质粒载体构建
附录A 表达载体的构建
1、大肠杆菌质粒DNA的提取（SDS碱裂解法）
该方法参照分子克隆指南的方法修订而成。
细胞的制备
(1) 将2ml含相应抗生素的LB培养基加入到容量为15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜。
(2) 将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以最大转速离心30s，将剩余的培养物贮存于4℃。
(3) 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
细胞的裂解
(4) 将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的碱裂解液I中，剧烈振荡。
(5) 加200μl新配制的碱裂解液Ⅱ于每管细菌悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与碱裂解液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。
(6) 加150μl用冰预冷的碱裂解液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5min。
(7) 用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，将上清转移到另一离心管中。
(8) 加等量体积的氯仿:异戊醇（24:1），振荡混合有机相和水相，然后用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，将上清转移到另一离心管中。
质粒DNA的回收
(9) 用2倍体积的乙醇于室温沉淀核酸。振荡混合，于室温放置2min。
(10) 用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，收集沉淀的核酸。
(11) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除去。
(12) 加1ml 70%乙醇于沉淀中并将盖紧的离心管颠倒数次，用微量离心机于4℃以最大转速离心2min，回收DNA。
(13) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除去。
(14) 将开口的离心管置于室温使酒精挥发，直至离心管内没有可见的液体存在（5-10min）。
(15) 用50μl含有去DNA酶的RNA酶A（20μg/ml）的TE重新溶解核酸，温和几秒钟振荡，贮存于－20℃。
2、质粒DNA的酶切、回收与连接
质粒DNA的酶切
(1) 提取的质粒DNA用相应的酶进行酶切。
酶切体系为：
单酶切双酶切
ddH2O 8μl ddH2O 8μl
质粒DNA 10μl 质粒DNA 10μl
10×buffer 2μl 10×buffer 2μl
限制性内切酶Ⅰ0.4μl 限制性内切酶Ⅱ0.4μl
限制性内切酶Ⅲ0.4μl 混匀，简单离心后，37℃水浴反应2-4h。
酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
(2) 单酶切需要用小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）去除质粒DNA两端的磷酸基，以防止自身环化。
①酶切产物纯化。取酶切产物加1/10体积3mol/LNaAc和2倍体积预冷无水乙醇，冰上放置5min，12000rpm离心5min，回收沉淀，用预冷的70%酒精洗涤沉淀2次，倒置风干，用25μl TE Buffer溶解。
②CIAP的去磷酸反应。
DNA 25μl
ddH2O 19μl
10×AP buffer 5μl
CIAP 1μl
混匀，简单离心后，37℃反应1h。
③去磷酸产物纯化。取去磷酸产物加1/10体积3mol/LNaAc和2倍体积预冷无水乙醇，冰上放置5min，12000rpm离心5min，弃上清，倒置风干，用20μl 以下的TE Buffer溶解。
质粒DNA的回收
采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0进行凝胶回收。
(1) 对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯下切出含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的
DNA 部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。
(2) 切碎胶块。称量胶块重量，以重量:体积1:3(1mg=3μl)向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer。
(3) 均匀混合后，75℃加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6-10分钟）。胶块一定要充分融化，否则严重影响DNA回收率。
(4) 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。
(5) 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
(6) 将上述操作(4)的溶液转移至Spin Column中，12000 rpm离心1 min，将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。
(7) 将500μl的Rinse A加入Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。
