信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响

ISSN 058229879

生物化学与生物物理学报

ACT A BIOCHIMICA et BIOPHY SICA SINICA 2003,35(2):154-160

CN 3121300/Q

收稿日期:2002208221 接受日期:2002210216

上海市科委重大项目(N o.993913002)和上海永业农科生物工程

公司资助

3联系人:T el ,021*********;Fax ,021*********;e 2mail ,

yaoquanhong @https://www.360docs.net/doc/9317707869.html,

信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响

熊爱生　彭日荷　李　贤　范惠琴　姚泉洪3　郭美锦1　张嗣良1

(上海市农业科学院生物技术研究中心、上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106;

1华东理工大学生物工程学院,上海200237)

摘要 乙醇氧化酶启动子被分离、克隆,并建立了转化方法后,毕赤酵母已被发展成为一种高效的外源蛋白表达宿主。为了进一步提高外源蛋白质的分泌表达,对信号肽序列进行了研究。首先按毕赤酵母的偏爱密码合成了酿酒酵母的α因子信号肽序列MF4I ,随后在MF4I 信号肽序列的N 端分别引入1～10个毕赤酵母Aox 1蛋白质的N 端氨基酸,构成10种不同的分泌信号肽序列,10种不同的分泌信号肽序列被用于植酸酶基因的毕赤酵母分泌表达。以上新的信号肽序列都可使植酸酶的分泌表达量增加,而以N 端增加A 、I 、P 三个氨基酸的信号肽序列引起的提高最大;和野生型的酿酒酵母α因子信号肽序列相比,使植酸酶分泌表达量增加5倍,摇瓶中植酸酶的分泌表达量为90mg/L 。此外在MF4I 信号肽的引导序列和内切蛋白酶间增加了E E A E A E A E P 和K 共10个氨基酸,进一步提高信号肽的分泌效率,使表达又提高约35%,使得摇瓶中酸性植酸酶的表达量达到120mg/L ,是pPCI9K 表达量的8倍。

关键词 毕赤酵母;信号肽序列;表达载体;高效表达

毕赤酵母(Pichia pastoris )系统是近年来发展很快的一个真核表达系统,许多有活性的蛋白质已经

在毕赤酵母系统中大量表达。毕赤酵母在缺乏抑制性碳源如葡萄糖、甘油时,能以甲醇为唯一碳源生长。毕赤酵母表达系统是真核表达系统,可以对表达的蛋白质进行加工折叠和修饰,还具有发酵方法成熟、发酵密度高、培养简单廉价、外源蛋白质既可以胞内积累又可分泌;表达产量高、背景蛋白质少、易于表达产物纯化等优点。 近年来,许多蛋白质在毕赤酵母中实现了高效表达,达到了克级水平,部分达到了十几克的高表达[1,2]

;但仍然有多种的蛋白质表达量相对较低[3,4]。提高毕赤酵母外源蛋白质的表达量是降低工业化生产成本的关键。 在菌株、培养条件、发酵等逐渐成熟的情况下,构建高表达的载体是提高外源基因表达量的一个关键因素。mRNA 5′端非翻译区(5′2UTR )的核苷酸序列和长度影响外源基因的表达。一个适当长度

的5′非翻译区可极大地促进mRNA 有效地翻译。维持外源基因mRNA 5′2UTR 尽可能和Aox 1mRNA 的

5′2UTR 的相似是必需的。通过人血清白蛋白(H AS )和Aox 1mRNA 的5′2UTR 一致,使HS A 基因的表达

量提高了50倍[5]。酿酒酵母α交配因子(MF α)信号肽在酵母表达外源蛋白质中广泛使用[6～9],研究显

示在MF

α中间插入E E A E A E A E P K 共10个氨基酸的新信号肽序列可使胰岛素在毕赤酵母中的分泌效率提高了2倍以上[10]。偏爱密码子的使用能够较大幅度提高植酸酶基因的表达水平[11]。Aox 1启动子能够高效启动Aox 1基因在毕赤酵母中的表达,在信号肽的起始密码子ATG 后增加Aox 1基因ATG 后的氨基酸序列能够提高目的蛋白质的表达量。 本文研究了信号肽序列调整对外源蛋白质在毕赤酵母系统中表达的影响。通过连续延伸PCR 技术[12,13]按酵母偏爱设计并合成了信号肽序列,研究了各种调整对表达的影响。

