Abcam抗体产品保存指南
Abcam产品保存指南
抗体保存得当与否，直接决定了抗体的活性和使用效果！如果抗体保存得当，大部分抗体活性都可以维持数月甚至数年。
本指南以Abcam抗体保存方法为主，同样也可以应用到其他绝大部分公司的抗体产品！
请谨记！无论何时
请按照说明书推荐的保存条件正确保存抗体！
1. 收到抗体后请务必在12000rpm离心1-5分钟后再打开管盖进行分装和保存(如果抗体体积小于50ul，请延长离心时间至5分钟，以保证全部抗体均离心下来）！
Abcam的抗体使用非常特殊的储存管，只有在12000rpm离心1-5分钟才能将附着在管壁或盖内的抗体全部离心下来。即使是在10000rpm离心也会导致离心不完全，导致出现抗体的量不足的现象！
2. 对于Abcam大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在 -20℃ or
-80℃。
o对绝大多数抗体来说，保存在-20℃是完全足够了。没有任何证据显示保存在-80℃会有更多的好处！
o分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。
o分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响
o复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4℃，避免再冻起来！
o抗体工作液应该当天配制当天用完，在4℃尽量不要超过1天。
o绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。尽量将抗体保存在冰箱里层，而不是门上
3. 大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。
如果抗体很快（1-2周）会使用，推荐在4℃保存，这是为了避免反复冻融对抗体活性的损害。如果要长期保存则最好是在-20℃ or -80℃。最关键的一点是要根据说明书推荐的方式来正确的保存抗体！
但是，腹水形式的产品请在收到后立即冻起来！因为该类产品含有大量的蛋白酶，长期在4oC保存会导致抗体的降解！
4. 大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要1-2周的时间，所以是在4℃的条件下来完成的。
4℃运输最主要的目的是为了避免反复冻融对抗体活性的损害（如果使用干冰运输，那么收到时抗体是冻起来的，为了分装就需要解冻。这就多了一次冻融的过程）。所以运输过程中绝对避免干冰运输！
特殊抗体的保存条件：
?酶联抗体：永远保存在4℃，避免冻起来。否则会导致酶活性的下降或者丧失
?偶联抗体：所有偶联抗体都需要在棕色管中或使用锡箔纸避光4℃保存。尤其是荧光抗体，对光极为敏感，因此在所有的实验阶段也是要避光操作的！
?IgG3的同型对照：永远保存在4℃，避免冻起来。因为如果出现冻融过程，该抗体非常容易形成多聚体
无论是保存还是运输，绝对避免反复冻融！
反复冻融会导致抗体变性，导致多聚体形成，从而降低抗体的结合能力！
抗体保存其它相关信息：
关于加入甘油保存：
有些人会加50%的甘油到抗体中来避免反复冻融，甘油在-20℃ 会降低冰点。这对很多抗体可能是可行的。但是abcam仅对非常小的一部分抗体检测过其在这种条件下的稳定性；而Abcam只对按照推荐条件保存的抗体提供质量保证！加入甘油的溶液不建议在-80℃保存，因为这已经超过了甘油的冰点。如果您要加入甘油来保存抗体的话，请谨慎注意无菌操作，避免污染！
关于蛋白保护剂：
蛋白在高浓度时更不容易降解（1 mg/ml 或者更高），这就是为什么在抗体中加入BSA之类作为稳定剂的原因了；另一方面，加入的蛋白也可以减少抗体由于管壁吸附所造成的损失。但是如果抗体要用来标记的话，则不能加入蛋白稳定剂，因为这些稳定剂会和抗体一起竞争结合标记物。
关于叠氮化钠（sodium azide）的使用：
为了防止微生物污染，叠氮化钠经常被加入到抗体中（终浓度0.02% (w/v)）。Abcam的很多抗体已经含有了0.02％-0.05%的叠氮化钠，在说明书的“Storage buffer”中有标明的。
在下述情况中不能使用叠氮化钠：
?如果抗体用于染色或处理活细胞，用于体内研究：
叠氮化钠在抵抗微生物的同时，对其它大部分有机物也是有毒的，因为它阻断了线粒体的cytochrome electron transport system.