(8) 将700μl的Rinse B加入Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。请确认Rinse B中已经加入了指定体积的100%乙醇。
(9) 重复操作步骤(8)。
(10) 将Spin Column安置于Collection Tube上，12000 rpm离心1 min。
(11) 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25μl的预热至60 ℃灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1 min。
(12) 12000 rpm离心1 min洗脱DNA，4 ℃保存备用。
质粒DNA的连接
将酶切回收的目的片段DNA和载体DNA用T4 DNA ligase进行连接，连接产物可直接转化大肠杆菌。
连接体系：
PEG4000 1μl
Vector 0.5μl
DNA 5.5μl
10×ligase buffer 2μl
T4 DNA ligase 1μl
先将Vector和DNA混合好，置于45℃水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入其他成分，混匀，简单离心后，置16℃过夜。
3、大肠杆菌感受态细胞的制备（CaC12法）
全过程都要在冰上进行，且动作尽量要轻
(1) 从37℃培养16-20h的平板中挑取单菌落，转到5ml LB液体培养基中，
37℃，250rpm，培养过夜（约16h）。
(2) 按1%接种量接种到含有50ml LB液体培养基的500ml三角瓶中，37℃，250rpm，培养2-2.5h（定时检测OD600值，使OD600≈0.4）。
(3) 将菌液转移到一个无菌的、一次性使用的、用冰预冷的50ml离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。
(4) 于4℃，4000rpm离心10min，以回收细胞。
(5) 倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
(6) 每50ml初始培养液用30ml冰预冷的0.1mol/L CaC12溶液重悬细胞沉淀。
(7) 于4℃，4000rpm离心10min，以回收细胞。
(8) 倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
(9) 每50ml初始培养液用2ml冰预冷的0.1mol/L CaC12溶液重悬细胞沉淀，置于冰上4-10min，分装成200μl /1.5mL离心管中，于-70℃保存备用。
4、大肠杆菌的转化
(1) 取DNA连接物10μl，冰浴下加入到200μl大肠杆菌感受态细胞中，混匀，冰上放置30min；其间可轻摇管2-3次，防止菌体沉于管底。
(2) 将管放入预加温至42℃的循环水浴中，热激90s，不要摇动管。
(3) 快速将管转移到冰浴中，室细胞冷却1-2min。
(4) 每管加入到800μlSOC液体培养基中，37℃，200rpm温育40min-1h，以使大肠杆菌复苏，并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
(5) 将适当体积（每个90mm平板达200μl）已转化的感受态细胞转移到含相应抗生素的SOB平板上，室温放置直至液体被吸收。
(6) 倒置平皿，于37℃培养12-16h。
5、重组子的鉴定
(1) 重组子的PCR鉴定：
①从平板上挑取白色单菌落，于装有1ml LB(含有相应抗生素)的1.5ml离心管内37℃培养过夜；
②取1μl菌液作为模板，对单菌落进行PCR鉴定，初步筛选出含目的片段的阳性菌落。
(2) 重组质粒的酶切鉴定：
将待测阳性菌落进行扩培，用SDS碱裂解法进行质粒DNA的提取，通过酶切分析对阳性重组子进行最终确认。
构建质粒的步骤
构建质粒的步骤 构建质粒是一种重要的实验技术，用于在细菌或其他生物体中携带和复制外源DNA。下面将介绍构建质粒的步骤。 1. 选择质粒载体：首先需要选择适合的质粒载体。质粒载体是一种环状DNA分子，可以自主复制并在宿主细胞中表达外源基因。常用的质粒载体有pUC18、pBR322等。选择适合的质粒载体需要考虑载体大小、复制起点、抗生素抗性基因等因素。 2. 获得外源DNA片段：外源DNA片段可以是来自其他生物体的DNA序列，也可以是人工合成的。获得外源DNA片段的方法有PCR扩增、限制性内切酶切割等。 3. 切割质粒和外源DNA：使用限制性内切酶将质粒和外源DNA切割成互补的黏性末端。确保切割后的DNA末端与质粒载体互补，以便进行连接。 4. 连接质粒和外源DNA：通过DNA连接酶将切割后的质粒和外源DNA连接起来，形成重组质粒。连接时需要考虑连接缓冲液的条件和酶的适宜温度。 5. 转化宿主细胞：将重组质粒导入宿主细胞中，使其能够复制和表达外源基因。常用的转化方法有热激转化、电击转化等。转化后，需要在含有抗生素的培养基上筛选出含有质粒的转化子。
6. 确认质粒的构建：通过PCR扩增、限制性内切酶切割或测序等方法，确认质粒是否成功构建，并验证外源基因是否正确插入。 7. 大规模培养质粒：如果质粒构建成功，可以进行大规模培养，以获得足够的质粒量。培养条件需要根据质粒载体的特性进行调整。 8. 提取质粒：使用质粒提取试剂盒等方法，从大规模培养的细菌中提取质粒。提取的质粒可以用于进一步的实验研究或应用。 通过以上步骤，就可以成功构建质粒。构建质粒是分子生物学研究中常用的技术手段，可以用于基因克隆、基因表达、基因敲除等研究中。同时，构建质粒也是基因工程和生物工程的重要基础。
质粒载体构建
