原代小肠上皮细胞提取步骤
小鼠原代小肠上皮细胞（Small intestinal epithelial cells, IECs）提取
一、材料准备
1、动物
2、用于组织消化和细胞分离的材料
(1) 75%乙醇；
(2) 组织清洗液：D-hank’s液：
NaCl 8g，Na2HPO4·12H2O 0.126 g，KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，D-Glucose 1.00 g，Na2CO3 0.35 g，配制成1L D-hank’s液，过滤除菌后加入200 U/ml青霉素和0.2 mg/ml链霉素。
(3) 无菌眼科剪和刀片；
(4) 酶消化液：D-hank’s液配制含胶原蛋白酶XI 300 U/ml和中性蛋白酶I 0.1 mg/ml；
(5) 组织分散液：DMEM+5% FBS+2%山梨糖醇；
(6) 器皿：洁净的60 mm培养皿若干，15 ml离心管，50 ml离心管；
3、用于细胞培养的材料
(1) 完全培养基：DMEM，5-10% FBS，0.25 IU胰岛素，50 μg/ml肝素，20 ng/ml EGF，100 U/ml青霉素，0.1 mg/ml链霉素；
(2) 鼠尾胶原蛋白（铺板），12/24孔板;
二、原代小肠上皮细胞提取和培养
组织前处理(1)-(3)
(1) 取出生19天左右小鼠颈椎脱臼处死后用75%乙醇浸泡消毒；
(2) 将小鼠移入超净台内平皿中，剖开腹中线，从盲肠末端开始向上取约15 cm即回肠部，用注射器吸取冰冷的组织清洗液充分清洗去除肠腔中的食物残渣，移入干净的装有清洗液的平皿中；
(3) 充分清理去除肠系膜，沿中线剪开肠管，并在清洗液中充分清洗3-5次（每次换液）；
酶消化(4)-(5)
(4) 将小肠剪成约1 mm3的组织块，移入50 ml EP管中，加入清洗液静止10 min后弃掉上清液，并加入适量酶消化液，37℃摇床孵育20-30 min，孵育结束后上下颠倒离心管3-5 min；(5) 吸取少许与显微镜下观察小肠壁各层分离情况（消化液中由肌肉碎片，多细胞上皮聚集体，单细胞和碎片组成），若70%以上“隐窝/绒毛”单元从肠上皮分离则可加入适量组织分散液或含血清培养基终止酶消化;
IECs纯化(6)- (8)
(6) 轻轻吹打悬液混匀，静置1 min后搜集上清，弃掉沉淀，沉淀中主要为不需要的肌肉碎片等；
(7) 将搜集的上清在800-1000 rpm下离心5 min，弃掉上清，并用组织分散液重悬沉淀；
(8) 重复(6)-(7)操作3-5次，最后一次离心后用完全培养基重悬沉淀；
IECs培养(9)-(12)
(9) 用鼠尾胶原蛋白包被12/24孔板（具体根据说明书进行）；
(10) 计数细胞悬液，将细胞种植到孔板中，24-48小时候观察细胞状态，根据状态2-3天换液一次；
(11) 待细胞状态恢复，并铺满孔板后可按照常规操作进行细胞传代和冻存；
(12) 原代细胞非永生细胞，随着传代代数增加，细胞增殖能力下降，但代数较少时细胞增殖能力也可能尚未完全恢复，因此通常取第3-6代细胞进行实验。
三、原代小肠上皮细胞鉴定: 广谱角蛋白（pan Cytokeratin）免疫荧光染色阳性。
肠道细胞释放操作流程
1、解剖和分离肠道上皮细胞 试剂和仪器设备的准备: （1）无Ca2+/Mg2+的PBS (CMF PBS)恢复至室温 （2）含终浓度5% FBS的无Ca2+/Mg2+的Hank's Balanced Salt Solution 和2mM EDTA，恢复至室温备用。 （3）37°C恒温振荡培养摇床。 注意:步骤1.1到1.7操作时动作要快,以减少细胞死亡的程度和达到最大细胞产量。 1.1 使老鼠在一个二氧化碳室安乐死，用70%乙醇喷雾对腹部和胸部表面进行消毒。 1.2用剪刀在腹部中间剪开一个小的横向切口，并且把皮卷起来露出腹膜 1.3 剪断胃幽门括约肌使小肠上端与胃分离，用镊子去除肠系膜，再剪断回盲部，使完整的小肠与大肠分离。再将肛门边缘剪断，去除肠系膜，使大肠完全分离。 