氨苄青霉素抗性在大肠杆菌中的研究

学号：091201215

分子生物学实验论文

(2009级本科)

题目：氨苄青霉素抗性在大肠杆菌中的研究

系（部）院：农业与生物技术学院

专业：生物工程

作者姓名：何增寿

完成日期：2011年12月10日

二零一一年十二月

氨苄青霉素抗性在大肠杆菌中的研究

（农业与生物技术学院工程09（2）班何增寿091201202）摘要：为研究人工合成的氨苄青霉素在大肠杆菌中的抗性表达，利用PGEM--Teasy质粒为载体，把人工合成的抗氨苄青霉素的基因导入大肠杆菌，通过含有氨苄青霉素的培养基筛选出抗氨苄青霉素的基因的大肠杆菌，对筛选出的大肠杆菌进行质粒DNA提取,并对质粒进行PCR扩增和酶切电泳图分析。结果表明：人工合成的抗氨苄青霉素的基因在大肠杆菌中表达并复制。

关键字：氨苄青霉素抗性大肠杆菌研究

引言：在分子生物学日益普及的今天, 基因操作已成为一项重要的常规技术。体外连接的DNA 重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达, 从而得到大量的重组基因。其中尤以转化为主。目前可以通过两种方法得到大肠杆菌感受态细胞的储存物: 第一种是通过商业途径购买冻存的感受态细胞, 其转化效率十分可靠, 一般可以达到108 的转化子/μg 质粒DNA, 但是相当昂贵, 通常选择的是自制感受态细胞的储存物。因此, 感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节, 其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试材料：大肠杆菌（实验室提供） PGEM--Teasy质粒 Taq酶

1.1.2 仪器：基因扩增仪移液器电泳仪紫外检测仪恒温摇床恒温水浴器恒温培养箱低温离心机超净工作台冰箱离心管小指管

1.1.3 试剂： PCR缓冲液(含Mg2＋) 4种dNTP Taq酶 DNA模板

两种引物（正向引物和反向引物） EB溶液氯化钠(Nacl) 氨苄青霉素氯化钙(CaCl2) 酒精灯牙签 LB液体培养基 ddH

O 溶液Ⅰ（50 mmol/L 葡

2

萄糖，25mmol/L Tris.HCl pH8.0,10 mmol/L EDTA）溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH，2%SDS用前等体积混合溶液Ⅲ 5 mol/L KAc 溶液60ml， 11.5 ml冰醋酸，28.5 ml 去离子水。 Tris.HCl RNase 溶液

1.2 方法

1.2.1 PCR基因扩增

1.2.1.1 按顺序向微量离心管中依次加入：

O 35μl

ddH

2

DNA 样品 1μl

10×PCR 缓冲液 5μl

2.1mmol/L dNTP 4μl

引物I 2μl

引物Ⅱ 2μl

混匀。

1.2.1.2 PCR反应参数

(1) 94℃预变性 5min

(2) 94℃变性 1min

(3) 47℃退火 1min

(4) 72 ℃延伸 2min。

(5) 重复(2)-(4) 30次

（6）72 ℃延伸 10min。

（7）4℃保存

1.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果：取10μl PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。保持电流40mA。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察结果。

1.2.2 DNA重组

1.2.2.1 取灭菌的EP管，先后加入 PGEM--Teasy质粒1 μl ，2 μl酶切缓冲液， 1 μl E.coRI酶，无菌双蒸水15ul，至反应混合物总体积20ul，离心混匀，37℃反应3h。

1.2.2.2在另一灭菌的Eppendorf管中，加λDNA 1.5ug， 1μl酶切缓冲液，1 μl EcoRI酶，无菌双蒸水补到10ul，37℃反应3h。

1.2.2.3将酶解液加入1/10体积的3mol/LKAc溶液，在加2倍体积无水乙醇，-20℃冰箱，2h沉淀DNA。12000r/min 4℃离心15min，弃上清，加70%乙醇洗沉淀，再离心，去上清，真空干燥后，加5ulTE溶液。

1.2.2.4将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加T4DNA连接酶缓冲液1ul，

T4DNA连接酶1ul，14℃保温14h，并作转化试验。

1.2.3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

1.2.3.1从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落接于3mlLB液体培养基试管中，37℃振荡过夜。

