高三生物一轮 专题一 基因工程学案(无答案)

基因工程

考点解读

1、识记：基因工程的诞生、基因工程的原理及技术、基因工程的延伸（蛋白质工程）

2、理解：基因工程的应用

说明：本专题内容近年来一直为江苏高考所看重，命题出手很重，涉及到难以理解的以下几个问题，限制酶（一种或两种）对DNA 分子（线性或环状）的切割、拼接。在本专题的复习中，需要用心去体会。

基础知识回顾

1、基因工程的概念

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 和 ，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 水平上进行设计和施工的，因此又叫做 。 2、基因工程的分子手术刀 ①切割DNA 的工具是 ，作用于DNA 分子的什么部位？ ②这类酶在微生物体内的作用可能是什么？ ③由于这种切割作用是在DNA 分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶（简称限制酶）。这种酶作用的特点是：一种限制酶 。 ④DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段，末端通常有两种形式，即 和 。 3、分子缝合针

一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为coli E ?DNA 连接酶。coli E ?DNA 连接酶只能将 连接起来，不能将双链DNA 片段平末端之间进行连接。另一类是从 分离出来的，称为T 4DNA 连接酶。T 4DNA 连接酶既可以“缝合”双链DNA 片段互补的 ，又可以“缝合”双链DNA 片段的 ，但连接 之间的效率比较低。请比较

DNA 连接酶与DNA 聚合酶不同之处： 4、分子运输车

①基因操作过程中使用载体两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去（或停留在细胞中自我复制，或 ）；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制。

②现在通常使用的载体是 ，它是一种相对分子质量较小、独立于拟核DNA 之外的环状DNA ，有的细菌中有一个，有的细菌中有多个。 ③其他载体还有 和 等。有人认为线粒体也可以作为载体使用，究其原因，可以概括为

④作为载体必须具备以下条件：

能够在宿主细胞中 ，具有 个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有某些 ，便于进行筛选，如对抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。

还有一点值得强调，由于载体是携带外源基因进入受体细胞的，因此必须要保证运用的载体对 没有毒害作用。

5、目的基因的获取：

1．目的基因：符合人们需要的，编码蛋白质的 。 2．获取目的基因的方法

（1）从基因文库中获取目的基因

①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多 ，导人受体菌的群体中 ，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。

基因组文库：含有一种生物的 基因

②种类：

cDNA 文库：含有一种生物的 基因

③目的基因的获取

根据基因的有关信息：基因的 序列、基因在 上的位置、基因的 产物mRNA 、基因的 产物蛋白质等特性获取目的基因。 （2）利用PCR 技术扩增目的基因

（3）人工合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可以人工合成。 6、基因表达载体的构建（基因工程的核心步骤） 1．表达载体的组成：目的基因+ + +标记基因等。 2．启动子：位于基因的 ，它是 结合 的部位，驱动基因转录产生mRNA 。 3．终止子：位于基因的 ，终止 。

4．表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且 给下一代；使目的基因 ____ 和发挥作用。 5．标记基因： 受体细胞是否含有目的基因。

6．不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建上也会有所差别。 7、将目的基因导入受体细胞

（一）转化：目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和 的过程。 （二）方法

1．将目的基因导入植物细胞 （1）农杆菌转化法 ①农杆菌特点：易感染 植物和裸子植物，对___________植物没有感染力；Ti 质粒的 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。 ②转化：目的基因插人

??→?进入农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上

→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 （2）基因枪法

基因枪法：是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。 （3）花粉管通道法

这是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法。（我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的）

2．将目的基因导入动物细胞 （1）方法： 注射技术。 （2）操作程序：目的基因表达载体 →取卵（受精卵） →显微注射→注射了目的基因的受精卵移植到____性动物的 _____________________内发育→新性状动物。 3．将目的基因导人微生物细胞

（1）原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。 （2）转化： 处理细胞→ 细胞→表达载体与感受态细胞混合→ _________ 细胞吸收DNA 分子。 8、目的基因的检测与鉴定