要偶联带有氨基基团的抗体：
叠氮化钠会干扰任何含有氨基基团的偶联，因此在进行偶联之前，应将叠氮化钠去除。偶联后的抗体可以加入叠氮化钠保存，但是浓度只能是0.01％。对于需
要偶联的抗体，thimerosal (merthiolate)可以替代叠氮化钠作为保护剂！
注：叠氮化钠的去除方式：
可以通过凝胶电泳或过滤的方式去除！IgG的分子量是150kDa (IgM 是~ 600kDa); 叠氮化钠的分子量只有65Da。使用cut off 14kDa的滤膜即可将叠氮化钠从抗
体中去除
抗体纯化的方法有哪些
抗体纯化的方法有哪些？ 抗体制备出来之后，需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗，既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清，而通常经过免疫制备的 硫酸铵沉淀法： 基本原理：高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜，降低球蛋白的溶解性，是分离免疫球蛋白的常用方法，而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别，一般用来分离抗体的硫酸铵饱和度在33~50%。 适用于：鼠抗所有亚类、其他种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA 基本操作： 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清； 2.加入饱和硫酸铵至终浓度45%，静置沉淀蛋白； 3.沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解，用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐； 4.过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，PBS或硼酸盐（含0.02%叠氮钠）缓冲液洗脱； 5.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度； 6.抗体保存浓度在0.1-30 mg/mL适宜，-20℃保存不超过一个月，避免反复冻融。 亲和层析法 基本原理：基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段，将protein A和protein G结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG及其亚类与片段纯化出来。 成员介绍：protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁，分子量42 kDa，由spa 基因编码，具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域，每个结构域由三个α螺旋构成。 protein A的B结构域
protein A的各个结构域 protein A可结合多数免疫球蛋白的Fc段（尤其是人的IgG1、IgG2、IgG4，豚鼠，猕猴，鼠类IgG2a、兔）以及人VH3家族的Fab段。基因工程改造的protein A通常使用大肠杆菌作为表达宿主，表达产物仍含有五个Fc结合结构域。对其结构上的改造主要是为了增加与多孔性材料的偶联性能，也有的改造protein A含有四个或六个同型Fc结合结构域，另外结构域数目较少的protein A能得到更好的抗体纯化效果。 protein G分离自G Streptococcus的细胞壁，分子量65 kDa，由spg基因编码，可结合抗体的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白。基因工程改造的protein G去掉了与白蛋白的结合位点仅仅保留Fc结合结构域，其结合力较protein A更强。 protein G的B结构域 protein G的各个结构域 还有一种protein A/G蛋白，是基因工程改造产物，是将protein A的4个Fc结合结构域与protein G的2个Fc结合结构域融合表达得到的。protein A/G结合了二者的特性，能结合人和鼠的IgG所有亚型，不结合鼠的IgA、IgM。 ①proteinA亲和层析 适用于：人（IgG3除外）、兔、豚鼠、猪的抗体； 基本操作： 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清； 2.调节pH到8.0：腹水以10倍体积pH8.0 PBS稀释、培养上清用pH8.0 PBS透析或强氧化钠调节； 3.过proteinA琼脂糖凝胶柱，pH8.0 PBS洗杂； 4.柠檬酸缓冲液洗脱抗体（小鼠IgG1用pH6.5，IgG2a用pH4.5，IgG2b和IgG3用pH3.0），并注意收集管内需加入Tris缓冲液中和滴下的抗体溶液； 5.用PBS透析；
抗体工程重点总结
简答题 1.简述鼠源性单抗的改造原则及常见类型 a)改造原则：降低其免疫原性、尽量保持其亲合力 b)常见类型：人鼠嵌合抗体、CDR移植抗体、小分子抗体 2.噬菌体抗体库技术的主要流程及优点 a)噬菌体抗体库技术：借助噬菌体展示技术，将抗体V基因与噬菌体外壳蛋白基因 融合表达于噬菌体表面，从而构建噬菌体抗体库，然后通过筛选获得特异性抗体的 V区基因。 b)主要流程： i.扩增全套抗体基因 ii.构建合适的重组噬菌体表达载体 iii.转化大肠杆菌并保存 c)优点： i.省时省力 ii.筛选容量大 iii.直接得到抗体基因 iv.可制备人源抗体和其它难于制备的抗体 v.可原核表达 d)缺点： i.库容受转化效率限制：一般不超过1010 ii.一些抗体分子会抑制宿主菌生长 iii.具极高亲和力的抗体与抗原结合后，难以洗脱，造成丢失 3.简述基因工程抗体的各表达系统的优缺点 a)哺乳动物细胞表达系统： i.优点： ①. 具有完整的转录、翻译后加工及分泌机制，抗体能被准确子合成、加工和 分泌 ②. 具有完全糖基化功能和完善的重折叠机制，可表达形成良好活性的抗体分 子 ③. 可实现抗体的分泌表达 ④. 既可表达完整的抗体分子，也适合表达其它形式的小分子基因工程抗体 ii.缺点： ①. 构建周期长，操作繁琐 ②. 表达量相对低，成本较高 ③. 大规模生产受限 ④. 具潜在致癌性和病毒核酸的污染可能 iii.常用的宿主细胞 ①. 淋巴细胞：主要是小鼠骨髓瘤细胞SP2/0、NSO ②. 非淋巴细胞：常有的细胞有CHO、COS b)大肠杆菌表达系统： i.优点： ①. 遗传背景清楚 ②. 产量高：130—150mg／L
如何购买抗体
