聚合酶链式反应的由来

聚合酶链式反应的不寻常起源

制作DNA片段无限复制的一个令人惊讶的简单的方法是在不可能的情境下被构思出来的——在月光照耀下驾车行驶穿过加利福尼亚的山脉期间

Kary B. Mullis著

有时当你不去寻找好主意的时候，它自会来找你。通过巧合，天真和幸运的错误这样一个不太可能的组合，这样一个意外的发现在1983年4月的一个星期五的晚上到来了，当我握着我的车的方向盘，在月光的沐浴下沿着山路行驶进加利福尼亚的红杉国家。这就是我如何偶然发现了一个可以无限复制基因副本，而现在被称为聚合酶链式反应（PCR）的过程。
从遗传物质DNA的单个分子开始，PCR可以在一个下午产生一千亿个相似分子。该反应是很容易执行的：它需要的只是一个试管，一些简单的试剂和一个热源。想要复制的DNA样品可以使纯的，也可以是一个极其复杂的生物材料混合物的一小部分。DNA可能来自于一个医院的组织标本，或来自于人的一根头发，或来自于犯罪现场的一滴干血，或来自于一个木乃伊的大脑组织，也或者来自于一头被冻结于冰川的40000岁的猛犸象。
自那个夜晚的七年以来，PCR的应用已迅速遍及生物科学：关于它的使用的报告已经出版了1000多份了。考虑到PCR在生物学研究上的影响以及其简单的概念，而事实上它将无法辨识超过15年后的所有元素，这离奇的事情将可能打击到许多观察者。
聚合酶链式反应让分子生物学家生活更为容易：它使他们尽可能多的得到他们想要的特定的DNA。休想讨论DNA分子有时会令他们听起来得到目标产物是很容易的事。事实是，在实践中从任何生物除了非常简单的病毒中找到一个已知天然DNA分子是很难的。
分子的性质是最困难的。DNA是由四种脱氧核苷酸构成的细链：脱氧腺苷酸（A），脱氧胸苷酸（T），脱氧鸟苷酸（G）和脱氧胞苷酸（C）；这些碱基序列编码遗传信息。很少找到一个单链DNA；通常对链互补序列形成双螺旋，其上一条链上的A与另一条链上T连结和一条链上的G与另一条链上的C连结。[见右页的图解]。在细胞内DNA螺旋被各种蛋白质包围并进一步盘绕。当生物学家试图分离一条DNA裸链时，DNA如此长和薄，以至于沿其长度在任意点用轻微剪切力就可以弄断它。因此，如果从1000个相同的细胞中移除DNA，将会有任意给定的基因的副本，但是每个副本会在长度不同的DNA片段上。
多年来，这个问题使研究基因很困难。然后再1970年被称为限制性内切酶的酶被发现：这些酶在特定点剪断DNA链。这种酶使将DNA切割成更小，更坚固，更易识别的片段变为可能，从而使分离包含感兴趣的基因的片

段变得更容易。
因此，至20世纪70年代后期，分子生物学家正忙于研究DNA和酶以及和被称为寡核苷酸探针的其他分子。一个寡核苷酸是一条短链核苷酸碱基特殊排列。在适当的条件下，一个寡核苷酸与在单链DNA上的互补的核苷酸序列特异性结合。因此，人造的具有放射标记的寡核苷酸可作为探针确定样本是否包含特定的核苷酸序列或基因。在1979年，加利福尼亚州埃默里维尔的Cetus公司，聘请我合成寡核苷酸探针。
1983年，合成寡核苷酸的生活的魅力已经进入了衰退——这个衰退以至于我们大多数如此高兴见证被雇佣。对于制作寡核苷酸，手工是费力而且非常古老的化学艺术形式，这使我们已经麻木了，所以已经让位给更迷人但可靠的自动化技术。这是一个巨大的改进。
在之后的小工业革命中，我们核苷酸化学家自己成功发现错误。实验室机器，我们加载和查看，比我们在冷冻室制作的寡核苷酸还多，当然比那些看起来工作比我们以前猜想的还要更慢和乏味的分子学家做的多，这个可以应用于他们的实验中。因此在Cetus公司的我的实验室里，有大量的合理的时间可以思考和闲逛。
我发现我自己正在与寡核苷酸闲荡。
我知道，一种用于确定一个DNA分子上给定位置上的核苷酸的身份的技术将会是有益的，尤其是如果当DNA的复杂性高的时候（因为它是人类DNA）和当可用的DNA的量很小的时候它将会起作用。我不明白为什么不能使用酶的DNA聚合酶和改变为称为双脱氧测序技术，所以我设计了一个简单的实验来验证这一想法。
要想明白我想的方法，回顾关于DNA的必要事实是值得的。分子链的一端是已知的，按照化学习惯，这一端为3'端而结束的那一段为5'端。在DNA双螺旋结构中，互补链被认为是反平行的，因为一条链上的3'端与两一条链的5'端配对，反之亦然。
在1955年，斯坦福大学的Arthur Kornberg和他的同事发现一种称为DNA聚合酶的细胞酶。DNA聚合酶有一些自然功能，包括DNA的修复和复制。这些酶可以通过附加一个额外的核苷酸到3'端结束从而延长一个短的寡核苷酸的“引物”，但是只有当引物杂交，或绑定于互补链的时候，被称为模板。周围的解决办法还必须包含核苷三磷酸分子作为组成部分。
核苷酸通过聚合酶连接模板链的相应位置上的互补碱基。例如，如果在相邻的模板核苷酸是腺甘酸，聚合酶就会附加一个胸甘酸；如果模板核苷酸是一个鸟甘酸，酶就会附加一个胞苷酸。通过重复这个过程，聚合酶可以延长引物的3'末端一直到模板的5'端结束[见59页的图解]。在一个双螺旋DNA分子中，每条链作为一个模板链用于其

他的复制和修复。
现在，双脱氧测序，在其一个发明家之后又被称为Sanger技术，这个人是英国医学研究理事会的分子生物学实验室的成员。此技术使用DNA聚合酶，模板链，引物，三磷酸核苷和特殊的双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTP's），以确定DNA序列。像普通的核苷酸，ddNTP's能够通过聚合酶连接到生长的引物；然而，一个ddNTP将会在3'末端“封顶”，并预防任何多个碱基的添加。Sanger技术产生已延长至不同程度的引物，然后由ddNTP结尾。根据长度和了解哪些ddNTP已被添加从而排列这些片段，研究者可以决定碱基在模板链上的顺序。