等温滴定量热仪(ITC)

等温滴定量热法

等温滴定量热法(ITC)的简易操作流程： ①样品的准备，包括滴定物与被滴定物(如DNA滴定蛋白质)。 a.实验前的蛋白质样品需用缓冲溶液透析(注意透析袋的正确使 用)，透析时间一般为24小时，buffer体积为1L，且中途注意更换buffer，其目的是为了减少由于溶液组成不同而产生的滴 定误差； b.样品的浓度要求，一般要求的浓度为微摩尔级，且滴定物(DNA) 的浓度是被滴定物(蛋白质)的十倍左右为宜，且实验前需要再 次确认所配样品的浓度是否符合要求； c.在进行滴定实验前，用于空白对照的缓冲液，蛋白样品以及 DNA均需抽真空除气泡(15Mins左右为宜)。 ②仪器的清洗。 a.在进行真空除气泡前，除气泡用容器均需用超纯水清洗三次左 右，且清洗完毕后擦干内壁，防止由于残留缓冲液的稀释而导致样品浓度的改变； b.样品池(sample cell)的清洗，用超纯水清洗15次左右(每次2ml 左右)，清洗完毕后，一定要将残留的超纯水吸干净； c.注射器(syringe)的清洗，用超纯水清洗3次以上(专用注射器清 洗,此时无需点击open,close和purge选项)，清洗完毕后将注射器的头部擦干，之后清洗装DNA的小试管，步骤同注射器的 清洗。 ③设置空白对照试验（DNA滴定缓冲液），将缓冲液置于小试管中(为 了防止空气的进入，一般添加样品的量大于其实际所需的量)，打开控制界面，点击open之后，用手动注射器缓慢拉动活塞，此时注射器管中的液面上升，然后点击close, 注射器会自动将小试管中的缓冲液吸入注射器中，当缓冲液完全吸入注射器之后点击pump键，除去气泡；在清洗样品池的同时就设置所需的实验温度（套管温度，一般较反应温度稍低），并输入样品的实际浓度以及实验数据文件名和储存路径等一系列参数（如注射时间，注射次数，注射间隔时间）。

等温滴定量热法应用

Example 2：Isothermal Titration Calorimetry for AIDS Drug Development 艾滋病药物的等温滴定量热法 人们付出了大量努力，试图利用药物帮助艾滋病受害者减少艾滋病流行所造成病毒感染。热力学通过热力学解释实验热-滴定数据为此作出了贡献。如图2-1所示，在艾滋病毒感染人体细胞后，产生一系列艾滋病毒的复制步骤。受感染的细胞表达蛋白和蛋白酶；蛋白酶的作用在于蛋白酶切割聚蛋白，裂解的蛋白重新组装得到一个新的艾滋病病毒。 图2-1 HIV蛋白酶在病毒复制过程中合成新的病毒 为了防止形成新的病毒，可通过引入药物使使HIV蛋白酶失活。这种药物叫做蛋白酶抑制剂，可阻止多聚蛋白的分裂，如图2 – 2所示。 图２-２通过一直HIV蛋白酶从而组织新病毒的生成 蛋白酶和抑制剂的关系可以用传统的锁钥机制描述，如图2 – 3所示。抑制剂必须有正确的形状才能进入艾滋病毒蛋白酶的活性位点，其中，抑制剂是“钥匙”，必须保证适合蛋白酶这把“锁”。

然而，因为突变，艾滋病毒蛋白酶的活性位点可以以不同的形式存在，如图2 - 3所示；原株的活性位（锁）用“十”字表示，突变株活性位点（锁）用六边形表示。我们需要寻找一种同时适合这两种形状的“锁”的药物（钥匙），不仅可以和原株蛋白酶的活性位点结合也与突变株蛋白酶的活性位点结合。热力学可以帮助识别最佳候选药物。 图２-３传统“锁-匙”机制 图2-4列出两种候选药物1和2。药物2比1具有更好的适应性，同药物1相比的，它具有不对称的功能；甲苯基团的称性比叔丁基弱。此外，药物2更灵活，因为它有两个可旋转的键，而药物1只有一个。不对称和灵活性为药物提供了额外的构象，可以适应一个艾滋病毒突变位点。 图２-４两种候选药物１和２ 为定量衡量药物的效果，Ｏhtaka和Freire利用等温滴定量热（ITC）的热力学分析数据得到所需结果。 用A表示艾滋病毒蛋白酶，B表示抑制剂（药品）。我们定义一个解离常数Kd和它的倒数，缔合常数Ka，下标d表示分离，ａ表示缔合。 其中，[]代表在水溶液中物质的浓度。对于好的药物,我们希望Kd很小或者Ka很大。在A + B ----AB的反应中，A(蛋白酶)和B(抑制剂)的结合由标准焓和标准熵决定。上o标表示标准状态。

