ml LB培养基的250ml锥形瓶中（比例为1：100）。37℃剧烈振摇。 （5）将平皿反扣在洁净的纸巾上，去除包被液，加满封闭液，4℃孵育至少1h。 （6）去除包被液。用TBST（TBS+0.1%Tween-20）快速洗涤6次。反复旋转确保孔底及孔侧面都被洗涤。按照步骤5的方法去除洗涤液（也可利用自动洗板机洗涤）。洗涤要迅速，避免平皿干燥。（注意每次更换纸巾，以避免交叉污染）。 （7）用1ml TBST稀释4×1010噬菌体（10μl原库），加至包被后的平皿内，室温下轻缓摇动10-60min。 （8）以步骤5的方法去除未结合的噬菌体。 （9）以步骤6的方法用TBST洗涤板子10次，每次换用洁净的纸巾，避免交叉污染。 （10）用1ml的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。洗脱液可以是含有配体（0.1-1mM）的TBS，或是含有靶蛋白（100μg/ml）的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白竞争结合噬菌体。室温下轻缓摇动10-60min。将洗脱液转入微量离心管中。 （10a）或使用通用缓冲液，0.2M甘氨酸-盐酸（PH2.2），1mg/ml BSA。轻缓摇动不超过10min，将洗脱液转入微量离心管中，以150μl 1M Tris-HCl(PH 9.1)中和。 （11）取小量洗脱液（1μl）测定滴度，如果有必要，可将第一轮或第二轮测定滴度的噬斑进行测序（见后续操作）。（未用的洗脱物可4℃保存过夜，第二天进行扩增。在这种情况下，用LB过夜培养ER2537，第二天，用LB培养基以1：100将该培养物稀释至20ml，加入未扩增的洗脱液，在250ml的锥形瓶内，37℃剧烈振摇孵育4.5h，进入步骤13）。 （12）将剩余的洗脱物进行扩增：将洗脱物加入20ml ER2537培养物中（对数早期），37℃剧烈振摇孵育4.5h。 （13）将培养物转入微量离心管中，4℃，10000转离心10min，将上清转入新的离心管中，再次离心。 （14）将80%的上清转入新的离心管中，加入1/6体积的PEG/ NaCl。4℃沉淀噬菌体至
噬菌体展示技术的原理及应用
噬菌体展示技术的原理及应用 将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合（插入信号肽与衣壳蛋白基因间）后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，每个噬菌体只含1个外源基因，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性，展示在噬菌体的表面。导入了各种各样外源基因的一群噬菌体，就构成一个展示各种各样外源肽的噬菌体展示库。 当用一个蛋白质去筛查一个噬菌体展示库（展示文库为流动相，被筛蛋白为固定相）时，就会选择性地同与其有相互作用的某个外源肽相结合，从而分离出展示库里的某个特定的噬菌体，研究该噬菌体所含外源基因的生物学功能。 技术发展 噬菌体展示优越性 1、将蛋白与其遗传信息之间提供了直接的物理联系，可有效的对所需功能的克隆进行反复筛选并扩增。 2、被展示多肽或蛋白结构功能与天然状态接近，可简便快速筛选得到与靶分子高亲和力的被展示物。 3、筛选过程中，特定的噬菌体克隆由于对其配体的特意亲和性而不断的得到富集，从而使相对稀少的可以结合配体的克隆能够快速、有效地从一个大文库中被筛选出来。 4、与其它技术相比，容易对库容量较大的文库进行筛选。
噬菌体展示局限性： 1、肽库容量受大肠杆菌转化效率影响，容量一般在109，高于此限制的较多基因将难以表达； 2、编码多肽的基因带有一定的密码子偏爱性，限制了肽库的复杂度； 3、噬菌体宿主大肠杆菌的生物合成系统有自身的限制因素，如缺乏氨基酸修饰、蛋白糖基化、不能合成D型氨基酸。 4、在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就限制了所建库的分子多样性。 5、不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。 应用范围 肿瘤研究及药物靶向治疗 诊断用疫苗研发 酶抑制剂筛选 构建抗体/cDNA文库 研究蛋白质与核酸相互作用的生物学过程 研究新型的基因导向系统 Eg1：从HBx（肝癌相关抗原）单抗细胞中克隆重链可变区基因，重组入M13噬菌体，验证表达产物具有活性，然后表达出单链抗体、单域抗体或嵌合抗体，为肝癌导向治疗研究提供基础。 Eg2：为解决非典型嗜血流感杆菌毒力因子表面蛋白混合寡糖LOS制备疫苗遇到的免疫原型弱的问题，用兔抗LOS筛选肽库，得到4个一致性序列，其中3个与兔抗亲和力高。用筛选得到的3个高亲和力肽免疫兔得到的抗体对染病小鼠模型具有抗体保护性作用。
噬菌体展示技术解析
噬菌体展示技术解析 噬菌体展示技术经过近20年的发展和完善，已被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。噬菌体展示系统模拟了自然免疫系统，使我们有可能模拟体内抗体生成过程，构建高亲和力抗体库。由于噬菌体展示技术实现了基因型和表型的有效转换，使研究者在基因分子克隆基础上实现了蛋白质构象体外控制，从而为获取具有良好生物学活性的表达产物提供了强有力手段。另外，噬菌体展示技术已成为不经过免疫获取特异性人源抗体的新途径，为获取对人类和动物疾病有诊断和治疗价值的单克隆抗体提供了重要手段。 应用面这么高大上，那么原理到底是什么呢？那接下来将由小编为您揭开其神秘的面纱！ 一、噬菌体展示技术的原理 噬菌体展示技术（phage display）是将多肽或蛋白质的编码基因插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。展示到噬菌体表面的多肽或蛋白保持相对独立的空间结构和生物活性，可以与靶分子结合和识别。噬菌体展示的肽库或蛋白库与固相抗原结合，洗去未结合的噬菌体，然后用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。下图粗略展示了技术筛选的过程： 二、噬菌体展示系统的分类 1.M13噬菌体展示系统 M13噬菌体属于单链环状DNA病毒，其基因组为6.4 kb，编码10种蛋白，其中5种为结构蛋白，包括主要衣壳蛋白的PⅧ和次要衣壳的pⅢ、pⅥ、PⅦ和PⅨ。其中，p