订抗体一定要提供至少以下五个方面的信息给你的供货商,在我们公司,这五个信息不全,是无法订货的,这也是为客户负责. - 1. Antigen,也就是抗原名称,最好是英文全称,许多客户只说简称,要知道不同的抗体其简称有可能会一样的.有中文最好也提供一下. - 2. Reactivity,即反应性,也就是实验用于什么特种,是人,大鼠还是小鼠等. - 3. Host,宿主,就是抗体来源,这个主要和二抗有关系,一抗必须要和二抗搭配,比如,二抗是羊抗小鼠,一抗就要选择小鼠来源的.不少客户常常是先有二抗,再买一抗,受限制得很,其实应该先订一抗,再买二抗,毕竟一抗贵,为了将就一个100元左右的二抗,而把几千元的一抗的订购弄得很复杂,真是不划算.所以,不要为了二抗伤脑筋.- 4. Conjugate,即缀合物或标记物,如是不是需要FITC标记,HRP标记等情况,也最好说明. - 5. Applications,就是应用. 你买这个抗体用于做什么实验,是IHC还是WB,这点一定要说,要知道,抗体开发出来,不是什么实验都能用或都会效果好,抗体公司说明上写着能做的实验是经过验证的,没有写的不是说一定不能做,也可能可以做,但没有验证,厂家不会乱说的,也是科学负责的态度.例如,你要是想做IHC-P,就是石蜡切处的免疫组化,如果买不到抗体明确说可以做,你要用就得冒风险,好在现在抗体厂家众多,一般都找得到了. - 1.该定制单抗还是多抗？ 首先应该考虑的就是定制的抗体是应用于什么实验，需要的量是多少？ 对于科研用户来说 1. 抗体常常应用于WesternBlotting、IP等实验中，对于抗体的特异性有一定的要求，但并不是特别的强调 2. 往往在研究很多新的蛋白时，并不确定新蛋白是否很重要，是否会是将来很长一段时间的研究重点，所以抗体用量也不大所以针对科研用户，在定制新的蛋白的抗体时，我们强烈建议首先制备多抗用于实验，当得到了理想的实验结果并需要长期的使用该抗体时再考虑制备单抗。当然，如果您对该抗体的特异性要求特别高（多抗的特异性已无法满足实验要求，比如应用于流式细胞术等）时，还是应该定制单抗
抗体保存知多少
抗体保存知多少 通常情况下，抗体经恰当保存和处理，大多数应能保持活性数月乃至数年。当然，不同类型抗体，其保存的方法也可能不一样，以下就抗体的保存，提供一些参考! 一、保存温度和条件 对于很多抗体而言，保存在-20℃是完全足够了，没有任何证据显示保存在-80℃会有更多的好处!分装成小等份可最大程度减少由冻融造成的损伤，以及从单个试剂瓶中多次吸取而引入的污染。小等份只需冻融一次，如有剩余，可将剩余物保存于4oC. 在收到抗体时，在10,000 ×g 下离心20 秒以沉积截留于试剂瓶螺纹的溶液，并以小等份转移至低蛋白结合微量离心管中。小等份的量取决于实验人员在实验中通常采用的量。小等份应不小于10 μl; 等份越小，储液浓度因抗体蒸发及吸附于保存瓶表面而受到的影响越大。 在大多数情况下，收到抗体时在4oC 下保存一至两周，然后再冷冻进行长期保存是可接受的，但也许腹水液是例外，它可能包含蛋白酶，因而应该尽快冻存。同样，遵照说明书上的建议是重要的。
大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要1-2周的时间，所以是在4℃的条件下来完成的。 对于特殊的抗体，如酶、荧光素等偶联抗体、IgG3同型抗体等抗体的保存有其注意事项： 1、偶联抗体酶偶联抗体不应冻存，而应保存于4oC. 冻融不仅影响抗体结合能力，还会降低酶活性。无论偶联至荧光染料、酶还是生物素，偶联抗体都应保存于深色试剂瓶中或用金属箔包裹. 暴露于光线中将损害偶联物的活性。特别是荧光偶联物易受到光漂白影响，在实验的所有阶段都应避光。 2、IgG3的同型对照保存在4℃，避免冻起来。因为如果出现冻融过程，该抗体非常容易形成多聚体 二、用叠氮化钠防止污染 为了防止微生物污染，可将叠氮化钠加入抗体制备品中达到0.02% (w/v). 的终浓度。但是有时不能使用叠氮化钠，有以下两中情形：
抗体选择指南 抗体保存指南 抗体说明书样本 - 物种选择较为重要
抗体选择指南 抗体保存指南 抗体说明书样本 一抗体选择指南 :检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，为缩小抗体的选择范围选中合适的抗体，需要考虑如下几种因素： 1. 分析或应用的类型 2. 样本蛋白的结构性质 3. 样本的种属 4. 抗体宿主的种类 5. 抗体的标记和检测 1分析试验的应用类型一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB IHC ICC ELASA分析等，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证，如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。 2 样本蛋白的结构性质了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑 (1)..待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FACS流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。 (2)样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来 3 样本的物种应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy 和 NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。 4 一抗宿主物种的选择一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的
关于博士德抗体和试剂的保存方法
试剂保存指南一、抗体的保存：抗体保存得当与否直接决定了抗体的活性和使用效果。如果抗 体保存得当，大部分抗体活性都可以维持数月甚至数年。 请按照说明书或者抗体标签上推荐的保存条件正确保存抗体！无论是保存还 是运输，绝对避免反复冻融抗体！ 1、收到抗体后请务必在1000-3000转离心1-2分钟后再打开管盖进行分装和保存！（由于运输过程中反复颠簸，管内微量抗体容易聚集在管盖处，一旦直接打开容易流失抗体。（请放心博士德抗体出厂时保证已装入足量） 2、对于Boster大部分抗体（纯化一抗），比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃冰箱。 ◇因为博士德的抗体（纯化一抗）出厂时抗体内已经加过防冻剂或抗体保护剂，即使在-20℃环境下也不会冻结成冰，反之，如果冻存过程中发现抗体能冻结成冰时请停止继续使用并及时与我们联系。 ◇分装可以最大程度降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了多次从同一管中吸取抗体造成污染的可能性。 ◇分装的量以一次实验用完为好，但建议最少不要少于10μL每份。分装体积越小，抗体浓度可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响，同时分装次数越多移液吸头吸附的抗体也越多，可能会误认为抗体没有足量装入。（最好用无菌的进口0.2ML离心管来分装抗体，国产的小管一般没有经过很好的硅化处理，容易吸附抗体蛋白，影响抗体活性。） ◇分装时请将无菌的微量移液器吸头先插入管底部反复吹打几次后再吸出抗体，以便抗体有效成分与抗体保护剂充分混匀。 ◇复融后的分装抗体如果一次用不完，请将剩余母液保存在4℃冰箱，避免再冻起来！ ◇绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱的冷藏室中。尽量将抗体保存在手动除霜冰箱里面，而不是在冰箱门上。 3、大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是基本没有影响的。如果抗体很快（1-2周内）就能使用完，推荐在4℃保存，避免反复冻融对抗体活性的损害。如果要长期保存则分装后-20℃保存。 4、即用型抗体请务必保存在4℃冰箱，一定不能冷冻保存。注意：即用型抗体有效期：自购买之日起1个月。
抗体的选择和保存
抗体的选择和保存 当我们要检测目的蛋白在组织中表达情况的时候，如何选择适合我们实验需要的抗体，并恰当保存使用，是每个科研人员需要细心考虑的。抗体种类繁多，品牌众多，技术参数不一，价格和质量更是相差甚大，如何购买到高质量价格合适的抗体，并准确地做出我们想要的结果，其中有很多细节需要注意。 一、怎样选择适合你实验需要的抗体 1. 一抗选择要点 （1）确定抗体的名字，注意中英文名字、它名、亚型等信息。 （2）确定你的实验类型，ELISA，WB，IHC，ICC，还是FACS。一般抗体的说明书都会列出该抗体经验证过适用于何种实验的类型，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种实验验证，请根据说明书列出的已验证的类型来选择适合你实验的抗体。（3）确定实验样本的种属，Human，Mouse，还是Rat。一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种物种实验，请根据说明书列出已验证的种属来选择适合你实验的抗体。对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应，例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。 （4）样本蛋白的结构性质。了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，待测样本蛋白的结构域和样本在提取和处理过程中是否会变性，蛋白空间构象的改变，会影响抗体的免疫亲和反应。抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FACS 流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。 （5）单多克隆抗体的选择。市面上的抗体还是以多克隆抗体为主，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异
一抗的选择
随着生命科学的发展，围绕蛋白进行的研究越来越多，抗体试剂在实验中的重要性越来越举足轻重。面临着纷呈复杂的抗体试剂市场，如何选择到适合自己实验的抗体就变得尤为重要。 当我们要检测目的蛋白在组织中表达情况的时候，如何选择适合我们实验需要的抗体，并恰当保存使用，是每个科研人员需要细心考虑的。抗体种类繁多，品牌众多，技术参数不一，价格和质量更是相差甚大，如何购买到高质量价格合适的抗体，并准确地做出我们想要的结果，其中有很多细节需要注意。 一、抗体选择总体原则 1. 关于特异性的选择 特异性的选择主要需要考虑四个方面：蛋白特异性、种属特异性、实验方法特异性、标记物的特异性。 （1）蛋白特异性 针对需要检测的蛋白查找抗体，几个细节要区分，重组表达的蛋白和内源性蛋白的检测，对抗体的要求是不一样的，注意查看抗体说明书的检测说明。如果重组蛋白不是全长表达，则需要注意抗体的免疫原区域是否在重组蛋白区域内。内源性蛋白最好能清楚其剪切与修饰的方式，特殊表型的蛋白需要进行序列比对，并结合抗体免疫原序列，查看交叉反应的情况。磷酸化蛋白检测需要确定具体位点，不同位点的磷酸化意味着可能有不同的机制存在，不宜一概而论。
（2）种属特异性 同种蛋白不同物种，有着或大或小的差异。目前大部分商品化抗体都是以人源蛋白序列为模板重组蛋白或设计多肽抗原的，根据蛋白的同源性情况与其他种属发生交叉反应。需要参照说明书注明的可反应种属信息。一些稀有种属很难找到抗体，可以通过蛋白的序列比对，选择同源序列免疫的抗体，不过一般这种情况生产商不会受理其关于质量的申诉，如果可以申请到免费的抗体样品，则利于抗体选择。 （3）实验方法特异性 目前使用抗体的实验方法有很多，不同的使用方法过程中，因为对蛋白样品的处理方式不一样，蛋白的含量有差异，对抗体的识别表位和效价要求都是不一样的。具体的根据说明书注明的产品应用方法进行选择。但是生产商一般不会将每个抗体都进行各种实验的检测，目前检测比较多的只是WB、IHC、IF等，如果针对具体的实验方法没有找到合适的抗体的，可以结合蛋白序列分析和抗体的抗原信息，选择尽可能有效果的抗体。同样，申请到免费的抗体样品是个很好的途径。 （4）标记物的特异性 一般基于实验操作的实验方法不会使用带有标记的一抗，比如WB、IHC 等，都是通过二抗类的试剂标记达到结果呈现的目的。但是基于仪器分析的一些实验，可能就会使用到直接标记的一抗，比如流式实验。那么需要了解到自己将要使用的仪器能检测到的荧光范围，针对不通的参数
抗体的保存建议
抗体的保存建议： 抗体保存得当与否直接决定了抗体的活性和使用效果。如果抗体保存得当，大部分抗体活性都可以维持数月甚至数年。请按照说明书或者抗体标签上推荐的保存条件正确保存抗体！无论是保存还是运输，绝对避免反复冻融抗体！ 1.拿到抗体后请务必在1000-3000转离心1-2分钟后再打开管盖进行分装和保存！（由于运输过程中反复颠簸，管内微量抗体容易聚集在管盖处，一旦直接打开容易流失抗体。请放心博士德抗体出厂时保证已装入足量。） 2.对于博士德大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃冰箱。 ◇分装可以最大程度降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了多次从同一管中吸取抗体造成污染的可能性。 ◇分装的量以一次实验用完为好，但建议最少不要少于10μL每份。分装体积越小，抗体浓度可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响，同时分装次数越多移液吸头吸附的抗体也越多，可能会误认为抗体没有足量装入。