等温滴定量热法的实验操作

Video Article Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity Michael R. Duff,1, Jordan Grubbs1, Elizabeth E. Howell1 1Department of Biochemistry, Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee Correspondence to: Elizabeth E. Howell at lzh@https://www.360docs.net/doc/8c3728253.html, URL: https://www.360docs.net/doc/8c3728253.html,/video/2796 DOI: doi:10.3791/2796 Keywords: Molecular Biology, Issue 55, Isothermal titration calorimetry, thermodynamics, binding affinity, enthalpy, entropy, free energy Date Published: 9/7/2011 Citation: Duff,, M.R., Grubbs, J., Howell, E.E. Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity. J. Vis. Exp. (55), e2796, doi:10.3791/2796 (2011). Abstract Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction. In biological sciences, macromolecular interactions are essential in understanding the machinery of the cell. Experimental conditions, such as buffer and temperature, can be tailored to the particular binding system being studied. However, careful planning is needed since certain ligand and macromolecule concentration ranges are necessary to obtain useful data. Concentrations of the macromolecule and ligand need to be accurately determined for reliable results. Care also needs to be taken when preparing the samples as impurities can significantly affect the experiment. When ITC experiments, along with controls, are performed properly, useful binding information, such as the stoichiometry, affinity and enthalpy, are obtained. By running additional experiments under different buffer or temperature conditions, more detailed information can be obtained about the system. A protocol for the basic setup of an ITC experiment is given. Video Link The video component of this article can be found at https://www.360docs.net/doc/8c3728253.html,/video/2796/ Protocol Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well established technique that can determine all the thermodynamic parameters (affinity, enthalpy and stoichiometry) of a binding interaction in one experiment.1 ITC works by titrating one reactant into a second reactant under isothermal conditions. The signal measured is the heat released or absorbed upon interaction (binding) of the two reactants. A series of injections are performed and the heat signal will approach zero as the limiting reactant becomes saturated. Fitting of the isotherm gives the thermodynamic parameters. Several reviews are available that describe the instrumentation as well as the math of data collection and analysis. 2,3 While other calorimeters are available (most notably the ITC200 with small volumes), here we describe a general protocol for the VP-ITC manufactured by MicroCal (now part of GE Healthcare). 1. Preparing Samples 1.In order to prepare the macromolecule and ligand in buffer, some potential issues need to be addressed. Accurate fits require proper concentrations of the macromolecule, the species that typically goes in the sample cell of the ITC, and ligand, the species in the injection syringe. Because some proteins aggregate at the high concentrations needed for the species in the injection syringe, most often the protein is loaded into the sample cell. The optimal macromolecule concentration is determined from "c", the product of the predicted affinity of the system, which can be estimated using orthogonal methods prior to using ITC, and the total macromolecule concentration, where c = K a*[M]. Optimal values of c range from 10-1000, 1 though it is possible to get accurate data for weak-binding systems under specific experimental conditions with c-values below the lower limit.4 Thus, the macromolecule concentration must be determined with this range of c values in mind (i.e., for a K a of 106 M-1, macromolecule concentrations of 10 to 1000 μM should be used). Prior knowledge of the binding affinity of the system can help minimize the protein used for ITC through better design of the ITC experiment. The concentration of the ligand should be large enough (7-25 fold more concentrated than the K d for the weakest ligand binding site) so that saturation occurs within the first third to half of the titration. Accurate fitting of the data also requires saturation of the signal. For systems with higher binding affinity, a lower ligand concentration should be used to avoid saturation too early in the titration, which will give inaccurate fits. Once the heat of dilution control (i.e. titration of ligand into buffer) has been subtracted from the titration, the enthalpy at saturation should approach zero. 2.Because small molecule impurities can give rise to artifactual signals in the ITC measurements, it is best, if possible, that the macromolecule and ligand be exhaustively dialyzed against buffer. Alternatively, column chromatography, desalting spin columns, or buffer exchange centrifugal filters (for example, Centricons) can be used to change the buffer of the macromolecule. If the ligand is a small molecule, it can be prepared using the dialysis buffer after the macromolecule has been dialyzed or by dialyzing against dialysis membranes with cutoffs suitable for small molecules (i.e. 100-500 Da for a Spectra/Por Float-A-Lyzer). Differences in the buffer composition between the ligand and macromolecule solutions can lead to signal artifacts from the heat of the dilution of impurities in the samples. After preparation, check to make sure the pH of the buffer, macromolecule and ligand match (± 0.05 pH units) as artifacts in the enthalpy can arise due to buffer protonation effects.5 Make sure to prepare enough of each species. For triplicate experiments and a dilution control, the amount of material needed will depend upon the ITC used. But, for most ITC instruments that have approximate 2 ml volume sample cells, at least 6-7 ml of