①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入 。 ②检测目的基因是否转录 。 ③检测目的基因是否翻译成 。 ④除上述分子检测外，有时还需要进行 水平的鉴定，请举一例加以说明。

★易错警示（一）

1、限制酶是一类酶而不是一种酶

2、限制酶的成分是蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸、强碱均易使之变性失去活性

3、在切割目的基因和载体时一般要求使用同一种限制酶，目的是需要产生相同的黏性末端，但也存在这样一种现象，即用两种限制酶切割得到相同的可以互补配对的黏性末端。

4、将一个位于DNA分子内部的目的基因片段切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端，切下来的目的基因必须是完整的，为保证其完整性，不能使用目的基因片段上有识别切割位点的限制酶进行切割。

5、不同的DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。

6、限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，如果有两个或以上的标记基因，最低限度至少保留一个完整的标记基因，以便于检测。

7、基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。（想一想不同在哪里？提示：可从化学性质与作用方面考虑）

8、基因工程中有三种工具，但工具酶只有两种。

★易错警示（二）

1、目的基因的插入位点不是随意的。（应该插入的位点在哪里？为什么？）

2、基因工程操作过程中，有几个步骤是要严格遵循碱基互补配对原则的。（哪些步骤遵循碱基互补配对原则？分别遵循怎样的配对原则？）

3、基因工程中，常用的受体细胞可以是微生物细胞。（微生物细胞作为受体细胞有什么优点？如果要利用大肠杆菌和酵母菌产生人体胰岛素，应该选择什么？为什么？能不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为基因工程的受体细胞？为什么？）

4、限制酶切割问题：一般情况下，用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的片段，但有时也用两种限制酶分别切割质粒和目的基因。（相对于单酶切而言，双酶切优点是什么？）

5、基因表达载体中，启动子区别于起始密码，终止子区别于终止密码。（想一想，它们存在怎样的区别？）

6、获取目的基因的方法很多，可以从基因文库中获取，也可以利用PCR扩增，还可以通过化学方法人工合成。（如果目的基因的序列是已知的，应该使用什么方法获取？如果未知呢？）

9、基因治疗

（1）概念：把导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。（2）成果：将腺苷脱氢酶基因导入患者的淋巴细胞。

10、蛋白质工程崛起的缘由

（1）基因工程的实质：将一种生物的转移到另一处生物体内，后者产生它本不能产的，从而产生新性状。

（2）蛋白质工程目的：生产符合人们生活需要的并非自然界已存在的。

11、蛋白质工程基本原理

（1）目标：根据人们对功能的特定需求，对结构进行分析设计。

（2）原理：基因改造。

（3）过程：预期蛋白质功能→设计结构→推测应有序列→找到对应的序列（基因）。

（4）蛋白质工程在对蛋白质进行改造时，通常有三种情况，一是“大改”，即设计并制造出自然界中；二是“中改”，即在蛋白质分子中替代；三是“小改”，即改造蛋白质分子中某活性部位的一个或几个；但不论是那种情况的改造，最终改造的对象都是，因为蛋白质分子结构相对于DNA（基因）较为，难以实现，即或改造成功，被改造的蛋白质分子也不能。