（最好用无菌的进口0.2ML离心管来分装抗体，国产的小管一般没有经过很好的硅化处理，容易吸附抗体蛋白，影响抗体活性。） ◇分装时请将无菌的微量移液器吸头先插入管底部反复吹打几次后再吸出抗体，以便抗体有效成分与抗体保护剂充分混匀。 ◇复融后的分装抗体如果一次用不完，请将剩余母液保存在4℃冰箱，避免再冻起来！ ◇绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱的冷藏室中。尽量将抗体保存在手动除霜冰箱里面，而不是在冰箱门上。 3.大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是基本没有影响的。如果抗体很快（1-2周内）就能使用完，推荐在4℃保存，避免反复冻融对抗体活性的损害。如果要长期保存则分装后-20℃保存。 4.即用型抗体请务必保存在4℃冰箱，一定不能冷冻保存。 5.特殊抗体的保存： ◇酶联抗体：一般保存在4℃，尽量避免冷冻起来。否则可能会导致酶活力的下降或者丧失。◇偶联抗体：所有偶联抗体需要4℃避光保存。尤其是荧光标记抗体，对光极为敏感，因此所有实验阶段也是要避光操作的
GAPDH抗体说明书
GAPDH抗体 WB, Western blot; IF, Immunofluorescence; IHC, Immunohistochemistry. Mam, mammalian, including human, mouse, rat, pig, rabbit, dog, cat; C, chicken; Fi, fish; Fr, frog. 不能用于检测bovine和yeast样品。 本GAPDH抗体(GAPDH antibody，也称为G3PDH antibody)为进口分装，用从兔肌肉纯化获得的GAPDH作为抗原制备而成的抗GAPDH小鼠单克隆抗体。克隆号为6C5。 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)是糖酵解(glycolysis)过程中的关键酶之一。GAPDH由4个分子量约为36kD的亚基组成，总的分子量为146kD。在SDS-PAGE凝胶电泳时解聚为单体，显示的分子量约为36kD。哺乳动物的GAPDH除了在糖酵解过程中起作用外，还和membrane fusioin，microtubule bundling, RNA出核运输，DNA复制和DNA修复等有关，并和前列腺癌、神经细胞凋亡、神经退行性疾病等相关。 GAPDH几乎在所有组织和细胞中组成性高表达。只有缺氧和糖尿病等情况可以在某些细胞中上调GAPDH的蛋白水平。 GAPDH在各种组织和细胞中都组成性高表达，因此被广泛用于Western时上样量是否一致的参照(loading control)。 配套提供了Western一抗稀释液，可以用于Western检测时的一抗稀释。 )： 保存条件： GAPDH抗体-20℃保存，Western一抗稀释液-20℃或4℃保存，一年有效。Western一抗稀释液优先推荐4℃保存，长期不使用可以考虑-20℃保存，但冻融可能会导致出现轻微的浑浊和少量不溶物。 注意事项： 在Western实验后，请注意回收稀释的抗体。回收的抗体在进行Western实验时至少可以重复使用10次。稀释后的抗体，包括已经使用过的稀释抗体，4℃保存。 回收后重复使用的抗体，使用方法同新鲜稀释的抗体。如果在重复使用过程中发现抗体出现轻微混浊现象，可以10000g 离心1-3分钟，取上清用于后续检测。如果回收的抗体出现明显的絮状物或长霉长菌等情况，则可以考虑废弃该抗体。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1. Western检测： A. 按照1: 500-1000用碧云天提供的Western一抗稀释液稀释抗体。 B. 把经过封闭的蛋白膜与稀释好的一抗4℃缓慢摇动过夜或室温缓慢摇动1-2小时，确保稀释的抗体至少能在摇动的瞬 间覆盖蛋白膜。通常与一抗4℃缓慢摇动过夜效果更好一些。 C. 回收稀释的一抗，4℃保存以备下次继续使用。 D. 按照Western的实验步骤进行后续的洗涤、二抗孵育、洗涤和检测等操作。具体操作可以参考如下网页： h ttp://https://www.360docs.net/doc/a6229947.html,/western.htm 2.免疫染色：
抗体标记技术汇总
第1章抗体分子标记技术 第一节抗体的I125标记法 基本原理 有多种方法可用于蛋白质的碘标记，如应用化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化是常用的方法。当应用化学氧化法时，碘化钠（NaI）遇强氧化剂，碘离子被氧化为碘分子，所生成的自由碘分子可与某些基团进行卤化反应。蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基，某些组氨酸残基也可能进行碘化。在应用氯胺T(Chloramine T)法的实验中，所用的氧化剂（1，3，4，6-tetrachloro-3α, 6α -diphenyl-glucoluril）是溶于强挥发性的有机溶剂中。该溶剂加入试管后，先让其挥发（即让氧化剂将试管包被），然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中，反应完成即将混合液移入他管，以终止反应。 试剂及仪器 ●经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体 ●0.5 mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5 (配法见附录1) ●无载体的Na125I 3.7GBq/ml ( 100 mCi/ml ) 的NaOH液 ●凝胶过滤柱 ●γ-记数器 ●100g/L 三氯醋酸 ●70% 乙醇 ●玻璃纤维滤 ●氯胺T (Chloramine T)反应用 * 新鲜制备的含2mg/ml氯络胺T的 0.5 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.5）； * 氯胺T 反应终止缓冲液： 2.4mg/ml 偏重亚硫酸， 10mg/ml 酪氨酸, 10%甘油, 1g/L Xyene cyanol 的PBS 液。 操作步骤 *注意：125I 对健康有害，需要保护措施。在应用125I 应先有关同位素知识，及在有关部门的监测下，按放射线同位素的应用及处置要求进行。 （一）氯胺T法 1．用1.5ml Ependof 管，加10μl 抗体及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液总体积至25μl； 2．加500 μCi 的Na125I ，混匀； 3．加25μl 2mg/ml 氯胺T液，混匀； 4．在室温下培养1分钟； 5．加入50μl氯胺T 反应终止缓冲液（以饱和的酪氨酸来捕获游离的 Na125I）； 6．通过凝胶过滤层析分离将碘化抗体与碘化酪氨酸分离。将反应混合液上1ml的凝胶过滤层析柱，分部收集洗脱液100μl/管，碘化抗体在开始的组分排出。应用γ-记数器监测各组分； 7．收集、合并含碘化抗体的各管；