1　材料和方法(Materials and Methods )

1.1　材料

1.1.1　菌株与质粒 毕赤酵母菌株[Pichia pas 2

toris (His 2Mut +

)]购自美国种质保藏中心(ATCC )。

大肠杆菌菌株 E.coli DH5α、质粒pBluescript SK 等

为Promega公司产品。质粒pPIC9K为Invitrogen公司产品。

1.1.2　试剂耗材 PCR引物由上海生工公司合成,限制性内切酶、T4连接酶和Pyrobest DNA聚合酶为T aK aRa公司产品。DNA测序试剂盒购于Phar2 macia公司。G418、脱糖基化试剂Endo H、植酸酶检测试剂(植酸钾钠、钼酸胺、偏钒酸胺)以及植酸酶纯品购自Sigma公司,其他化学试剂均为国产AR 级。

1.2　方法

1.2.1　信号肽序列的化学合成 根据G enBank (Z46233)[14]的信号肽序列和Aox1基因[15]的氨基酸序列,按照酵母偏爱密码[16],设计合成引物。引物从两端开始设计,5′端到中间为正向引物,3′端到中间为反向引物。两条引物之间存在20～25bp的重叠序列(表1)。基因合成采取连续延伸PCR方法进行[12,13](图1)。

1.2.2　DNA操作 基因工程操作根据文献[17]进行。制备的双链质粒DNA在ABI377型DNA自动化测序仪上进行序列测定。测序工作在上海市农业科学院生物技术研究中心植物基因工程研究室完成。

1.2.3　酵母各表达载体构建 分别将修饰过的信号肽序列,用Hin dIII和Xho I双酶切,定向插入表达酸性植酸酶的酵母表达载体中[18],构建不同信号肽的酸性植酸酶重组质粒。

1.2.4　酵母的电击转化及筛选 将活化的毕赤酵母于500m L Y PD(20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、20g/L葡糖糖)中30℃培养18h,至A值达到1.7,5000r/min离心收集菌体,先后用500m L、250m L预冷的无菌水洗菌体,离心去上清液,用20 m L预冷的1m ol/L山梨醇悬浮菌体。离心后菌体再用0.5m L预冷的山梨醇悬浮,用于电击。

大量抽提酵母表达质粒,Bgl II酶切回收小片段,取2μg线性化片段加入50μL感受态细胞,冰浴5min,用Bio2Red G enePulser电击仪电击,参数为2.5kV,25μF。电击结束后,立即加入1.0m L预冷的1.0m ol/L山梨醇,取200μL涂布于固体选择培养基平板[186g/L山梨醇、20g/L葡萄糖、13.4g/ L酵母氮源基础培养基(Y NB)、0.05g/L谷氨酸、0.05g/L甲硫氨酸、0.05g/L赖氨酸、0.05g/L亮氨酸、0.05g/L异亮氨酸、20g/L琼脂糖],30℃培养直至转化子出现。用牙签将转化子对应点种到M M(13.4g/L Y NB、0.4mg/L生物素、5g/L甲醇、15g/L琼脂糖)和M D(13.4g/L Y NB、0.4mg/L生物素、20g/L葡萄糖、15g/L琼脂糖)平板上,30℃培养2天,在M D上生长正常而在M M上生长不正常或不生长的转化子为阳性克隆。

将阳性克隆分别对应划线于M D和G418浓度为0.5μg/L M D平板上进行单拷贝的筛选。含G418 M D平板上不生长,M D平板上生长的为表达单元单拷贝的克隆[19]。