思考：蛋白质工程需要用到基因工程的工具酶吗？

（5）比较：

项目蛋白质工程基因工程

过程

实质定向改造或生产人类所需的

定向改造生物

的，以获得人类所

需的生物类型或

区别

结果能生产出自然界中原本没有的蛋白质

联系蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，都必须通过对修饰或合成来实现

判一判：

1、我国的转基因抗虫棉转入的抗虫基因是Bt毒蛋白基因（）

2、利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中（）

3、由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用（）

4、为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体（）

5、目前，植物基因工程技术主要应用于提高农作物的抗逆性、生产某些天然药物、改良农作物的品质、作器官移植的供体（）

6、基因工程药物主要来源于转基因动物生产（）

★易错警示：

1、动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体

2、DNA分子作探针进行检测时应检测单链，即将待测双链DNA分子打开

3、Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性

4、基因治疗后，缺陷基因并没有因为正常基因的导入而被清除或改变。

5、理性看待转基因生物

优点缺点

解决粮食短缺问题可能出现新的过敏原或重组形成新病毒大大减少农药的用量，减少环境污染可能产生抗除草剂的杂草

增加食物营养，提高附加值可能使疾病的传播跨越物种障碍

增加食物种类，提升食品的品质可能会损害生物多样性

提高生产效率，带动相关产业发展可能会对人类生活环境造成二次污染

典题赏析

例1、苏云金杆菌（Bt）能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图（amp r为抗氨苄青霉素基因），据图回答下列问题：

（1）将图中①的DNA用HindⅢ、BamHⅠ完全酶切后，反应管中有种DNA片段。

（2）图中②表示 HindⅢ与BamHⅠ酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得种重组质粒；如果换用Bst l与BamHⅠ酶切，目的基因与质粒连接后可获得种重组质粒。

（3）目的基因插入质粒后，不能影响质粒的。

（4）图中③的Ti质粒调控合成的vir蛋白，可以协助带有目的基因的T—DNA导人植物细胞，并防止植物细胞中对T—DNA的降解。

（5）已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异受体，使细胞膜穿孔，肠细胞裂解，昆虫死亡。而该毒素蛋白对人类的风险相对较小，原因是人类肠上皮细胞。

（6）生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，其目的是降低害虫种群中的

基因频率的增长速率。

例2、下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，圈l、圈2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：

（1）一个图1所示的质粒分子经Sma Ⅰ切割前后，分别含有个游离的磷酸基团。

（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越。

（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SrnaⅠ切割，原因是。

（4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止。

（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入酶。

（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了。

（7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。

例3、请回答基因工程方面的问题：（1）利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞同DNA复制类似（如下图所示）。

图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。

①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。

②在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。

（2）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。

第1组： ；②第二组 。

（3）PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为 。

（4）用限制酶EcoR、MboⅠ单独或立命切割同一种质料，得到的DNAT片段长度如下图（1kb即1000个碱基对），请在答题卡的指定位置画出质料上EcoR、MboⅠ的切割位点。

例4、图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp Ⅰ、BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ、Sma Ⅰ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：

（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由连接。

（2）若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是末端，其产物中有种不同的DNA片段。

（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶Sma Ⅰ完全切割，产物中共有种不同DNA片段。

（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加的培养基进行培养。

（5）假设D基因是抗棉铃虫的Bt毒蛋白基因，将D基因转入棉花培养成转基因抗虫棉，如果和，即可分别在分子水平和个体水平上说明抗虫基因已成功表达。

例5、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防。疫苗的主要成分是该病毒的一种结构蛋白VPI。科学家尝试利用转基因番茄来生产口蹄疫疫苗，过程如下图1所示。图2表示目的基因与pZHZ1质粒构建重组质粒的过程，E、F、G、H分别为A、B、C、D四种不同限制酶的酶切位点。请据图回答。

（1）口蹄疫病毒的遗传物质为RNA，要获得VPI基因可通过方法获得。

（2）如图2所示，若限制酶A、B切割出的末端完全不同，那么用这种双酶切的方法构建重组质粒的优点是。

（3）已知质粒pZHZ1的长度为3．7kb，（1kb=1000对碱基）其中EF区域长度为0．2kb，GE区域长度为0．8kb，FH区域长度为0．5kb。现分别用限制酶C、D切割重组质粒pZHZ2样品，结果被酶C切割成1．6kb 和3．1kb两个片段，被酶D切割成1．2kb和3．5kb两个片段。据酶切结果判断VPI基因大小为

kb，并将目的基因内部的酶C、酶D切割位点用相应的字母标注在对应位置。

（4）过程⑥的培养基中除了加入各种必需营养物质和等激素外，还需要添加筛选出含有重组质粒的叶片小段。

（5）获得表达VPI蛋白的番茄植株以后，需要进行免疫效力的测定。具体方法是：将转基因番茄叶片提取液注射到豚鼠体内，每半个月注射一次，三次后检测豚鼠血液内产生的

的数量。

巩固练习

1、已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现在多个上述线性DNA 分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA 分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（）