附录A 表达载体的构建 1、大肠杆菌质粒DNA的提取（SDS碱裂解法） 该方法参照分子克隆指南的方法修订而成。 细胞的制备 (1) 将2ml含相应抗生素的LB培养基加入到容量为15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜。 (2) 将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以最大转速离心30s，将剩余的培养物贮存于4℃。 (3) 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 细胞的裂解 (4) 将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的碱裂解液I中，剧烈振荡。 (5) 加200μl新配制的碱裂解液Ⅱ于每管细菌悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与碱裂解液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。 (6) 加150μl用冰预冷的碱裂解液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5min。 (7) 用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，将上清转移到另一离心管中。 (8) 加等量体积的氯仿:异戊醇（24:1），振荡混合有机相和水相，然后用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，将上清转移到另一离心管中。 质粒DNA的回收 (9) 用2倍体积的乙醇于室温沉淀核酸。振荡混合，于室温放置2min。 (10) 用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，收集沉淀的核酸。 (11) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除去。 (12) 加1ml 70%乙醇于沉淀中并将盖紧的离心管颠倒数次，用微量离心机于4℃以最大转速离心2min，回收DNA。 (13) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除去。 (14) 将开口的离心管置于室温使酒精挥发，直至离心管内没有可见的液体存在（5-10min）。
质粒载体的构建
质粒载体的构建 摘要：质粒载体的构建。首先要获得目的DNA。根据其目的基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次PCR的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到T-DNA上，再利用电转化的方法将连接产物转化到带有PCAMBIA1381的DH5α感受态细胞中复制表达。 关键词：质粒DNA PCR 电泳感受态转化 1.引言 质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下： ①是染色质外的双链共价闭合环形DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而 传给后代。 ③质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的 特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。 所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。
质粒载体pBR322是研究得最多，是使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。 质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。 质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。 构建质粒载体所用的方法基本上是分子克隆技术，是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 2. 材料方法 2.1目的DNA的获得 2.1.1 引物设计 第一次引物设计： 正向引物：sinn3F 冰盒标注：P2a 引物序列：5’—AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’ 引物长度：25bp 反向引物：sinn3R 冰盒标注：P2b 引物序列：5’—GCAAGAGCGTCGTTTGTAGTTA—3’ 引物长度：22bp
两大方法帮你搞定质粒构建
两大方法帮你搞定质粒构建 质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA 连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA 进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 质粒构建方式多样，常规的T4 连接酶，以及最近更受欢迎的重组酶方式。下面小编就总结一下T4 连接酶与重组酶构建质粒方法，通过比较，其最大的不同点可能在于目的基因的设计以及连接体系。 壹 一. T4 DNA Ligase 即T4 DNA 连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA 或RNA 的5’-P 末端和3’-OH 末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP 作为辅助因子。 1. 质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。 [可选酶切体系]VECTOR 3 ug CutSmart Buffer 5 ul限制性内切酶1 1 ul限制性内切酶 2 1 ul 酶切体系一般选择50ul，试剂加好之后37°C 孵育6~8 小