抗体选择
抗体选择 随着生命科学的发展，围绕蛋白进行的研究越来越多，抗体试剂在实验中的重要性越来越举足轻重。面临着纷呈复杂的抗体试剂市场，如何选择到适合自己实验的抗体就变得尤为重要。 当我们要检测目的蛋白在组织中表达情况的时候，如何选择适合我们实验需要的抗体，并恰当保存使用，是每个科研人员需要细心考虑的。抗体种类繁多，品牌众多，技术参数不一，价格和质量更是相差甚大，如何购买到高质量价格合适的抗体，并准确地做出我们想要的结果，其中有很多细节需要注意。 一、抗体选择总体原则 1. 关于特异性的选择 特异性的选择主要需要考虑四个方面：蛋白特异性、种属特异性、实验方法特异性、标记物的特异性。 （1）蛋白特异性 针对需要检测的蛋白查找抗体，几个细节要区分，重组表达的蛋白和内源性蛋白的检测，对抗体的要求是不一样的，注意查看抗体说明书的检测说明。如果重组蛋白不是全长表达，则需要注意抗体的免疫原区域是否在重组蛋白区域内。内源性蛋白最好能清楚其剪切与修饰的方式，特殊表型的蛋白需要进行序列比对，并结合抗体免疫原序列，查看交叉反应的情况。磷酸化蛋白检测需要确定具体位点，不同位点的磷酸化意味着可能有不同的机制存在，不宜一概而论。（2）种属特异性 同种蛋白不同物种，有着或大或小的差异。目前大部分商品化抗体都是以人源蛋白序列为模板重组蛋白或设计多肽抗原的，根据蛋白的同源性情况与其他种属发生交叉反应。需要参照说明书注明的可反应种属信息。一些稀有种属很难找到抗体，可以通过蛋白的序列比对，选择同源序列免疫的抗体，不过一般这种情况生产商不会受理其关于质量的申诉，如果可以申请到免费的抗体样品，则利于抗体选择。 （3）实验方法特异性 目前使用抗体的实验方法有很多，不同的使用方法过程中，因为对蛋白样品的处理方式不一样，蛋白的含量有差异，对抗体的识别表位和效价要求都是不一样的。具体的根据说明书注明的产品应用方法进行选择。但是生产商一般不会将每个抗体都进行各种实验的检测，目前检测比较多的只是WB、IHC、IF等，如果针对具体的实验方法没有找到合适的抗体的，可以结合蛋白序列分析和抗体的抗原信息，选择尽可能有效果的抗体。同样，申请到免费的抗体样品是个很好的途径。 （4）标记物的特异性 一般基于实验操作的实验方法不会使用带有标记的一抗，比如WB、IHC等，都是通过二抗类的试剂标记达到结果呈现的目的。但是基于仪器分析的一些实验，可能就会使用到直接标记的一抗，比如流式实验。那么需要了解到自己将要使用的仪器能检测到的荧光范围，针对不通的参数要求选择对应的标记物。在免疫荧光双标实验中，需要选配不同的荧光标记物。 2. 抗体种属来源的选择 有人认为单抗比多抗好，其实这并不是一个严谨的观点，只能说在可能性上单抗的特异性更好一些，而多抗的亲和力会优于单抗，并且特异性并不一定就逊于单抗，主要看抗原的设计水平。目前商品化抗体里单抗主要是鼠单抗、兔单抗，多抗主要是兔多抗、山羊多抗等，其他种属来源抗体较少。不建议纠结于单抗好还是多抗好，能做出实验的抗体就是好抗体。 在选择上一般建议实验种属和抗体种属亲缘性越远越好，不宜同源。抗体不同种属会要影响接下来二抗的选配。特别是在免疫荧光双标实验中，需要在区别于实验种属的基础上，区分开两个指标的抗体种属来源，以便于二抗区别识别。 3. 关于性价比的选择 抗体的品质高低最终还是需要通过实验结果来呈现的，但是在选择抗体之前我们并无法准确判断抗体的效果如何。无论什么品牌的，无论进口还是国产的，都会有用得不错的产品，也都会有做不出来的产品。抗体属于异质化产品，不同品牌之间，甚至同一品牌的不同产品之间，抗体品质差异都较为明显，而且没有统一的衡量标准。这是抗体选择中最难的一个问题。很多人习惯于根据实验室传统意识或参考文献上使用的产品进行选择，但是因为不同批次间的抗体效果也是有差异的，所以并不能完全确保正确选择。在这种情况下，抗体的售后就尤为重要，遇到抗体品质障碍时，能够确保有效地解决问题，不至于影响实验的进展。现在有部分品牌可以提供免费的抗体小样的，无疑对这个问题是一个很好的解决方案。先确定抗体是否适合自己的实验，可以避免因为抗体质量投诉耽误实验安排。 在价格方面，需要谨记，最贵的不一定就是最好的，最适合你的实验的才是最好的。花很多钱买到很贵的抗体，再花上很长的时间去投诉的情况并不少见。只买对的，不买贵的。在选择价格的时候还要注意规格大小、抗体浓度、效价范围等，要综合考虑。在规格方面，根据最终可以稀释成的工作液的量的来衡量更为准确。很多老品牌提供的抗体产品基本都是以大包装为主，就单个课题的实验而言，过大的包装有时会造成很大的浪费。目前Proteintech、Bioworld、
几种常用的抗体检测方法
几种常用的抗体检测方法 (1)免疫酶技术 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。 A、器材和试剂 a. 包被缓冲液： 碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。 Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml 混合，加蒸馏水至1000ml。 b. 洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4&S226;12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。 c. 稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。 d. 酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。 e. 底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L 柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。 f. 底物使用液： OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2 0.15ml。TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。 ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。 g. 抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。 h. 抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。 病毒感染的传代细胞或全菌抗原。 淋巴细胞等悬液。 i. 酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。