结构化学实验-itc等温量热滴定

一、实验目的： 1.了解MicroCal iTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用 2.了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作 3.简要分析实验结果。 二、实验原理： 在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数KD、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG = RT lnKD和ΔG = ΔH -TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。

在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。 MicroCal iTC200等温滴定量热仪可以用来定量测定生物分子间的相互作用，例如蛋白质-蛋白质相互作用（包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用）；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用等。从而获得亲和力以及相关热力学数据。 通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线： 图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数KD。 决定曲线形状的主要参数是C值： C = 滴定池中的蛋白浓度/ K D = [M]t/ KD × N

等温滴定微量热仪(ITC)简介

等温滴定微量热仪(ITC)简介 等温滴定量热法在生命科学研究中应用 申明：本资料来源于网络，版权归原作者所有！ 等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。微量热法具有许多独特之处。它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独特优势，样品用量小，方法灵敏度和精确度高(本仪器最小可检测热功率2 nW，最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 0C - 80 0C，滴定池体积1.43 ml)。实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin 软件分析ITC得到的数据)。测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。

ITC的用途 获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。 ITC的应用范围 蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；…… 加样体积：（实际体积） cell：1.43 ml，syringe：300 μl 准备样品体积（最少量） cell：2 ml，syringe：500 μl

等温滴定量热法在生命科学研究中应用

等温滴定量热法在生命科学研究中应用 等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。微量热法具有许多独特之处。它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独特优势，样品用量小，方法灵敏度和精确度高(本仪器最小可检测热功率2 nW，最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0. 4ug，温度范围2 0C - 80 0C，滴定池体积1.43 ml)。实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin 软件分析ITC得到的数据)。测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。 ITC的用途 获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。 ITC的应用范围 蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RN A相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；…… 加样体积：（实际体积） cell：1.43 ml，syringe：300 μl 准备样品体积（最少量） cell：2 ml，syringe：500 μl 样品浓度cell：几十μM到几mM syringe：几百μM到几十mM 测量Kb范围102-1012 M-1 滴定实验前恒温30-60 min 等温滴定量热实验所需时间，一般1.5-4 hr 微量热技术(Microcalorimetry)(2008-05-27 19:58:14)