1.4 使用剪刀纵向切开结肠，室温下用CMF PBS洗掉肠腔内的粪便和粘液。 1.5 使用剪刀和镊子减掉小肠表面的PP节，然后纵向剪开小肠。 1.6 在室温下用CMF PBS清洗小肠内腔中的粪便和粘液。 1.7分别把大肠和小肠切成长约1.5厘米的小段，分别放入含有30ml预热的CMF HBSS/FBS 和2mM EDTA的50ml离心管中。一个50ml离心管最多放一个肠道。 1.8将50ml离心管水平地放置于一个摇床上，于37°C ，250 rpm，孵育20min。 1.9 将一个钢网筛置于一个废液桶上，分别将每个50ml离心管的内容物倒在滤网上，回收1.5厘米的肠子片断，再次置于含有30ml预热的CMF HBSS/FBS 和2mM EDTA的50ml 离心管中， 1.10 重复步骤1.8 2. 组织消化和肠道细胞的隔离 试剂和仪器设备的准备:（1）胶原酶溶液:1.5mg/ml的胶原酶VIII溶解在预热的含有40 μg/ml DNase I的CMF HBSS/FBS 溶液中。 （2）预热的CMF HBSS/FBS和2mM EDTA （3）37°C预热的振荡培养摇床 （4）冰预冷的CMF HBSS/FBS
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
原代小肠上皮细胞提取步骤
小鼠原代小肠上皮细胞（Small intestinal epithelial cells, IECs）提取 一、材料准备 1、动物 2、用于组织消化和细胞分离的材料 (1) 75%乙醇； (2) 组织清洗液：D-hank’s液： NaCl 8g，Na2HPO4·12H2O 0.126 g，KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，D-Glucose 1.00 g，Na2CO3 0.35 g，配制成1L D-hank’s液，过滤除菌后加入200 U/ml青霉素和0.2 mg/ml链霉素。 (3) 无菌眼科剪和刀片； (4) 酶消化液：D-hank’s液配制含胶原蛋白酶XI 300 U/ml和中性蛋白酶I 0.1 mg/ml； (5) 组织分散液：DMEM+5% FBS+2%山梨糖醇； (6) 器皿：洁净的60 mm培养皿若干，15 ml离心管，50 ml离心管； 3、用于细胞培养的材料 (1) 完全培养基：DMEM，5-10% FBS，0.25 IU胰岛素，50 μg/ml肝素，20 ng/ml EGF，100 U/ml青霉素，0.1 mg/ml链霉素； (2) 鼠尾胶原蛋白（铺板），12/24孔板; 二、原代小肠上皮细胞提取和培养 组织前处理(1)-(3) (1) 取出生19天左右小鼠颈椎脱臼处死后用75%乙醇浸泡消毒； (2) 将小鼠移入超净台内平皿中，剖开腹中线，从盲肠末端开始向上取约15 cm即回肠部，用注射器吸取冰冷的组织清洗液充分清洗去除肠腔中的食物残渣，移入干净的装有清洗液的平皿中； (3) 充分清理去除肠系膜，沿中线剪开肠管，并在清洗液中充分清洗3-5次（每次换液）； 酶消化(4)-(5) (4) 将小肠剪成约1 mm3的组织块，移入50 ml EP管中，加入清洗液静止10 min后弃掉上清液，并加入适量酶消化液，37℃摇床孵育20-30 min，孵育结束后上下颠倒离心管3-5 min；(5) 吸取少许与显微镜下观察小肠壁各层分离情况（消化液中由肌肉碎片，多细胞上皮聚集体，单细胞和碎片组成），若70%以上“隐窝/绒毛”单元从肠上皮分离则可加入适量组织分散液或含血清培养基终止酶消化; IECs纯化(6)- (8) (6) 轻轻吹打悬液混匀，静置1 min后搜集上清，弃掉沉淀，沉淀中主要为不需要的肌肉碎片等； (7) 将搜集的上清在800-1000 rpm下离心5 min，弃掉上清，并用组织分散液重悬沉淀； (8) 重复(6)-(7)操作3-5次，最后一次离心后用完全培养基重悬沉淀； IECs培养(9)-(12) (9) 用鼠尾胶原蛋白包被12/24孔板（具体根据说明书进行）； (10) 计数细胞悬液，将细胞种植到孔板中，24-48小时候观察细胞状态，根据状态2-3天换液一次； (11) 待细胞状态恢复，并铺满孔板后可按照常规操作进行细胞传代和冻存； (12) 原代细胞非永生细胞，随着传代代数增加，细胞增殖能力下降，但代数较少时细胞增殖能力也可能尚未完全恢复，因此通常取第3-6代细胞进行实验。 三、原代小肠上皮细胞鉴定: 广谱角蛋白（pan Cytokeratin）免疫荧光染色阳性。