时，或适当延长时间，保证质粒酶切完全。每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切后载体通过切胶回收线性化载体。 2.根据目的序列构建引物后，引物设计原则简单总结一下: （1）前向引物：5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶1 酶切位点序列+基因正向引物序列-3’ 端 （2）反向引物：5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶2 酶切位点序列+基因反向引物序列-3 ’端 如果目的基因片段较长的话，可以选择PCR 方式扩增目的基因片段 [可选PCR 扩增体系]ddH2O：14ul10xTaq buffer：2ul10um DNTP：1ul10um primer F：0.5ul10um primer R：0.5ul模板DNA：1ulTaq 酶：1ul [可选PCR 扩增条件](1)95℃：5min(2) 35cycle 95℃：30s 55℃：30s（退火温度可以根据目的引物TM值决定，一般退火温度根据引物TM值降低5度）72℃：40s(3)72℃：10min(4)16℃：hold 引物扩增之后，首先要进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，然后通过胶回收，获得纯化目的片段产物.由于加入保护碱基，回收产物需要进行双酶切，双酶切方法与质粒酶切方法相同。 3. 载体与目的基因的连接，推荐在10~20μl 反应体系中进行接反应。
基因工程中的质粒设计与构建
基因工程中的质粒设计与构建当人类探索并掌握了基因科学领域，基因工程技术的实际应用变得越来越广泛，尤其是在生物医药领域，基因工程技术已成为了一项重要的技术手段。在基因工程技术中，质粒是一种不可或缺的载体，而质粒的设计和构建则是基因工程实践的重要环节之一。 一、质粒在基因工程中的作用 质粒是一种小圆形的DNA分子，通常由非常小的植细物或细菌细胞所含有，而对基因工程来说，质粒更是重要的载体。它们可被用于将外源基因移入细胞中，或在基因敲除、基因编辑等技术中发挥重要作用。 质粒可以被看做是一个基因工程中常用的“工具箱”，其中包含了许多有用的物质如选择性抗生素等，来方便利用选定的细胞或生物体。通过设计和构建质粒，人们可以对细胞内的基因进行精确地操纵和控制，这使得基因工程技术得以在生产和研究领域中发挥重要作用。
二、基因工程中的质粒设计 为了让质粒能够承载特定基因，创造有利于新元件导入的环境，人们开始研究和设计不同类型的质粒。质粒的设计和构建要经过 以下几个步骤： 1.确定载体的基本框架 对于基本的质粒框架设计，一个常见的方式就是选择E.coli作 为应用的背景细胞，并选择广泛用于质粒构建的控制元件；人们 还会合理设计质粒拓扑，进一步保证基因的表达和稳定性。 2. 基因表达的要求 针对目标基因的具体表达要求，人们需要进行一系列的设计， 包括选择启动子、终止子、启动子及调节元件等，以便达到优化 的表达效果。此外，在设计质粒时还要考虑是否需要进行特定的 基因剪切、扫描和编辑，来保证目标基因在质粒载体内的完美表现。
3. 注意质粒的选择性抗性 在质粒设计向具体实施转化的过程中，人们需要关注质粒的选择性抗性。即细胞生长时，质粒能够担负有选择性抗生素等物质的作用，将其从已过滤掉的非基因工程细胞中分离出来。 三、基因工程中的质粒构建 质粒构建是基因工程中的一个重要环节，其意义在于获得满足特定需求的质粒载体，并且将其进一步整理清洗，以确保其在应用、储存和分配中的稳定性和可靠性。 基于质粒载体的设计要求，质粒构建包括以下几个步骤： 1.基因片段克隆 在质粒构建的实现中，需要克隆所需基因片段，并将其转移到特定的质粒载体中。
质粒构建全过程范文
质粒构建全过程范文 质粒构建是分子生物学实验中的一项重要技术，用于将目标基因插入到质粒中，进而导入到宿主细胞中。下面将详细介绍质粒构建的全过程。 第一步：设计引物 在质粒构建之前，需要设计引物，包括引物序列的选择和设计。引物是用于在PCR反应中扩增目标基因的特定序列。引物的选择应考虑到目标基因的特点，如长度、GC含量、互补性及其它特异性需求。 第二步：PCR扩增目标基因 通过PCR反应扩增目标基因，此过程中，使用上一步设计的引物。PCR反应的条件和周期取决于目标基因的特点，如长度和GC含量。扩增后的DNA片段可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。 第三步：准备载体质粒 选择一个合适的载体质粒，根据实验需求选择质粒的构型、大小及适用宿主细胞。将质粒提取并进行消毒处理，以去除可能的污染物。 第四步：限制性内切酶切质粒与目标基因 通过在特定位点使用限制性内切酶切割载体质粒和PCR扩增得到的目标基因，以生成互补的黏性末端。 第五步：连接目标基因与载体质粒 将切割后的载体质粒与目标基因进行连接。此时，两者的黏性末端会互相连接，形成短暂的连接体。可以使用连接酶、盐溶液等辅助物质来增强连接效果。连接后的质粒可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。
第六步：转化宿主细胞 将连接后的质粒转化到宿主细胞中，以使宿主细胞具有新质粒。转化的方法有多种，包括化学法、电渗透法、热冲击法等。选择合适的转化方法要考虑到宿主细胞的特点。 第七步：宿主细胞筛选与鉴定 转化完成后，宿主细胞需要进行筛选与鉴定。一般来说，可以利用抗生素抗性基因选择含有质粒的细胞。通过培养在含有抗生素的培养基上，只有含有质粒的细胞能够生长。 第八步：验证目标基因的插入 通过PCR扩增或测序等方法验证目标基因是否成功插入到质粒中，并且在宿主细胞中表达。可以使用特异性引物扩增目标基因，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。测序可以进一步验证目标基因的正确性。 第九步：扩增检测阳性菌落 通过原核培养使阳性菌落扩增，以获得足够大量的质粒实验使用。 以上便是质粒构建的全过程。质粒构建是分子生物学实验中常用的技术，通过将目标基因插入到质粒中，并转化到宿主细胞中，可以实现基因的表达和功能的研究。这个过程需要精确的实验设计和操作，同时要保证构建的质粒在宿主细胞中的稳定性和可重复性。