1.2.5　重组酵母的培养及诱导表达 将重组酵母接种于20m L BMGY(10g/L酵母提取物、20g/L 蛋白胨、13.4g/L Y NB、0.4mg/L生物素、10g/L 甘油),30℃培养,离心收集菌体,加入20m L诱导培养基BM MY(用0.5%甲醇代替BMGY中的甘油),30℃下继续诱导培养36h。

1.2.6　高表达菌株筛选及S DS2PAGE电泳分析 将所有的阳性克隆分别单独接种到试管中,30℃培养至A值达到3左右,再利用0.5%甲醇诱导培养36h。每个诱导菌株取5μL上清液进行S DS2 PAGE并且结合植酸酶活性测定筛选高表达菌株。分别将各构建的高表达菌株接种到三角瓶中,30℃培养至A值达到4～5,再利用甲醇诱导培养36h。每个诱导菌株取10μL上清液进行S DS2PAGE检测,分析蛋白质的表达量。

酸性植酸酶在毕赤酵母中表达时,糖基化程度较高[20],蛋白质电泳条带较为复杂。含约100μg酸性植酸酶蛋白的发酵上清液中加入3000u的Endo H 进行脱糖基化处理,37℃水浴5h,进行S DS2PAGE 电泳[21]。

以植酸钾钠为底物进行酶活性测定。植酸酶酶活性测定方法采取钼黄法[22]。植酸酶酶活性单位(u)定义为:在37℃下,每分钟分解植酸盐释放出1nm ol/L无机磷酸所需要的酶量为1u。

2　结果(Results)

2.1　不同信号肽序列的合成与序列测定

通过图1所示连续延伸PCR,利用表1的引物,再利用高保真的Pyrobest DNA聚合酶合成了15条信号肽序列,分别编号为:XHT1、XHT2、XHT3、XHT4、XHT5、XHT6、XHT7、XHT8、XHT9、XHT10、XHT11、XHT12、XHT13、XHT14和XHT15(表2)。XHT1消除了ATG密码子前的Bam HI酶切位点(GG ATCC),使得启动子与信号肽序列间直接相连,没有使用酵母偏爱密码(notuse2 biascodon),该调整对表达有促进作用。XHT2～15

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Feb.,2003熊爱生等:信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响

Fig.1　The nucleotide sequence of signal peptide synthesis by

successive PCR

Each of chemically synthetic olig onucleotides was about 90bp.All these primers can assembled correctly by one 2step PCR when 1-2ng inner primers and 100-200ng external primers were blended together.Those PCR

external primers contain suitable restriction cleavage sites for cloning.

均使用了酵母偏爱密码(use bias codon )。XHT3是没有消除Bam HI 酶切位点,XHT4消除了Bam HI 酶切位点。XHT4～13消除了Bam HI 酶切位点,同时在信号肽MF4I 启始密码子ATG 后分别增加了毕赤酵母Aox 1基因ATG 后的1～10个氨基酸,分别为A 、I 、P 、E 、E 、F 、D 、I 、L 和V 。以全合成酸性植酸酶为例,上述氨基酸的加入均可提高外源基因的分泌表达量,以插入A I P 三个氨基酸的表达量提高最大。另外在

MF4I 信号肽的引导序列和内切蛋白酶间增加了E E A E A E A E P K 共10个氨基酸,提高信号肽的分泌效率,XHT14对表达提高的作用明显。优优组合,将几方面的提高因素结合,合成XHT15,具有以下特征:采用了酵母偏爱密

Fig.2　Comp arison of nucleotide sequences betw een synthetic signal peptide sequence and the sequence from pPCI 9K

The underlined region are deleted the site of Bam HI.The boxed region en 2codes A 、I 、P 、E 、E 、F 、D 、I 、L and V amino acid residues.The lower 2case region in bold encodes E E A E A E A E P K amino acid residues.