等温滴定量热仪和差示扫描量热仪在生物制剂研发中的应用

等温滴定量热仪和差示扫描量热仪在生物制剂研发中的应用 液剂中蛋白药物的稳定的一个重要因素是适当的辅料的选择，适宜的辅料浓度能够在延长药物保质期的同时确保患者的最高的用药安全。尽管过去十年间的文献报道了维持稳定性的一般准则，但是在存储期间辅料如何提升蛋白药物的稳定性，其机制尚未完全明晰。为能合理优化蛋白制剂，掌握有关蛋白-辅料相互作用机理的知识十分重要。 通过微量热技术来研究来探索蛋白-辅料的相互作用，因而被越来越多的应用于生物制剂的研发和优化。通过使用等温滴定量热仪（ITC）和差示扫描量热仪（DSC）等技术，评估与相互作用有关的热力学参数，例如辅料-蛋白的结合，辅料参与下蛋白质伸展等，揭示研发最优制剂所需的重要机理信息。 这里我们列举两个ITC和DSC是怎样辅助蛋白制剂研发的例子。在第一个例子中，使用ITC揭示了聚山梨酯80（常用表面活性剂，通过降低蛋白表面吸附和聚集以稳定蛋白性质）与蛋白X（ProX）之间的相互作用。使用单位点模型拟合ITC数据计算得出结合亲和常数（K A）=1430±260 M-1，结合焓（△H）=-6.3±1.1 kcal/mol，每个ProX 分子结合位点数（n）=2.6±0.3。另外一个例子中，使用DSC和ITC产生的数据集显示在抗菌防腐剂，苯酚存在的条件下，ProX在pH5.7时结构最稳定。因而在上述两个研究中，来自于GE Healthcare生命科学部的等温滴定量热仪ITC200 和差示扫描量热仪VP-Capillary DSC在探寻制备ProX最佳制剂方法方面提供了非常重要的信息。 由于蛋白质分子内在的不稳定性，包括物理不稳定性（伸展、聚集、吸附）和化学降解性（氧化、脱酰胺、断裂），以基于蛋白质的治疗发展面临着巨大的挑战。蛋白的不稳定可以导致蛋白活性降低甚至可能产生潜在的免疫原性。为增加蛋白的稳定性，可以尝试改变蛋白所在溶剂的性质，包括选择缓冲液系统，调节pH值，添加辅料/添加剂，即研发最佳剂型。 选择适当的赋形剂并优化赋形剂浓度是蛋白药物的溶剂稳定性的一个重要因素，可以增加用药的安全性并延长保质期。因而蛋白药物制剂研发的一个重要环节是赋形剂的选择，需满足以下条件，合适的溶解度，无毒，可维持蛋白结构的完整，保证较长的保质期，以及保持产品的生物活性。这样的辅料包括氨基酸、盐、金属、表面活性剂、糖，多羟基化合物和聚合物。可作为稳定剂，表面活性剂，抗菌防腐剂或抗氧化剂。赋形剂的稳定作用通常是蛋白特异性并呈现浓度依赖性。

连续等温滴定量热法加速和改善结合实验的新方法

Continuous isothermal Titration Calorimetry - ciTC - a new way to speed up and improve binding experiments Natalia Markova Dan Hallen Biovitrum AB, Stockholm, Sweden inTroDuCTion Microcalorimetric instruments and methods are now essential tools for the general understanding of binding thermodynamics of biological macromolecules and specific bio-logical systems. Provided that the enthalpy of binding is of appropriate magnitude, it is possible to determine affinities, K D , in the order of 10 nM (K=l08 M -1) for 1:1 complexes. One of the most important issues with ITC is the time needed to obtain a full binding iso -therm. ITC inherently suffers from the relatively small number of binding experiments that are possible to perform per day. The focus has so far been on improving calorimetric response time of the instruments by various means, like assigning instrumental time con -stants and applying Tian’s equation to dynamically correct the raw calorimetric signal from a fast step-wise titration 1. Notably, nothing has so far been done to improve the experimen -tal procedure. At the moment 2-3 h is needed to complete an ITC binding experiment. The number of data points that can be obtained, 20-30 points, limits the range of equilibrium constants that can be resolved from the data. For ITC this range is 1 ≤ KC M ≤ 1000, 2,3 where K is the equilibrium constant and C M is the concentration of the reactant in the ves -sel. In this Application Note we show the possibility to shorten the tim e of an ITC experi -ment by slow continuous titration into the calorimetric vessel, cITC. We have applied the methodology to systems that have been suggested as calibra -tion and test reactions for titration calorimetry 4, the binding of Ba 2+ to 18-crown-6 and the binding of 2’CMP to RNAse A. ExPErimEnTal Aqueous solutions of BaCl 2 and 18-crown-6 were prepared at 49.7 mM and 3.1 mM respectively. RNAse A from bovine pancreas (EC 3.1.2.7.5), was dialyzed overnight at 4°C against 1000-fold excess of the buffer (20 mM KAc, 20 mM KCl, pH 5.5), The concen -tration of RNAse A was 23μM and 2’CMP was 291 μM. We used a Thermometric 2277 TAM equipped with a titration unit with a 1 ml stainless steel vessel and a golden propel -ler stirrer. The stirring speed was adjusted to 60 rpm. A 250-μl Hamilton syringe mounted onto a pump (Thermometric 6120 Lund Pump) was used for the injections. The tip of the injection needle was positioned 1 mm above the upper part of the propeller stirrer. In the experiments 900 μl of reactant solution (18-crown-6 or RNAse A) was loaded in the vessel and stirred al 60 rpm. A non-stirred titration unit charged with 900 μl of water was used on the reference side of the microcalorimeter. With the help of the highly flexible injection system from Thermometric the injection rate was optimized to0.135 μl/s. In the analysis of a cITC experiment we use the thermal power, P, which is related to the enthalpy of binding, ΔH, for a 1:1 binding through: P= ?H ––––––– ?V i ( 1 )