A．3 B．4

C．9 D． 12

2、某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用限制性核酸内切酶a完全切割，再把得到的产物用限制性核酸内切酶b完全切割，得到的DNA片段大小如下表。限制性核酸内切酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关叙述错误的是（）

A．a酶与b酶切断的化学键相同

B．a酶和b酶切出的DNA片段不能相互连接

C．该DNA分子中a酶能识别的碱基序列有3个

D．仅用b酶切割该DNA分子可得到三种DNA片段

3、一对等位基因经某种限制性核酸内切酶切割后形成的DNA片段长度存在差异，用凝胶电泳的方法分离酶切后的DNA片段，并与探针杂交后可显示出不同的带谱。根据电泳所得到的不同带谱，可将这些DNA片段定位在基因组的某一位置上。现有一对夫妇生了四个孩子，其中Ⅱ4号个体患病。该家庭成员的基因经上述处理后得到的带谱如右图所示。据图分析，错误的是（）

A．该致病基因在常染色体上

B．Ⅱ1的致病基因来自于Ⅰ1，和Ⅰ2

C．Ⅱ3与Ⅰ1、Ⅰ2的基因型均相同

D．Ⅱ4号为纯合子的概率是1／3

4、下列有关酶的叙述，正确的是（）

A．限制酶和DNA连接酶均来自原核生物

B．限制酶和DNA连接酶均能识别特定的脱氧核苷酸序列

C．哺乳动物的精子释放的顶体酶能催化透明带反应

D．Taq酶只能将单个脱氧核苷酸连接到和DNA模板互补的多核苷酸链上

5、在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是（）

A．用限制性核酸内切酶切割烟草茶叶病毒的核酸

B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体

C．将重组DNA分子导入原生质体

D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞

6、现有一长度为3000碱基对（bp）的线性DNA分子，用限制性核酸内切酶酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图l。用酶B单独酶切，结果如图2。用酶H和酶B同时酶切，结果如图3。该DNA分子的结构及其酶切图谱是（）

7、基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC— ，限制酶II的识别序列和切点是—↓GATC—。根据图示判断下列操作正确的是（）

A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割

B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割

C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割

D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割

8、2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白“的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是

A．追踪目的基因在细胞内的复制过程（）

B．追踪目的基因插入到染色体上的位置

C．追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布

D．追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构

9、下表有关基因表达的选项中，不可能的是

基因表达的细胞表达产物

A 细菌抗虫蛋白基因抗虫棉叶肉细胞细菌抗虫蛋白

B 人酪氨酸酶基因正常人皮肤细胞人酪氨酸酶

C 动物胰岛素基因大肠杆菌工程菌细胞动物胰岛素

D 兔血红蛋白基因兔成熟红细胞兔血红蛋白

10、探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段，可用于核酸

分子杂交以检测目标核苷酸序列是否存在。下图一是某实验小组制备的两种探针，图二是探针与目的基因

杂交的示意图。请回答下列有关问题：

（1）核酸探针与目标核苷酸序列间的分子杂交遵循______的原则。设计核苷酸序列是核酸探针技术关键

步骤之一。图一所示的两种核酸探针（探针2只标注了部分碱基序列）都不合理，请分别说明理由

______、______。

（2）cDNA探针是目前应用最为广泛的一种探针。制备cDNA探针时，首先需提取、分离获得______作为模

板，在______的催化下合成cDNA探针。利用制备好的β—珠蛋白基因的cDNA探针与β-珠蛋白基因杂交

后，出现了如图二中甲、乙、丙、丁等所示的“发夹结构”，原因是______。

11、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄目动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防。此疫苗的