提取小鼠隐窝干细胞步骤
提取小鼠隐窝干细胞步骤 1.解剖小鼠，取小肠，用PBS冲小肠里的便便，然后剪开小肠，用载玻片刮小肠绒毛，之后反复冲洗，把250mlPBS用干净。 2.把洗过的小肠拿进细胞房，在５０ml离心管上写个“肠”字，做好标记，倒入25mlPBS，小肠剪成2㎜的长度于离心管，用25ml的移液管，反复冲洗至少五次，吸出上面液体，继续加PBS至15ml,重复冲洗，直至用完500mlPBS.管内肠加PBS剩余约为5ml。 3.加入20ml裂解液，摇床摇15min，去液体留沉淀 4.加入15mlBSA，10ml移液管先用上清润洗，再吹散打匀。把准备好的4个50ml离心管上面和侧面按顺序写上1234，打开管盖，从原离心管吸取10ml于1管（管上加上滤膜），膜上的东西再转移至原离心管，于原离心管加BSA至15ml，吹散打匀，吸取10ml于2管（管上加上滤膜），膜上的东西再转移至原离心管。3和4 管重复上述步骤。离心（时间5min,温度4℃，离心力100。 5.离心完，用吸管去液体留沉淀每管加入10mlBSA，离心（其他条件不变，离心率60） 6.离心完，用吸管吸出上面液体，加入10mlDMEM/F12(1:1)(1×），用吸管吹散混匀，每管吸取1ul于载玻片，显微镜查数，转移至15ml离心管，基本保证各管我们所需的细胞数一致，用DMEM配平后离心（其他条件不变，离心力200) 7.离心完，用吸管吸出上面液体，每管加入30ul贵的培养基（把胶提前拿出来于4℃冰箱解冻，把24孔板提前放入培养箱热着，有利于胶固化），转移至提前放在冰上的1.5ml的做好标记1234的离心管上，用提前放-20℃的黄枪头加入70ul的胶。 8.24孔板点样，每个编号点两个，每个50ul(尽量点在板的中间）做好标记。 9.培养箱放置15min后，再加入450ul贵的培养基，周围一圈孔加入600ul的PBS，防止贵的培养基的挥发，显微镜下观察一下，也可拍照片留证据。 备注： 1.提前准备好PBS，50ml离心管5个，15ml离心管4个，1.5ml离心管4个，25ml移液管一个。10ml移液管5个，一次性滴管4个 2.小鼠提前断食，需要鉴定基因型的记得剪尾巴 3.提前预约制冰机，配好的PBS需放在冷库。 4.准备好灭菌的枪头，剪刀镊子（至少两套，杀鼠一套，细胞房一套） 5.细胞房提前预约，提前把用到的离心管，移液管，胶头滴管，枪头，剪刀镊子，记号笔等放进去紫外线杀菌30min。 6.细胞房里做实验，全程点着酒精灯 7.做完实验，擦干净台面，把酒精灯里装满酒精，移液枪调回最大量程。
原代内皮细胞的分离与培养
原代内皮细胞的分离与培养 材料 1. PBS 3. DMEM/F12. 5. 青霉素G (5000 U/mL) +链霉素(5000 μg/mL). 6. 内皮细胞生长添加剂（ECGS）. 7. 肝素. 8. 热处理FBS。56°C，30 min (see Note 1). 9. HUVEC培养基(Table 1).使用前加温到室温或37°C 。建议分装到50-mL 管，4°C储存，直至使用。避免重复加温和冷却。 10. 胶原酶A(Sigma). 13mg/100mL 溶解到无血清的DMEM/F-12，含青霉素和链霉素分别50 U/mL 和50 μg/mL。0.2-μm filter过滤。应该现用现配。 11. 胰蛋白酶EDTA.A5X储备液（Table2）.0.2-μm filter过滤消毒。以10-mL 分装入50-mL 管，-20°C储存。使用前加40 mL无菌去离子水稀释到1X。4°C保存可达到4 周。 