等温滴定量热法(ITC)

等温滴定量热技术 摘要：生物大分子可以和很多配体特异性结合，当物质结合时，热量要么产生，要么吸收。生物大分子与配体相互作用的定量描述需要确定反应过程中热力学参数的变化。相互作用过程中产生的热量变化可以用量热计定量监测。等温滴定量热技术（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术，它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息，如结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（△H）、熵（△S）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）。这些信息提供了生物分子相互作用的真实写照。由于几乎所有的生化反应过程都有热量变化，所以ITC具有很广泛的应用，它可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞相互作用等方面。 关键字：等温滴定量热技术、相互作用、热力学 商业化的测量生物分子相互作用热量的灵敏的量热计出现在上世纪80年代后期[1]。从此这种技术被广泛应用。在过去的20年中，等温滴定量热技术（ITC）成为研究相互作用的常用方法。随着现代ITC仪器的发展，ITC更加灵敏、快速、易用。 分子识别是一个复杂的过程，是生命活动的基础。生物分子识别过程需要结合反应的热力学参数来阐明。等温滴定微量量热法可以直接定量检测滴定反应过程中的热量变化，确定反应的结合常数K B 、结合计量比（n）、反应焓变（?H）、熵变（?S）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）等热力学参数，用来表征生物分子间的相互作用。ITC已成为研究生物大分子结合反应的有力工具。现代的ITC仪器可以测量0.1μcal (0.4 μJ)的热效应，108–109M-1的结合常数，反应速率可以精确至10-12 mol/s，Km和kcat的测量范围分别在10-2–103mM 和0.05–500s[2]。由于几乎所有的生化反应过程都有热量变化，ITC 的应用非常广泛，包括涉及焓变的化学和生化结合反应以及一些复杂过程，比如酶动力学。与其他的研究方法相比，ITC 不需要作任何的化学修饰或固定，可以直接地测量结合焓。许多生化反应可以在等温条件下完成，通过滴定改变样品的组成，为ITC 提供了广阔的潜在应用前景。它对于阐明分子结合机制，结合分子结构进行药物设计等都有重要的作用。 等温滴定量热技术简介 ITC是一种热量连续变化的量热器。主要由隔热夹套包裹着的样品池(反应池)和参比池、注射器和一台计算机组成，注射器同时具有搅拌作用，计算机控制温度控制装置和信息反馈系统（图1）[3]。恒温条件下当滴定进行前，首先反馈系统给样品池一个连续的能量确定基线。滴定进行时，注射器滴入反应物（通常是用小分子物质滴定大分子，本文中注射器中的反应物称作配体，ligand，L）与样品池中被滴定物（本文中被滴定的反应物称作大分子，macromolecule，M）相互作用触发结合反应，形成大分子/配体复合物（macromolecule/ligand，ML）。复合物的形成伴随着能量的释放或吸收，导致样品池温度的变化，参比池始终保持在实验温度，反馈系统提供热或降低热量来补偿样品池的温度变化，每注射一次后系统恢复至平衡状态再进行下一滴滴定。结果以峰的形式表示平衡温度偏移所需要的能量，峰的面积相