码、信号肽与启动子直接相连,在相应的位置插入A I P 和E E A E A E A E P K 等氨基酸,以进一步

提高信号肽的分泌效率。分别将它们克隆到pBlue 2script SK 载体,采用双脱氧核苷酸终止法进行DNA 测序,结果表明合成的信号肽序列与设计一致,与报道的信号肽序列有了不同程度的改动(图2)。2.2　含不同信号肽的高效表达载体的构建

T able 1　Primers for enzym atic synthesis of signal peptide sequence

The underlined regions are Hin dIII and Xho I sites.The boxed region encodes A 、I 、P 、E 、E 、F 、D 、I 、L and V amino acid residues.The shadowed region

encodes E E A E A E A E P K amino acid residues.

6

51 ACT A BI OCHI MIC A et BI OPHY SIC A SI NIC A

V ol.35,N o.2

T able2　The name and ch aracterization of the fifteen construction of plasmids

Name Primers

Characterization of the signal

Hin dIII ATG Xho I acid phy gene

　pPCI9K

　XHT1S11、S21AA AAACG(M R F)N ot use bias codon XHT2S11、S3、S5、S6、S4、S2AAGG ATCCAAACG(M R F)Use bias codon XHT3S1、S3、S5、S6、S4、S2AA AAACG(M R F)Use bias codon XHT4S1、S31、S5、S6、S4、S2AA AAACG(M A R F)Use bias codon XHT5S1、S32、S5、S6、S4、S2AA AAACG(M A I R F)Use bias codon XHT6S1、S33、S5、S6、S4、S2AA AAACG(M A I P R F)Use bias codon XHT7S1、S34、S5、S6、S4、S2AA AAACG(M A I P E R F)Use bias codon XHT8S1、S35、S5、S6、S4、S2AA AAACG(M A I P E E R F)Use bias codon

　XHT9S1、S36、S5、S6、S4、S2AA AAACG(M A I P E E F R F)Use

bias codon

　XHT10S1、S37、S5、S6、S4、S2AA AAACG(M A I P E E F D R F)Use bias codon XHT11S1、S38、S5、S6、S4、S2AA AAACG(M A I P E E F D I R F)Use bias codon XHT12S1、S39、S5、S6、S4、S2AA AAACG(M A I P E E F D I L R F)Use bias codon XHT13S1、S310、S5、S6、S4、S2AA AAACG(M A I P E E F D I L V R F)Use bias codon XHT14S1、S33、S5、S6、S41、S2AA AAACG(M R F E E A E A E A E P K)Use bias codon XHT15S1、S33、S5、S6、S41、S2AA AAACG(M A I P R F E E A E A E A E P K)Use bias codon

将按照酵母偏爱全合成的酸性植酸酶基因通过Xho I和Not I插入pPCI9K载体中,构建酸性植酸酶原始表达载体。再分别将15条不同的信号肽序列通过Hin dIII和Xho I酶切后定点插入表达酸性植酸酶的表达载体p Y PX98,构建不同信号肽的酸性植酸酶重组质粒,共有15种(图3)。酶切和测序鉴定构建正确。

2.3　毕赤酵母的电击转化筛选

通过电击法将经过Bgl II单酶切线性化的表达酸性植酸酶16种质粒分别转化毕赤酵母。由于受体酵母为His缺陷型(His-),在不加His的基本培养基上不生长,只有整合得到的重组酵母才能正常

Fig.3　Construction of plasmids of inclusion eleven kinds of signal peptide 生长。通过这一标记,筛选得到各质粒大量的His+转化子,每种组合均筛选200个左右。通过同源重组,将植酸酶基因表达单元整合到酵母染色体上,整合会破坏受体酵母的醇氧化酶基因,重组酵母在以甲醇作为碳源的培养基中不能正常生长。用甲醇为碳源的M M培养基和以葡萄糖为碳源的M D培养基进行对应培养,进一步筛选得到各质粒的重组转化子,每个构建均得到30多个转化子。将16种质粒的阳性转化子分别对应划线于M D和G418浓度为0.5μg/L M D平板上进行单拷贝的筛选。得到含G418M D平板上不生长,M D平板上正常生长的克隆,各取10个接种到BMGY液体培养基试管中,30℃培养至A值为3.0,离心洗去培养基,加入诱导培养基BM MY培养36h,取上清液进行S DS2PAGE 电泳和表达产物酶活性的测定。结果显示pPCI9K 和XHT1～15各组合内菌株的植酸酶最高与最低表达量在5%以内,各重组质粒内样品蛋白质表达量无差异,说明筛选到的转化子在质粒拷贝数和表达量方面是均一的。各构建分别取一菌株进行摇瓶实验,以得到更加准确可靠的结果。