12.纱布(高压灭菌). 13. 套管。 14. 双向开关活塞。 15. 止血钳。 16. 尼龙绳。 17. 手术刀片。 18. 烧杯。 19. 酒精。 20. O.2-μm 滤膜。 21. 漂白粉。 22. 30-mL 注射器。 23. 0.2%明胶。，2% 明胶储备液1 mL 稀释到9 mL PBS制成0.2%明胶工作液10 mL。 24. 50-mL管。 25.100-mm 组织培养板(Falcon). 26. Ficoll-Paque (Amersham). 29. HUVEC冷培养基。需要容量的45% FBS、45% HUVEC培养基和10%二甲基亚砜(DMSO)混合，需要时现配。使用前必须是冰冷的。 30. 抗体：兔抗人vWF) (Dako), 羊抗人VE-cadherin (Santa Cruz). 31. 4%多聚甲醛(Fisher)。在通风橱内，加热到65°e，每100mL PBS溶解4g多聚甲醛。逐滴加入1 M NaOH 直至溶液变清。用0.5 M HCI调整pH 7.0 ，S 4°C储存。 32. Dil-conjugated 乙酰化的LDL(AcLDL)(Molecular Probes). (光敏感)。用无血清的MCDB稀释成10μg/mL。 33. DAPI(4',6-diamidino-2-phenyindole)(Sigma) (光敏感). 水溶解成2 mg/mL 的储备液。储备液分装，-20°e储存。每10mL PBS溶解5μL储备液制成l μg/mL 的工作液。工作液避光储存于4°C，最长2周。
新生仔猪小肠上皮细胞的分离培养和鉴定
新生仔猪小肠上皮细胞的分离培养和鉴定 作者：王静, 张彦明* , 仝钢, 刘芳宁, 周宏超, 何雷, 杨小云, 徐彦召, 洪海霞 ( 西北农林科技大学动物医学院, 杨凌712100) 内容摘要 为更快捷地进行猪肠道病毒性、细菌性疾病及细胞永生化的研究提供便利, 本研究使用多种酶消化法及其他培养法尝试分离培养肠上皮细胞。结果, 利用组织块培养法能成功建立新生仔猪小肠上皮细胞株, 获得的上皮细胞具有较强的增殖能力, 22 h内贴壁并发生细胞分裂, 6~ 7 d明显增殖, 10~ 12 d汇合成单层, 连续传代培养至12代, 细胞基本失去上皮样特征。倒置显微镜下观察, 10代前培养细胞为多角状或卵圆形, 单层生长不重叠, 呈铺路石状排列, 11~ 12代细胞发生变形，间隙增大。细胞角蛋白18鉴定二者均为阳性。电镜下, 纹状缘整齐, 紧密连接结构清晰可见。结果表明利用组织块培养法可以获得能够连续传代、活力较好的猪小肠上皮细胞。 关键词: 新生仔猪小肠上皮细胞；组织块培养；原代培养；鉴定 中图分类号: Q813. 1 文献标识码: A文章编号: 0366- 6964( 2010) 01- 0092- 07 动物细胞的体外培养已被广泛应用于细胞和分子生物学领域。就肠上皮细胞而言, 分离培养技术成为深入研究小肠功能、病理和细胞分化的重要工具[ 1 ] 。肠细胞培养物在生物技术和临床应用方面都有很高的价值, 可用作食品、化妆品、抗肿瘤药品和移植药品等的毒力活性检测[ 2]。国外学者对肠上皮细胞研究较多, 虽然分离方法各有不同, 但多采用酶消化法, 且多局限于小鼠、大鼠和人。啮齿动物肠细胞系如IEC-6[ 3-5] 在研究多种隐窝细胞活性方面, 包括增殖活性、细胞迁移、细胞外基质分子的合成[ 6-8] ,以及在研究细胞分化方面[ 6, 8-9] 都有很重要的意义,相继建成的还有IEC-18[ 10]。关于猪小肠上皮细胞系, 国外已有学者成功建立了来源于成年公猪回肠的IPI-2I[ 11]以及来源于未吃初乳的乳猪空肠的IPEC-J2[ 12]和IPEC-1[ 13], 但国内尚无猪小肠上皮细胞连续传代并成功建系的报道。本研究使用组织块培养法成功的培养了猪小肠上皮细胞, 为构建小肠上皮细胞系奠定基础。 一、材料与方法 （一）材料 无菌条件下取出刚出生12 h 内仔猪的回肠, 剔除肠系膜, 于加入双抗的PBS培养基中冰浴保存,备用。 DMEM/ F12 培养基( Gibco) :添加50 mL # L-1的胎牛血清( Gibco ) 、10 ng # mL-1 EGF