等温量热滴定法

滴定量热法也称热滴定法或测温滴定法。是一种量热或分析技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化。 滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬浮的固体；滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定物间的化学作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引起的。 实验数据以热谱图形式表示，它提供了有关反应中物质的量（滴定终点）和反应物质的特性（焓变）的数据。对图进行分析，可以得知反应容器中发生的反应的类型和数目，以及溶液中存在的各物种的浓度等信息。这部分内容称为热滴定，同时还可以确定反应的化学计量关系，计算反应的热力学量,如平衡常数K(ΔG°)、标准状态下的焓变ΔH°和熵变ΔS°,这部分内容称为滴定量热法。 测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、介电常数、溶剂强度、以及离子强度等)无关,因此可以用于气相、液相、非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。 图1为滴定量热计框图。滴定管内含有一种反应物的滴定剂，可加入到反应容器内，滴 定剂的浓度一般为被滴定液的数十倍甚 至一百倍左右。反应产生的温度变化由温 度传感器（例如热敏电阻）感知，通过惠 斯通电桥电路转换为相应的伏特数或热 功率。这个伏特数由放大电路放大并记录 于记录仪上，或者馈入其他的数据采集系 统。反应容器和滴定管置于同一恒温浴中， 恒温浴温度由温度控制器控制，并由温度 传感器测量。滴定剂和反应容器的温度必 须相等，或者它们之间的温差必须精确知 道。 滴定剂的加入方式①连续加入法：滴定剂以恒速加入，可以得到滴定进程中热效应的完整记录。对于特别复杂的反应，可以从这种记录图中选择任意数目的数据点，用于必要的计算。连续滴定法要求对温度变化的响应必须够快，并且此法只适用于快速反应。②分次递增加入法：间歇地每次加入单位增量的滴定剂，在每次加入单位增量前，必须调节反应容器的温度，使回复到起始温度，通过加入许多次增量，也能够得到足够的测量数据，从而绘制成与连续法相似的图线。不过，它比连续法的工作量要大一些。递增法的好处是可以精确研究动力学上较慢的反应。③连续流动量焓法：使两种溶液各自以恒速连续流过一个混合(测量)容器。此法的优点是反应物于不存在气相情况下混合，这对于测量挥发性液体体系非常 重要，并且可以忽略表面吸附效应。该法特别适用于研究复杂的生物化学和微生物学过程。此外，此法的装置可以连接在生产线中进行分析而达到过程控制的目的。

MicroCal等温滴定量热仪

MicroCal 等温滴定量热仪MicroCal iTC200 / Auto-iTC200 Imagination at Work

等温滴定量热 Isothermal Titration Calorimetry 等温滴定量热（ITC）是一种直接测量生物分子结合过程中的放热或者吸热的技术。通过对热量的测定可以精确的得到结合常数（K B），反应的化学计量数（n），熵（ΔS）和焓（ΔH），在单次实验中即可提供一整套有关分子相互作用的完整信息。ITC是表征生物分子相互作用的经典方法之一。 ITC的应用范围包括：小分子、蛋白、抗体、核酸、脂类及其他生物分子之间的相互作用特征鉴定；酶动力学；分析因分子结构改变导致的结合变化等。 在全球，MicroCal 仪器被普遍应用于制药厂商、生物技术公司以及众多大学、科研院所和政府机构。 工作原理 ITC可主要分为两个部分，上部是控制滴定的注射系统，下部是样品池和量热系统。 注射器装载实验检测用的“配体”溶液，样品池中含有待检测的另一种“大分子”样品。实验时，在恒定的温度下，配体溶液以设定的体积和次数逐滴进入样品池中。两者发生相互作用时释放或吸收的热量和两者结合的数量之间存在间接比例关系。通过灵敏 的热量检测系统和功率反馈补偿机制，便可准确的检测到反应过程中极其微小的的热量变化，并以实时的数据曲线形式输出。 当样品池中的大分子逐渐被滴入的配体所饱和时，相互作用产生的热量信号会逐渐减小，直到最后仅能检测到配体滴入时产生的背景稀释热量。 输出的曲线经过软件分析，便可得到全面完整的热动力学数据 。图1.典型ITC数据图：上半部分表示每次注射采集的数据。下半部分表示每次注射的释放的热量（上图中每个峰的面积积分）对滴定样品与样品池中样品的摩尔比作图 图2.ITC功率反馈补偿机制