食品添加剂(以色素为例)的含量检测

实验七食品添加剂（以色素为例）的含量检测2-高效液相

色谱法

一实验目的

熟悉高效液相色谱仪的组成和各部件功能，初步掌握高效液相色谱仪的使用方法，通过实验了解使用注意事项，分析主要影响因素及如何获得理想的色谱图。二原理

高效液相色谱仪是分析检测生物样品的设备。具体来说，高效液相色谱仪可以对复杂样品进行杂质检查和有效成分含量测定。液相色谱法可以分析有机样品总量中的80%，是目前生产和科研中的常用分析工具。

实验室高效液相色谱仪为美国waters公司生产，包括1525二元高压泵（含在线脱气机）、2998二极管阵列紫外检测器、柱温箱和2707自动进样器。

三材料

1.药品饮料，色素标准品，冰醋酸，醋酸铵，色谱纯甲醇等。

2.玻璃仪器三角漏斗，量筒，容量瓶，胶头滴管，离心管5ml，离心管1.5ml，

针头过滤器（0.45μm滤膜），塑料注射器，流动相过滤器（包括0.45μm滤膜）等。

3.仪器高效液相色谱仪，超声波清洗机，真空泵等。

四实验流程和步骤（含操作要点）

4.1样品制备

含有色素的样品预处理后，定容，取适量用0.45μm滤膜过滤，装入2ml样品瓶中，备用。

4.2标准品溶液制备

适量标准品配制配置储备液，配置系列浓度的标准品溶液。（根据实际样品的峰面积，配置标准品的浓度。）

4.3 仪器条件

流动相：甲醇：冰醋酸-醋酸铵缓冲液（醋酸铵浓度0.020mol/L，缓冲液pH=4）；固定相：C18 （5μm，内径4.6 mm×长度250 mm）色谱柱；

其他参数：温度：室温；检测波长254 nm；检测时间约30 min，进样体积10μl。

4.4 配制流动相

按照上述配方配制所需体积的流动相，超声波混合20min后，流动相过滤器中采用孔径0.45μm水性滤膜（滤膜直径45mm），抽真空条件下减压过滤，超声波脱气20 min。

同时准备色谱级甲醇适量（500 ml），孔径0.45μm有机滤膜过滤。用于实验结束后冲洗色谱系统及色谱柱。

4.5样品检测：

主要涉及仪器和软件操作。

开机顺序：二元高压泵（含在线脱气机）、二极管阵列紫外检测器、柱温箱和自动进样器开机自检完成后，打开电脑和软件，注意数据的保存位置。

仪器流动相管路滤头放入新配制的流动相中，软件中设置A、B泵的比例及流速；通常两泵的流速之和为1 ml/min；流速变化率设置为1min（即流速从0到1 ml/min所用时间为1min）。调节流路切换阀，使得流动相冲洗管路和泵头即置换管路中溶剂；同时安装好色谱柱；5分钟后，调整流路切换阀，使流动相通过色谱柱，平衡流速通常为1 ml/min，时间为20 min以上。

通过色谱软件设置好仪器方法（包括二元高压泵、二极管阵列紫外检测器、柱温箱和自动进样器的参数设定）和方法组。用编辑好的方法平衡并监视基线。

样品瓶放到样品板上。根据样品在样品板上面位置，设置样品组并保存相关信息（进样器定量进样10μl）。

用流动相或其他适当溶剂清洗进样针。基线满足要求时，运行样品组，开始检测多个样品。

看到样品中的色素和其他杂质出峰结束后，可通过软件停止此次进样。

注意：完成一天分析工作，或进样20次左右，用纯甲醇1 ml/min左右冲洗色谱柱60 min。如果流动相中有缓冲盐，先用不含缓冲盐的流动相冲洗色谱柱，再用纯甲醇1 ml/min冲洗色谱柱60 min（原因是什么？）。用流动相或纯溶剂大体积冲洗进样环。最后，处理废液。

4.5.1 数据处理：

通过软件进行处理，获得相应的色谱图和光谱图，以及积分信息，完成定性和定量分析。

五注意事项

注意有机溶剂的使用，保护自己和他人的手、眼睛和裸露的皮肤；

流动相滤器、进样针等小心轻放；

如不清楚使用方法，可以请教老师。

六作业和思考题

1.根据实验结果，分析如何计算所测样品中的色素浓度。

2.分析方法验证需要验证那些参数？

七Reference

1.HPLC操作规程（https://www.360docs.net/doc/a618044788.html,）

2.中华人民共和国药典（2010版）