小鼠小肠粘膜上皮细胞处理方法及细胞说明书
小鼠小肠粘膜上皮细胞处理方法及细胞说明书 小鼠小肠粘膜上皮细胞处理方法及细胞说明书仅供参考，具体操作还需要根据到货时细胞密度，细胞生长状态等具体情况，酌情处理。 一．小鼠小肠粘膜上皮细胞贴壁细胞 客户接收到细胞，用75%的酒精消毒（建议配制75%酒精的水是灭菌过的）培养瓶外部。 肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞100X,200X 各一张）。 显微镜观察细胞，当细胞融汇80%左右（可以传代的情况下），细胞应该在37度培养箱预温1-2h后再做处理。如未达到细胞传代密度，培养瓶应预留一部分培养基继续培养。 严格无菌操作，打开细胞培养瓶。 将细胞培养瓶内的培养基用吸管完全吸出（严禁直接倾倒），放入另一无菌容器中（建议换新的培养基培养细胞）。 用PBS2-3ml/次轻轻洗细胞表面，加入适量的0.05%胰酶-EDTA消化细胞,显微镜下观察细胞变圆，轻轻拍打培养瓶直到细胞脱落，加入终止液终止。1000rpm,5min离心，重悬细胞。换新的细胞培养瓶，37℃,5%CO2培养。二．小鼠小肠粘膜上皮细胞悬浮细胞 1.接收到细胞，用75%的酒精消毒（建议配制75%酒精的水是灭菌过的）
培养瓶外部。 2.肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞100X,200X各一张）。 3.严格无菌操作，打开细胞培养瓶。 4.将细胞培养瓶内的培养基用吸管完全吸出（严禁直接倾倒）。 5.1000rpm,5min离心，重悬细胞。换新的细胞培养瓶和新鲜培养基，37℃,5%CO2培养
小肠内分泌细胞系的处理方法与培养步骤【详细】
小肠内分泌细胞系的处理方法与培养步骤【详细】一、细胞介绍 STC-1细胞来源于双重转基因小鼠的肠肿瘤组织。含有连接大鼠胰岛素基因启动子与多瘤病毒小T抗原的融合基因与含有连接大鼠胰岛素基因与SV40的基因结合产生双转基因小鼠。这些小鼠一般患有肠肿瘤以及胰腺β细胞瘤。STC-1细胞产生激素分泌素。 二、细胞特性 1、来源：肠道 2、形态：上皮细胞样，贴壁生长 3、含量：>1x106 4、污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性 5、规格：T25瓶或者1mL冻存管包装 三、细胞的运输和保存 可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式 （1）干冰运输，收到后立即转入液氮或者-80度冰箱冻存或直接复苏； （2）存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。 （3）收到细胞后请拍照，3天内如果发现污染，请及时拍照与我们联系。
四、细胞接收后的处理方法 1、收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。 2、在显微镜下确认细胞生长状态时，最好在低倍镜（4或5X 物镜)下进行，能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X 和20×物镜下，同时给刚收到的细胞拍照，（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为细胞需要售后时提供收到细胞时细胞状态的依据。 3、观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37培养箱放置约2-3h。 4、贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基的原培养瓶中（或新的培养瓶中）。 5、悬浮细胞：T25瓶置于37培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。 6、备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议1：2传代。