1.2.3.2取0.5ml 过夜培养液，接种于50ml LB液体培养基中，37℃振荡培养

<=0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2h。（注：以下操作均应在2-3h，至OD

600

冰浴中进行。）

1.2.3.3将培养液1ml分装入1.5ml离心管中，在冰上冷却10--30min于4℃离心，4000r/min×10min，弃去上清。

20μl悬浮。

1.2.3.4 用冰浴的0.1mol/LCaCl

2

1.2.3.5 4℃离心，4000r/min×10min，弃去上清，加入冰浴的0.1mol/LCaCl

-

2甘油溶液200μl悬浮于冰上20-30min。4℃离心，4000r/min×10min，弃去上清。

1.2.3.6分装细胞，每200ul一份，-70℃冻存备用，此为感受态细胞。取新鲜制备的200μL感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻地将细胞均匀悬浮。加入2μl重组质粒，轻轻混匀。冰上放置30分钟。7.200ul 0.1mol/l CaCl2 +2ul PEGM-Teasy质粒DNA溶液混合。

1.2.3.7于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴1-2min

1.2.3.8每管加800 --900μ l LB培养液，37℃ 250r／min振荡培养1h。

1.2.3.9将培养物适量涂于含氨苄青霉素1%琼脂LB平板上。

1.2.3.10平皿在37℃下正向放置30min，待琼脂凝胶表面没有液体流动后，将平皿倒置，培养过夜12-16h出现菌落。

1.2.4质粒DNA的提取及酶切

1.2.4.1 提取质粒

1.2.4.1.1 将2ml含相应抗生素（Amp：50ug/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃震荡培养过夜

1.2.4.1.2 取1.5ml培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。

1.2.4.1.3 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥

1.2.4.1.4 弃上清，加100μl（5 mg/ml 溶菌酶）溶液Ⅰ，旋涡震荡悬浮菌体，

室温放置10min。 1.2.4.1.5 加200μl的溶液Ⅱ（新鲜配置），轻轻混匀，冰浴5 min。

1.2.4.1.6 加150μl的溶液Ⅲ，混匀，冰浴15 分钟。

1.2.4.1.7 12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。

1.2.4.1.8 向上清液中加等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转至另一离心管中。

1.2.4.1.9 吸取上清，加2倍体积的无水乙醇，充分混匀，室温放置5——10min。120000 r/min离心5 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

1.2.4.1.10 用1ml 70℅乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，弃上清，晾干。

1.2.4.2 酶切

取5ug DNA 溶液，加1ul（2U）,无菌水补至总体积10ul，37℃保温3h，加凝胶上样缓冲液（6x）2ul，准备下个试验进行电泳，分析质粒DNA的限制性酶切图谱。

2 结果与分析

2.1 PCR目的基因的扩增电泳图的分析

图一：PCR目的基因的扩增电泳图

由上图可以看出，条带与标准maker对比可知目的基因的分子量在1000左右，条带没有拖拉的痕迹表明PCR效果较好，其中PCR扩增产物中目的基因的纯

度较高，与maker中分子量为1000的条带对应也出现了条带，表示其中含有杂质，即体系中还有为延伸完成的目的基因又一次被变性了。

2.2 重组后的质粒导入大肠杆菌后在含氨苄青霉素的培养基上生长的分析

图二：重组后的质粒图

从上图可以看出，利用Cacl2法制备大肠杆菌感受态细胞在导入重组DNA质粒后，在含有氨苄青霉素的培养基上生长，说明导入的目的基因表达了。

2.3质粒凝胶电泳分析

图三：质粒凝胶电泳图

图中泳道一是我组的泳道，与其他泳道相比条带的亮度较浅原因有以下两点：

1、点样量太少；

2、提取质粒的纯度不高

2.4质粒PCR和质粒酶切分析

图四：质粒PCR凝胶电泳图图五：酶切PCR凝胶电泳图DNA经酶切和扩增后显示不同长短的条带，PCR扩增产物后分子量为900左右的仅有一条带而经酶切后有三条带，因此表明质粒的分子量为4000左右与理论基本符合。

1.3 参考文献

[1] 任杏芬. 大肠杆菌[J]. 生物学通报, 1993, (04)

[2]朱必凤, 杨旭夫, 刘主, 彭凌, 邓小亮. 6株副猪嗜血杆菌基因组DNA的PCR指纹图谱研究[J]. 中国预防兽医学报, 2007,(03)

[3] 李芳, 墙克信, 王玉炯. 大肠杆菌感受态细胞制备方法及应用的研究进展[J]. 宁夏医学院学报, 2003,(05)

[4] 李路怡,易建华,李敏. 大肠杆菌最佳感受态细胞制备的探讨[J]. 生命科学研究, 1998,(03) .