基因敲除质粒构建
基因敲除质粒构建 基因敲除是研究基因功能的重要手段之一。质粒构建作为基因敲除的前提，是实现此技术的关键一步。本文将介绍基因敲除质粒构建的步骤和方法，以期为相关研究提供帮助。 一、基因敲除质粒构建的原理 基因敲除质粒是一种用于将特定基因拷贝从细胞中移除的DNA工具。它由敲除目标基因所需的关键片段和相应的启动子、终止子以及标记基因等组成。通过将这些DNA片段合成并插入到质粒载体中，制备出具有特定功能的基因敲除质粒。 二、基因敲除质粒构建的步骤 1. 目标基因序列分析：首先，需要准确定位目标基因的序列，并对其进行详细的分析。这包括识别编码区域和重要功能区域，确定敲除目标。 2. 质粒载体选择：选择合适的质粒载体用于构建基因敲除质粒。质粒载体应包含复制起始子、选择标记基因、抗生素抗性基因等。一般来说，pUC、pBluescript等常用质粒载体都可以作为基因敲除质粒的载体。 3. 扩增目标基因片段：通过PCR扩增得到目标基因片段。根据目标基因的序列设计引物，利用PCR扩增技术在基因组DNA上扩增出目标基因的特定片段。
4.连接和克隆：将扩增得到的目标基因片段与质粒载体进行连接和 克隆。这可以通过DNA连接酶的作用在目标基因片段的末端与质粒载 体的末端进行连接。 5. 转化和筛选：将连接好的质粒转化到宿主细胞中，通过抗生素筛 选等方法，筛选出含有目标基因敲除质粒的细胞克隆。 6. 确认和验证：通过PCR扩增、限制酶切等方法对细胞克隆进行 确认和验证，确保所构建的基因敲除质粒的正确性和稳定性。 三、基因敲除质粒构建的相关技术 1. PCR技术：PCR技术是基因敲除质粒构建中的核心技术之一。它 可以高效、特异地扩增目标基因片段，为后续的克隆和验证提供基础。 2. DNA连接酶：DNA连接酶是在基因敲除质粒构建中起到关键作 用的酶。它能够将目标基因片段与质粒载体的末端连接起来，形成完 整的基因敲除质粒。 3. 细胞转化和筛选：细胞转化和筛选是基因敲除质粒构建中的关键 步骤。它包括将连接好的质粒转化到宿主细胞中，并通过对细胞进行 抗生素筛选等方法，筛选出包含目标基因敲除质粒的细胞克隆。 四、基因敲除质粒构建的应用 基因敲除质粒构建技术在生命科学研究中有着广泛的应用。它可以 帮助研究人员深入了解基因的功能和作用机制，对于揭示疾病发生发 展的分子机制、药物研发等方面有着重要的意义。
质粒载体的操作和cDNA文库的构建
（一）细菌培养物的生长 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DNA。然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。 （二）细菌的收获和裂解 细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。 1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。 2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。 3)一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。 4)当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提)可以避免此问题。 ５)目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。(三)质粒DNA的纯化 常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分
质粒构建注意事项
质粒构建注意事项 质粒构建是一种常用的分子生物学技术，用于将特定DNA序列插入质粒中，并通过转染等方法引入到目标细胞中。质粒构建需要注意许多方面的因素，以确保构建的成功和高效性。以下是质粒构建的一些主要注意事项。 1. 选择适当的质粒载体：选择适合实验需求的质粒载体非常重要。质粒载体应该具有合适的大小、来源和特定的有效启动子、选择性标记物等，以满足实验要求。 2. 选择正确的限制酶：限制酶用于切割DNA序列，提供黏性末端，从而实现目标DNA序列的插入。选择适当的限制酶是质粒构建的关键步骤。要考虑限制酶切位点的数目和位置，确保目标序列的正确插入。 3. 合成或提取目标DNA序列：目标DNA序列可以通过化学或生物合成的方法获得，也可以从已知来源中提取。合成DNA序列时需要根据质粒载体的长度和需求进行优化，并考虑到靶标DNA序列的引物设计、序列纯化等方面的因素。 4. 选择合适的连接方式：插入DNA序列和质粒载体的连接方式有多种，如内切酶消化连接、PCR扩增连接等。选择合适的连接方式可以减少不必要的连接失败和背景。 5. 考虑相关启动子和报告基因：在质粒构建中，为了确保插入DNA序列可以正