原代细胞提取
原代细胞提取 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。原代细胞培养的步骤一般是：取材→分离→培养和维持，今天我们重点介绍原代细胞的取材和分离方法。 原代细胞是通过一定的方法如酶法或机械法或生长法使细胞从人体和动物的母体器官、组织或液体中分离出来，并在受控环境条件下分离的细胞在体外或其他人体和动物体内生长。 原代细胞的提取方法详细步骤： 1.整个操作要在洁净通风的超净台下进行，所有的器材要高压消毒。 2.根据BALB/c小鼠的体重，将小鼠置于盛有75%乙醇的烧杯内，这一步不仅可以消毒，也可以让小鼠体毛浸湿，后续剃去皮毛的时候不会沾到剪刀或组织上。 3.用镊子轻轻挑起小鼠的心脏，装有PBS的注射器插入心尖，同时在右心耳处剪开一个小口，缓慢推动注射器，随着心脏的跳动，将体内的血液冲洗出来。 4.取出小鼠的肺部组织，将肺组织切成小米粒样的大小，
置于预冷的HBSS中反复冲洗几次。 5.将小米粒大小的肺组织置于培养瓶中（培养瓶前一天用1%明胶溶液包被培养面，4度过夜，小鼠处理前，将培养瓶放置培养箱中，使其温度恢复至37度），置于培养箱37度的环境下，消化4个小时。 6.消化4小时后，加入培养基（添加培养基，可以是正常培养时的2倍量），继续培养24小时（继续培养的时间可根据细胞贴壁情况适当调整）。 7.24小时后，取出肺组织，镜下观察细胞状态，换液。 8.原代细胞的提取和培养是很慢的过程，一般需等到24小时后，才能在镜下看到些许细胞群，一周到两周后才会看到鹅卵石样的排列情况。 9.原代细胞2-3天换液一次，因为内皮细胞生长形成单层时，会出现接触抑制现象。所以，内皮细胞生长接近单层时就可以传代了，不要等到长得非常满。
大鼠结肠上皮细胞分离及培养方法的建立
大鼠结肠上皮细胞分离及培养方法的建立 祁燕;李燕舞;王汝俊;唐立海;米红 【期刊名称】《世界华人消化杂志》 【年(卷),期】2012(20)22 【摘要】目的:建立大鼠结肠上皮细胞的原代培养方法,为结肠上皮形态及功能研究提供理想的细胞模型.方法:采用6-15日龄乳鼠,取结肠剪碎、反复清洗后,弃上清,加10 mL、0.1%Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶联合配制的消化液,37℃消化25 min,分离上皮细胞团;吹打消化液,取上清,加入培养基重悬反复离心3次后,细胞沉淀接种于含100 mL/L胎牛血清的完全培养基中,37℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中培养.采用差速贴壁法及相差消化法去除成纤维细胞,细胞贴壁长满瓶80%-90%后用2.5 g/L的胰酶消化液消化并传代.结果:成功分离结肠上皮细胞团且活力较高.24 h后可见部分细胞团贴壁,贴壁细胞为多角形,4-8 d逐渐融合成片,呈现明显的"铺路石"样.细胞经传代处理后成纤维细胞明显减少.免疫荧光染色及透射电镜观察鉴定为上皮细胞.冻存处理复苏后细胞状态较佳.结论:通过该法可建立较稳定的大鼠结肠上皮细胞原代培养体系,为结肠上皮生理、病理及药物作用机制提供了体外研究平台.【总页数】6页(P2030-2035) 【关键词】结肠上皮细胞;原代培养;细胞系 【作者】祁燕;李燕舞;王汝俊;唐立海;米红 【作者单位】广州中医药大学脾胃研究所 【正文语种】中文
【中图分类】R574.62 【相关文献】 1.一种新型大鼠结肠纵行肌细胞分离培养方法的建立 [J], 张婷;胡京红;王晶;王娟;罗武政;闫兴丽 2.微分离方法原代培养大鼠肾近曲小管上皮细胞 [J], 余德芊;王富英;马元芬;刘晓红;秦伟;高原 3.昆明小白鼠肾小管上皮细胞原代分离培养方法的建立 [J], 寇焕起;潘晓亮;周恩库;许梓荣 4.正常SD新生大鼠结肠上皮细胞体外分离的培养与鉴定研究 [J], 翟荣林;王国斌;蔡开琳;田元;许飞 5.大鼠阴道黏膜上皮细胞原代分离及培养方法的改进 [J], 刘方方;李亚楠;张明乐;黄向华 因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买