主要成分是该病毒的一种结构蛋白VPI。科学家尝试利用转基因番茄来生产口蹄疫疫苗，过程如下图所示。

请据图回答。

（1）口蹄疫病毒的VPI蛋白在免疫反应中称之为 ；口蹄疫基因在植物体细胞中也能表达出相

同产物的原因是 。

（2）过程⑥的培养基中除了加入各种必需营养物质和植物激素外，还需要添加卡那霉素以便筛选出含有 的叶片小段。

（3）在制作含有VPI基因的表达载体时，所选用的载体中有限制酶E、F,G、H的切点各一个。若用两种识

别切割序列完全不同的限制酶E和F从含有VPI目的基因的DNA上进行切割，并将之取代质粒pZHZ1（3．7kb，

lkb＝1000对碱基）上相应的E—F区域（0．2kb），图解如下图2。若再用限制酶G和H各切割一份重组质粒pZHZ2

样品，酶切结果如表1所示，试判断VPI目的基因的大小为 kb，酶G和酶H都能将重组质粒切割出

两段的原因是

。

（4）获得表达VPI蛋白的番茄植株以后，需要进行免疫效力的测定。具体方法是：将转基因番茄叶片提取液注射到豚鼠体内，每半个月注射一次，三次后检测豚鼠血液内产生的的量。为了使相应的结论可信，应增设两个对照组，分别注射和。

12、构建基因文库是获取目的基因的方法之一。下图甲表示cDNA（互补DNA）文库构建过程，其中①～③表示有关操作步骤。下图乙表示用限制酶PstI、EcoRI和SalI单独或联合切割图甲中的质粒DNA分子，经凝胶电泳分离后所得到的图谱。请据图回答下列有关问题：

（1）设计引物是cDNA（互补DNA）文库构建过程的第一步，引物长度一般在15-30个碱基之间，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。若引物过短则存在等问题。

（2）图甲过程②、③分别需要在、酶的作用下形成cDNA的第一条链、第二条链，这两个过程都需要利用作为原料。

（3）在⑤和⑦过程中cDNA和质粒DNA的3’端都要各加上一段寡聚核苷酸（20个以下碱基的核苷酸短链），制成；过程⑧在DNA连接酶的作用下，形成重组DNA。图示这种情况下能形成种重组DNA，理由是。

13、下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。

资料1：巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达【5’AOX1和3’AOX1（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子】。

资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其

与目的

基因形

成的重

组质粒

经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上、限制酶识别序列，这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。

（2）酶切获取HBsAg基因后，需用将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取。

（3）步骤3中应选用限制酶来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。

（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用方法进行检测。

（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。

（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行并分泌到细胞外，便于提取。

14、普通棉花中含β-甘露糖苷酶基因（GhMnaA2），能在纤维细胞中特异性表达，产生的β-甘露糖苷酶催化半纤维素降解，棉纤维长度变短。为了培育新的棉花品种，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体，利用农杆菌转化法导入棉花细胞，成功获得转基因棉花品种，具体过程如下。请分析回答：

（1）①和②过程中所用的限制性内切酶分别是、。

（2）基因表达载体除了图示组成外，至少还有 等（至少答两个）。（3）③过程中用酶切法可鉴定正、反义表达载体。用SmaⅠ酶和NotⅠ酶切正义基因表达载体获得0．05kb、3．25kb、5．95kb、9．45kb四种长度的DNA片段，则用NotⅠ酶切反义基因表达载体获得DNA 片段的长度应是　和　。

（4）④过程中利用农杆菌介导转化棉花细胞的过程中，整合到棉花细胞染色体DNA的区段是，转化后的细胞再通过形成植物体。

（5）导入细胞内的反义GhMnaA2转录的mRNA能与细胞内的GhMnaA2转录的mRNA互补配对，从而抑制基因的表达，其意义是。