抗体保存指南(严格遵守)
抗体保存指南 收到抗体后请务必在12000rpm离心1-5分钟后再打开管盖进行分装和保存(如果抗体体积小于50ul，请延长离心时间至5分钟，以保证全部抗体均离心下来）！ Abcam的抗体使用非常特殊的储存管，只有在12000rpm离心1-5分钟才能将附着在管壁或盖内的抗体全部离心下来。即使是在10000rpm离心也会导致离心不完全，导致出现抗体的量不足的现象！ 对于Abcam大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在 -20℃ or -80℃。 o对绝大多数抗体来说，保存在-20℃是完全足够了。没有任何证据显示保存在-80℃会有更多的好处！ o分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。 o分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响 o复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4℃，避免再冻起来！ o抗体工作液应该当天配制当天用完，在4℃尽量不要超过1天。 o绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。尽量将抗体保存在冰箱里层，而不是门上 大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。 如果抗体很快（1-2周）会使用，推荐在4℃保存，这是为了避免反复冻融对抗体活性的损害。如果要长期保存则最好是在-20℃ or -80℃。最关键的一点是要根据说明书推荐的方式来正确的保存抗体！但是，腹水形式的产品请在收到后立即冻起来！因为该类产品含有大量的蛋白酶，长期在4oC保存会导致抗体的降解！ 大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要1-2周的时间，所以是在4℃的条件下来完成的。4℃运输最主要的目的是为了避免反复冻融对抗体活性的损害（如果使用干冰运输，那么收到时抗体是冻起来的，为了分装就需要解冻。这就多了一次冻融的过程）。所以运输过程中绝对避免干冰运输！ 特殊抗体的保存条件： ?酶联抗体：永远保存在4℃，避免冻起来。否则会导致酶活性的下降或者丧失 ?偶联抗体：所有偶联抗体都需要在棕色管中或使用锡箔纸避光4℃保存。尤其是荧光抗体，对光极为敏感，因此在所有的实验阶段也是要避光操作的！ ?IgG3的同型对照：永远保存在4℃，避免冻起来。因为如果出现冻融过程，该抗体非常容易形成多聚体
抗体实验方法
抗体实验方法 一、抗血清的制备 有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。 （一）用于免疫的动物 作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。 （二）免疫途径 免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。 （三）佐剂 由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。 佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。 常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。 配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，
抗体保存注意事项
抗体保存注意事项 抗体保存得当与否，直接决定了抗体的活性和使用效果！如果抗体保存得当，大部分抗体活性都可以维持数月甚至数年。以abcam 抗体保存方法为主，同样也可以应用到其他绝大部分的抗体产品！ 1. 收到抗体后请务必在12000rpm 离心1-5min 后再打开管盖进行分装和保存！ 质优的抗体使用非常特殊的储存管，只有在12000rpm 离心1-5min 才能将附着在管壁或盖内的抗体全部离心下来。即使是在10000rpm 离心也会导致离心不完全，导致出现抗体的量不足的现象！ 2. 对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在-20 度or -80 度对绝大多数抗体来说，保存在-20 度是完全足够了。没有任何证据显示保存在-80度会有更多的好处！(1) 分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。 (2) 分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul 每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响 (3) 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4 度，避免再冻起来！ (4) 抗体工作液应该当天配制当天用完，在4 度尽量不要超过1 天。 (5) 绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。尽量将抗体保存在冰箱里层，而不是门上 3. 大部分抗体收到后4 度短暂保存1-2 周对抗体活性是没有影响的。 如果抗体很快(1-2 周)会使用，推荐在4 度保存，这是为了避免反复冻融对抗体活性的损害。如果要长期保存则最好是在-20 度or -80 度。最关键的一点是要根据说明书推荐的方式来正确的保存抗体！ 但是，腹水形式的产品请在收到后立即冻起来！因为该类产品含有大量的蛋白酶，长期在4 度保存会导致抗体的降解！ 4. 大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要1-2 周的时间，所以是在4 度的条件下来完成的。 4 度运输最主要的目的是为了避免反复冻融对抗体活性的损害(如果使用干冰运输，那么收到时抗体是冻起来的，为了分装就需要解冻。这就多了一次冻融的过程)。所以运输过程中绝对避免干冰运输！ 特殊抗体的保存条件： 1. 酶联抗体：永远保存在4 度，避免冻起来。否则会导致酶活性的下降或者丧失 2. 偶联抗体：所有偶联抗体都是在棕色管中或使用锡箔纸避光保存。尤其是荧光抗体，对光极为敏感，因此在所有的实验阶段也是要避光操作的！ 3. IgG3 的同型对照：永远保存在4 度，避免冻起来。因为如果出现冻融过程，该抗体非常容易形成多聚体 无论是保存还是运输，绝对避免反复冻融！ 反复冻融会导致抗体变性，导致多聚体形成，从而降低抗体的结合能力！ 抗体保存其它相关信息： 关于加入甘油保存：有些人会加50%的甘油到抗体中来避免反复冻融，甘油在-20 度会降低冰点。这对很多抗体可能是可行的。但是abcam 仅对非常小的一部分抗体检测过其在这种条件下的稳定性；而abcam 只对按照推荐条件保存的抗体提供质量保证！加入甘油的溶液不建议在-80 度保存，因为这已经超过了甘油的冰点。如果您要加入甘油来保存抗体的话，请谨慎注意无菌操作，避免污染！ 关于蛋白保护剂： 蛋白在高浓度时更不容易降解(1 mg/ml 或者更高)，这就是为什么在抗体中加入BSA 之类作