常表达，可以选择适当的启动子来驱动目标基因的转录。同时，可以在质粒中添加报告基因，以便在转染后检测转染效率和表达情况。 6. 使用无菌技术：在质粒构建过程中，应注意使用无菌技术，以防止外源DNA 的污染。所有操作应在洁净实验室中进行，并使用消毒剂处理实验器具，避免细菌和真菌的感染。 7. 分子鉴定和纯化：完成质粒构建后，通过酶切鉴定、PCR扩增、测序等方法进行质粒鉴定，确认是否成功插入目标DNA序列。同时，可以通过DNA凝胶电泳和质粒提取等方法纯化目标质粒。 8. 选择合适的细胞染色体导入方式：质粒构建完成后，需要将其导入到目标细胞中。可以选择不同的方法，如热冲击法、电穿孔法、化学转染法等。根据实验目的选择合适的方法，并进行优化，以提高质粒转染效率。 9. 质粒稳定性检测和维持：质粒在细胞中的稳定性对于后续实验的成功非常重要。可以通过产品筛选、抗生素筛选等方法，筛选出稳定的质粒细胞系。同时，在培养细胞时，要注意维持适当的培养条件，以保持质粒的稳定性。 10. 注意实验室安全：在质粒构建实验中，应注意实验室安全，遵守操作规范。使用刀具、化学试剂和放射性物质时要小心，确保实验人员的安全。
质粒构建的原理及方法
质粒构建的原理及方法 质粒构建的原理及方法是指通过研究DNA片段的特征，以及其在生物学实验中的复制、表达、合成和移植的原理及方法，来构建质粒。质粒是一类由DNA片段组成的可重复使用的基因工程载体，用于转移和表达外源基因，广泛应用于基因工程和生物技术研究中。 质粒构建的原理主要是根据DNA片段的周期性结构形成的，即质粒的结构是由DNA片段组成的，而不是其他的物质。在质粒构建中，首先要明确需要构建的质粒的目的和功能，然后根据此目的和功能，从DNA片段库中选择合适的片段，将其组装成质粒，以达到预期的效果。 质粒构建的方法有几种，常用的有PCR扩增法、等位子构筑法、同源克隆法和限制性内切酶构建法等。 1 PCR扩增法：PCR扩增法是一种用于构建质粒的有效方法，其原理是利用特定酶，如Taq DNA聚合酶，对DNA 片段进行反复扩增，从而获得大量的DNA片段。该方法的优点是快速、灵敏，可以构建任意大小的质粒，但也有一定的缺点，例如扩增的精确性和准确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。 2 等位子构建法：等位子构建法是指在特定的位置插入预先准备好的DNA片段，即将DNA片段配对到等位子
上，从而构建质粒。该方法的优点是可以以高精度构建质粒，精度可达99.9%，但是缺点是时间较长，构建大型质粒时耗时较长。 3 同源克隆法：同源克隆法是指将DNA片段插入到一种特定的质粒中，从而形成新的质粒。该方法的优点是可以用于构建任意大小的质粒，但缺点是构建的质粒的精确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。 4 限制性内切酶构建法：限制性内切酶构建法是指将DNA片段插入到限制性内切酶识别序列中，从而形成质粒。该方法的优点是可以快速构建质粒，而且可以构建任意大小的质粒，但缺点是质粒的精确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。 以上就是质粒构建的原理及方法，质粒构建的方法也不断发展壮大，未来还有可能推出更多的质粒构建方法，以满足更多的应用需求。
甲基化质粒构建
甲基化质粒构建 甲基化质粒构建是基因治疗中的重要环节，其目的是将目的基因插入甲基化质粒载体中，以保护目的基因免受宿主细胞免疫系统的攻击。本文将介绍甲基化质粒构建的七个方面。 1.目的基因获得 目的基因可以通过基因文库、PCR、人工合成等方式获得。这些方法都可以得到目的基因的DNA序列，但需要对其表达量和纯度进行鉴定。 2.甲基化酶切位点添加 为了将目的基因插入甲基化质粒载体中，需要在目的基因和载体中添加适当的甲基化酶切位点。这些位点可以是一些特定的酶切位点，如SacⅠ、KpnⅠ、EcoRⅠ等。添加这些位点可以通过一些基因工程手段实现，如通过DNA重组技术将甲基化酶切位点序列添加到目的基因和载体中。 3.甲基化质粒载体构建 甲基化质粒载体是携带甲基化酶切位点的质粒，可以将目的基因运送到宿主细胞中。构建甲基化质粒载体的方法包括将甲基化酶切位点插入到质粒载体的合适位置，并保证其稳定性和可复制性。插入位点应该选择多拷贝数和高转录效率的位点，以保证目的基因的高效表达。 4.目的基因与甲基化质粒载体酶切后连接 将目的基因与甲基化质粒载体进行酶切后，可以使用DNA连接酶
将它们连接起来。这一步骤需要选择合适的连接方式，如通过T4DNA 连接酶进行连接。同时，连接过程中需要注意温度、pH值、离子浓度等参数，以保证连接的效率和稳定性。 5.连接产物转化 连接产物需要在受体细胞中进行转化，以得到甲基化阳性克隆。转化方法可以是有丝分裂转化或电转化，其中电转化效率较高。在进行转化时，需要选择合适的受体细胞，如大肠杆菌、酵母等。同时，需要对受体细胞进行筛选，以得到含有目的基因的阳性克隆。 6.甲基化阳性克隆筛选 甲基化阳性克隆是指含有目的基因并且具有甲基化酶切位点的克隆。筛选这些阳性克隆可以通过一些分子生物学技术，如PCR、DNA 测序等。初步筛选可以找到一些阳性克隆，但为了确保目的基因的稳定表达和正确甲基化，需要进行进一步鉴定。 7.甲基化质粒大量制备 在得到甲基化阳性克隆后，需要进行大量制备以满足后续实验或应用的需求。制备过程需要选择合适的培养基和培养条件，以保证细菌的快速生长和质粒的大量合成。制备完成后，需要对质粒进行抽提和纯化，以去除杂质和细菌蛋白等物质。最后，需要对质粒的质量进行评估，包括纯度、浓度和酶切活性等方面。 总之，甲基化质粒构建需要经过多个步骤和环节，包括目的基因获得、甲基化酶切位点添加、甲基化质粒载体构建、目的基因与甲基化质粒载体酶切后连接、连接产物转化、甲基化阳性克隆筛选以及甲
过表达质粒构建原理
过表达质粒构建原理 一、目的基因获取 过表达质粒构建的第一步是获取目的基因。目的基因通常是从基因文库、PCR扩增或者人工合成等方法中获得。确保目的基因序列的准确性是至关重要的，因为任何突变都可能影响后续的表达结果。 二、载体质粒选择 选择适当的载体是构建成功的关键。常用的载体有质粒、病毒载体等。在选择载体时，应考虑其容量、复制能力、插入位点等因素，以确保目的基因能够高效地导入宿主细胞并稳定表达。 三、限制性内切酶处理 限制性内切酶是一种特异性切割DNA的酶，用于在目的基因和载体质粒上产生相同的黏性末端，以便进行接下来的连接反应。选择适当的限制性内切酶，并控制其切割时间，可以确保目的基因和载体质粒的准确切割。