2.4　毕赤酵母中高效表达的分析

16个表达菌株经过摇瓶的培养和诱导后,上清液经End oH进行脱糖基化处理后,进行S DS2PAGE 电泳,考马斯亮蓝染色。表达的植酸酶分子量大小约为64kD,这证明植酸酶基因能有效分泌表达(图4)。定量扫描结果显示,pPCI9K的表达量为15mg/ L,植酸酶酶活力为 2.2u/m L。信号肽调整后构建质粒XHT1、XHT2、XHT3、XHT4、XHT5、

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Feb.,2003熊爱生等:信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响

Fig.4　SDS 2PAGE analysis of phytase expression in Pichia pastoris

M ,protein m olecular weight standards (kD );0,purified phytase ;1,ex 2pression vector pPCI9K;2-16,expression vectors XHT 1-15.

XHT6、XHT7、XHT8、XHT9、XHT10、XHT11、XHT12、XHT13、XHT14和XHT15的表达量与植酸

酶酶活力均比pPCI9K 高。其中消除了Aox 1启动子与信号肽间的序列,导致表达量提高了93%;信号肽按照酵母偏爱合成,导致表达量提高了106%;在信号肽的起始密码ATG 后增加Aox 1基因ATG 后的1～10个氨基酸(A 、I 、P 、E 、E 、F 、D 、I 、L 和V ),以增加1个和3个氨基酸提高表达量最为明显,

分别提高了3倍和5倍。另外在MF4I 信号肽的引导序列和内切蛋白酶间增加E E A E A E A E P K 10个氨基酸,使得表达量提高了2.4倍。优优组合的构建XHT15,酸性植酸酶的表达量得以进一步的提高,表达量达到了120mg/L ,植酸酶酶活达到17.3u/m L ,表达量与酶活力分别是pPCI9K 载体的8.00倍和7.85倍。酶活力测定的结果与蛋白质表达量的结果一致(表3)。

3　讨论(Discussion )

用毕赤酵母基因表达系统生产蛋白质很有发展前景。已有多种蛋白质表达量超过10克的高效表达例子,但是仍有很多蛋白质表达量很低。外源蛋白质表达量仍不理想,真正推向市场的高表达产品并不多。影响外源蛋白质在毕赤酵母中表达的因素很多:表达单元的拷贝数;表达单元的酵母染色体整合位点和方式;mRNA 5′端和3′端非翻译区(5′2UTR 和3′2UTR );转录起始位点ATG 前后的序列;

T able 3　The comp arison of the expression value

among those plasmids

Lane Expression level (mg/L )

Relativity (%)Phytase activity (u/m L )Sam ple name 115

100 2.2pPCI9K 229193 4.5XHT 1331206 4.7XHT 2428186 4.3XHT 357046512.0XHT 4640265 6.4XHT 579060013.5XHT 68604009.5XHT 796543310.5XHT 810583859.2XHT 911553659.0XHT 10126241310.0XHT 111335233 5.2XHT 1214

38253 5.5XHT 1315513407.8XHT 1416120

800

17.3

XHT 15

0purified phytase (S igma )