抗体的提取与纯化
(关键词：抗体；抗体的提取与纯化；盐析法；冷酒精沉淀法；DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白；SPA-SepharoseCL-4B 亲合层析纯化IgG；离子交换层析) 精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使 用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。 一、盐析法 取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。 ↓4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。 ↓置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。 ↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。 取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。 影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章第二节）。
二、冷酒精沉淀法 分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%，保持在-5℃。产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA 和IgM，IgG留在上清液内。调节上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到最终浓度为25%，维持在-5℃。所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0℃水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01～0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在–2℃或-3℃低温，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。 表2-5 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件 物种 pH 沉淀条件 IgG产量 酒精浓度（%）离子强度 人 5.1 15. 0.01 65 山羊 5.2 0 0.01 65 家兔 5.2 10 0.01 70 大鼠 5.0 15 0.01 50 豚鼠 5.1 15 0.01 70
抗体保存
抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100Mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。 绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。 被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。 保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。 其他注意事项： 分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。 分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4oC，避免再冻起来！ 抗体工作液应该当天配制当天用完，在4oC 尽量不要超过1天。 绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。尽量将抗体保存在冰箱里层，而不是门上。 无论是保存还是运输，绝对避免反复冻融！ 反复冻融会导致抗体变性，导致多聚体形成，从而降低抗体的结合能力！ 蛋白在高浓度时更不容易降解（1 mg/ml 或者更高），这就是为什么在抗体中加入BSA之类作为稳定剂的原因了；另一方面，加入的蛋白也可以减少抗体由于管壁吸附所造成的损失。但是如果抗体要用来标记的话，则不能加入蛋白稳定剂，因为这些稳定剂会和抗体一起竞争结合标记物。 为了防止微生物污染，叠氮化钠经常被加入到抗体中（终浓度0.02% (w/v)）。 叠氮化钠会干扰任何含有氨基基团的偶联，因此在进行偶联之前，应将叠氮化钠去除。偶联后的抗体可以加入叠氮化钠保存，但是浓度只能是0.01％。对于需要偶联的抗体，thimerosal (merthiolate)可以替代叠氮化钠作为保护剂！ 注：叠氮化钠的去除方式： 可以通过凝胶电泳或过滤的方式去除！IgG的分子量是150kDa (IgM 是~ 600kDa); 叠氮化钠的分子量只有65Da。使用cut off 14kDa的滤膜即可将叠氮化钠从抗体中去除。 纯化IgG: 不要保存稀释的抗体,高浓度有利于保存。IgG会粘附于玻璃或塑料，低于0.1mg/ml的蛋白会很快被吸收并变性失去活性。 1. 收到抗体后请务必在12000rpm离心1分钟后再打开管盖进行分装和保存(如果抗体体积小于50ul，请延长离心时间至5分钟，以保证全部抗体均离心下来）！ Abcam的抗体使用非常特殊的储存管，只有在12000rpm离心1分钟才能将附着在管壁或盖内的抗体全部离心下来。即使是在10000rpm离心也会导致离心不完全，导致出现抗体的量不足的现象！ 2. 对于Abcam大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在 -20oC or -80oC。 对绝大多数抗体来说，保存在-20oC是完全足够了。没有任何证据显示保存在-80oC 会有更多的好处！ 分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。 分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4oC，避免再冻起来！ 抗体工作液应该当天配制当天用完，在4oC 尽量不要超过1天。