四、连接反应 连接反应是将目的基因和载体质粒结合的过程，通常在DNA连接酶的作用下完成。在连接反应中，需要控制反应条件，以确保目的基因和载体质粒的正确结合。连接后的产物称为重组质粒。 五、转化宿主细胞 重组质粒需要导入宿主细胞中进行表达。选择合适的宿主细胞，如细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞等，根据宿主细胞的特性，采用适当的转化方法，如电穿孔、化学转化或转染等，将重组质粒导入宿主细胞。 六、筛选与鉴定 转化后的宿主细胞需要进行筛选和鉴定，以确定是否存在重组质粒。通过抗性筛选、PCR鉴定或DNA测序等方法，可以初步筛选出含有目的基因的重组质粒。进一步通过表达产物检测和稳定性检测等手段，对重组质粒进行全面鉴定。 七、表达产物检测 表达产物检测是验证目的基因是否成功表达的重要步
骤。通过Western blot、免疫荧光或酶联免疫等检测方法，可以对重组质粒的表达产物进行定量和定性分析。比较表达前后的蛋白质变化，以评估过表达的效果。 八、稳定性检测 稳定性检测是为了评估重组质粒在宿主细胞内的稳定性。在细胞培养过程中，对目的基因的表达进行定期检测，观察其在不同传代过程中的表达水平变化。稳定性良好的过表达质粒能够在多次传代后仍保持稳定的表达水平。
腺病毒质粒载体的构建及表达调控机制研究
腺病毒质粒载体的构建及表达调控机制研究第一章引言 腺病毒是一种广泛应用于基因治疗和基因表达的载体，由于其病毒自身不具有致病性，可以更安全地应用于临床治疗和药物研发。腺病毒载体的构建和表达调控机制的研究是基因治疗和药物研发领域的热点问题。本文将从腺病毒质粒载体的构建方法、载体的表达调控机制、及应用前景等方面进行探讨。 第二章腺病毒质粒载体的构建方法 腺病毒的质粒载体构建需要遵循一定的规律和原则，以确保载体的高效性和稳定性。现将常用的腺病毒质粒载体构建方法进行简要介绍： 2.1 插入式构建法 插入式构建法是最常用的构建方法之一，其基本原理是将外源基因片段插入到腺病毒质粒载体中，再通过体外转染等方法将整个质粒导入到细胞内进行转染。插入式构建法具有构建简便、转染效能高、适用性强等优点。但由于插入的外源基因片段较长且载体承载能力有限，仅适用于小分子基因的插入。 2.2 重组式质粒构建法
重组式质粒构建法是从腺病毒DNA中特异性截取相应序列， 并将其与外源基因片段重组形成新的质粒载体。重组式质粒构建 法具有高效性、稳定性等优点，能够承载大分子基因片段的插入。但构建难度较大，需要较为专业的技术支持。 2.3 克隆式质粒构建法 克隆式质粒构建法是将腺病毒基因组进行克隆，这种方法能够 在保持病毒活性的前提下获得高效的转染效果和稳定性。克隆式 质粒构建法适用于需要经常进行高效转染以及灭活性病毒的构建，但需要高超的实验技能和完善的实验设备。 第三章腺病毒质粒载体的表达调控机制 腺病毒质粒载体的表达调控机制是基因治疗和药物研发领域的 重要问题之一。本章将从内在调节和外部控制两个方面进行介绍。 3.1 内在调节 内在调节是指在腺病毒质粒载体表达阶段，利用载体本身的启 动子、基因调节元件等进行调节。常用的内在调节方法有以下几种： 3.1.1 CMV启动子调节
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤 载体构建是分子生物学研究中不可或缺的过程，它涉及到将目标基因或蛋白质 序列移植到不同的载体中，以便扩大其表达量、纯化和研究。本文将介绍载体构建的基本步骤，包括质粒的选择、PCR扩增、连接和转化等过程。 质粒的选择 质粒是最常用的载体类型之一，具有很多优点，如易于扩增、转化和操纵等。 在选择质粒时，需要考虑以下几个方面： 1. 质粒大小和拷贝数 质粒的大小和拷贝数会影响其扩增和表达，选择适当大小和拷贝数的质粒可以 提高表达效率。 2. 基因水平选择标记 质粒中常含有基因水平选择标记，如抗生素耐药基因等。在构建载体时需要选 择合适的标记，以便快速筛选到表达了目标基因的细胞。 3. 表达宿主 质粒可以在不同的宿主中表达，选择合适的表达宿主可以提高表达效率和纯度。常见的表达宿主包括大肠杆菌、酵母等。 PCR扩增 PCR扩增是将目标序列扩增为质粒中适当长度的过程。在进行PCR扩增之前，需要准备以下试剂和设备： •Taq DNA聚合酶 •原始模板DNA •引物 •正向引物和反向引物 •dNTP混合物 •PCR缓冲溶液 在PCR扩增中，需要设置合适的反应体系和程序。常见的PCR反应条件为：•94℃，5 min：初始变性 •94℃，30 s：变性 •50-60℃，30 s：退火
•72℃，1 min/kb：延伸 •72℃，7 min：最终延伸 连接 连接是将PCR扩增产物与质粒DNA连接的过程。连接反应需要用到T4 DNA 连接酶和DNA PCR产品凝胶提取试剂盒等试剂，具体操作步骤如下： 1.将PCR扩增产物切割至合适长度。 2.提取PCR产物，并使用DNA PCR产品凝胶提取试剂盒纯化。 3.连接酶在37℃下反应数小时。 4.连接反应后，在大肠杆菌中进行转化。 转化 转化是将连接成功的PCR产物转化为大肠杆菌的过程。转化需要用到大肠杆菌、新鲜的LB培养基和适当的抗生素等试剂。常见的转化条件为：80-90秒高温热冲击，加入细胞后在37℃，250rpm振荡培养1小时后添加适宜浓度的抗生素进行 筛选。 以上就是载体构建的基本步骤，包括质粒选择、PCR扩增、连接和转化等过程。在实际的实验中，还需要注意质粒大小和拷贝数、基因水平选择标记、表达宿主的选择以及反应条件、试剂和设备的准备等。通过严格的操作、实验设计和数据分析，可以获得高表达和纯度的目标基因或蛋白质。
质粒构建流程