M

marker

AT 的比重;转录和翻译的效率;分泌信号肽;内源

蛋白酶的活性;宿主菌的种类和状态、培养基、生

长条件、发酵参数等等。上述所有的因数在设计最优外源蛋白质表达条件时都应充分考虑。 通过连续延伸PCR 技术全合成了按照酵母偏爱密码设计的信号肽,并且对信号肽序列对表达的影响进行了详尽的研究。在带5′2UTR 的信号肽序列MF4I 的设计中还设计使ATG 附近不形成二级结构,且使mRNA 的自由能尽可能大,以有利于提高mRNA 的翻译效率。在信号肽的起始密码子ATG 后分别加入毕赤酵母Aox 1基因ATG 后的10个氨基酸,在MF4I 信号肽的中间增加了EE AE AE AEPK 10个氨基酸,这大幅度地提高了外源基因的分泌表达。在毕赤酵母中,表达单元的染色体整合拷贝数一般是单拷贝最优表达,拷贝数并不明显影响外源蛋白质的表达量[5],拷贝数大于10,对表达的影响较大[23],对于植酸酶表达,较低拷贝数时影响很小[21]。本文通过G 418的抗性筛选将拷贝数控制在单拷贝的水平,大大减小了拷贝数对研究的影响。 原始的酸性植酸酶基因在酵母中表达量较低,为了使其能够适应大生产的需要,必须提高酸性植酸酶的表达量。我们利用连续延伸PCR 方法合成酵母偏爱密码的酸性植酸酶基因,构建入优化的高表达载体,表达量提高显著,经过高密度发酵后,重组酵母植酸酶的表达量达到了4.8g/L 。另外,该载体系统在牛碱性成纤维生长因子基因、鱼生长激素

8

51 ACT A BI OCHI MIC A et BI OPHY SIC A SI NIC A

V ol.35,N o.2

基因、cryIA(c)Bt基因的分泌表达中,都获得了较高的分泌表达量,比未优化载体提高了6～10倍(结果将另文发表)。

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Feb.,2003熊爱生等:信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响

061 ACT A BI OCHI MIC A et BI OPHY SIC A SI NIC A V ol.35,N o.2

I nfluence of Signal Peptide Sequences on the Expression

of H eterogeneous Proteins in Pichia pastoris

3

XI ONG Ai2Sheng,PE NG Ri2He,LI X ian,FAN Hui2Qin,Y AO Quan2H ong

G UO Mei2Jin1,ZH ANG Si2Liang1

(Agro2Biotechnology Research Center o f Shanghai Academy o f Agricultural Sciences,Shanghai K ey Laboratory

o f Agricultural G enetics and Breeding,Shanghai201106,China;

1Bio2engineering Department o f East China University o f Science and Technology,Shanghai200237,China)

Abstract Pichia pastoris has been developed to be a very efficient expression host for the heterogeneous proteins since its alcohol prom oter was is olated and cloned,and its trans formation technique was established.F or further im prov2 ing the secretion expression of heterogeneous proteins,in this research,the signal sequences were studied.At first,the Saccharomyces cerevisiae mating factorαprepro2leader sequence was synthesized using successive PCR and designated as MF4I.Then,ten different signal sequences were constructed by adding the N2terminal residues of Pichia pastoris Aox1 protein to the N2terminal of the MF4I.These ten signal sequences were used for directing phytase gene secretion in Pichia pastoris,the secretion of phytase were increased in Pichia pastoris strains containing new signal sequence.Am ong these strains,the phytase secretion was highest in strain contain signal sequence added with A,I,P three Aox1N2termi2 nal residues;the phytase secretion of Pichia pastoris was90mg/L in flake.The secretion was six2fold than that with o2 riginal Saccharomyces cerevisiae mating factorαprepro2leader sequence.In addition,insert of ten residues E E A E A E A E P K can further increase the phytase secretion by35%,the secretion reach120mg/L.

K ey w ords Pichia pastoris;synthetic signal sequence;expression vector;high expression;

Received:August21,2002 Accepted:October16,2002

This w ork was supported by grants from Science and T echnology C ommission F oundation of Shanghai City and Shanghai Y ongY e Bio2engineering C o.Ldt 3C orresponding author:T el,8622126220866023207;Fax,86221262209988;e2mail,yaoquanhong@https://www.360docs.net/doc/9317707869.html,