质粒构建流程 一、引物设计 1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI 2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1（+）, 4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。 5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。 6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。 7）引物设计完成，送公司合成。 二、目的片段获取 1.RNA提取 试剂盒：Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4°C、漂洗液RW -20°C保存）准备：冰盒、4°C预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA 一套 操作步骤： 1）将1000^1裂解液RL加入细胞中，混合5min。 2）加200山氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。 3）4°C, 12000rpm 离心10min。 4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550yl） 5）加入1倍体积（550山）70%乙醇，混匀 6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4°C, 10000rpm离心45s 7）弃废液，重套收集管，加500山去蛋白液RE，12000rpm离心45s 8）弃废液，重套收集管，加700山去漂洗液RW，12000rpm离心60s 9）弃废液，重套收集管，加500山去漂洗液RW，12000rpm离心60s 10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min 11）吸附柱放入新EP管，加50卩l RNase free water于膜上，室温放置2min 12）4C，12000rpm 离心60s 13）点样：5yl RNA+ 1山10X buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V, 3min，可见3条亮带。 14）-20C保存 2.RNA反转录 试剂盒：TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser （-20 C 保存） 准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管 操作步骤： 1）基因组DNA去除（10卩l体系） ② 5 X gDNA eraser buffer 2 pl ① gDNA eraser 1 pl Total RNA 4pl（可根据RNA浓度调整） ⑥ RNase free water 3 pl PCR仪中进行，程序：42°C, 2min—4°C 注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入 2）反转录反应（20pl体系） ④ 5 X primerScript buffer 2 4 pl ③primerScript RT enzyme mix I 1pl ⑤RT primer mix 1 pl
质粒构建
PCR（多聚酶链式反应） 一、实验原理 PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下： PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。 1、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形 成两条单链，即变性阶段。 2、退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合， 使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。 3、延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板， 在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）， 按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。 上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。 典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。 二、按下列组份配制PCR 反应液 TaKaRa LA Taq（5 U/μl）0.5 μl 10×LA PCR Buffer II（Mg2+ Plus） 5 μl dNTP Mixture（各2.5 mM）8 μl 模板DNA（λDNA）* 2.5 ng 引物1（10 μM） 2 μl
引物2（10 μM） 2 μl 灭菌蒸馏水up to 50 μl *【50 μl PCR反应体系中模板DNA 推荐使用量】 人基因组DNA 0.1 μg～1 μg 大肠杆菌基因组DNA 10 ng～100 ng λDNA 0.5 ng～5 ng 质粒DNA 0.1 ng～10 ng 三、PCR 反应条件。 以λDNA 为模板，扩增 1 kbp、35 kbp 的DNA片段的PCR 反应条件如下：【1 kbp】 95℃ 5 min. 95℃30 sec. 55℃30 sec. 35 Cycles 72℃ 1 min. 72℃10 min. 【35 kbp】 94℃ 5 min. 98℃10 sec. 68℃15 min. 35 Cycles 72℃10 min.