原代细胞分离常采用的方法
原代细胞分离常采用的方法 原代细胞分离常采用的方法有以下两种： 一、悬浮细胞的分离法 1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/min的低速离心5分钟； 2、去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/min 离心5分钟。此步重复两次； 3、用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养； 4、如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。 二、机械分散法 适合的组织：纤维成分较少的脑组织、部分胚胎组织、以及一些肿瘤组织等，但是这一方法对组织的损伤较大。 过程：用PBS清洗两次后， (1) 剪刀剪碎切后用吸管反复吹打，分散组织细胞； (2) 将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出； (3) 或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。 原代细胞培养基本和常用的是组织块法和消化法 一、组织块培养法 处死动物，无菌取组织块入校烧杯内，用尖嘴眼科剪刀将组织块剪碎，吸管吸取PBS液冲下剪刀上的碎片，补加PBS，用吸管轻轻吹打，低速离心，弃去上清液，留下组织块，然后接种于培养瓶。 二、消化培养法 用消化液将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使组织松散、细胞分散形成悬液。 消化过程中常用的消化液： 1、胰蛋白酶
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。 在 pH 为 8.0 、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力强。 2、胶原酶 胶原酶（collagenase）是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。当拟消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，这时可采用胶原酶解离细胞法。 胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。 胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。 a、胶原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞，用于哺乳动细胞的分离； b、胶原酶Ⅱ适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织； c、胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它能消化多种组织； d、胶原酶Ⅴ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它可用于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。 下面让我们举几个实例： 正常大鼠心肌成纤维细胞培养（组织块法）： 1、将取出的心脏组织至于无菌的培养皿中用含双抗的1×PBS （pH=7.4）清洗若干次至无明显血细胞； 2、剪开心脏组织的心房和心室部分，用含双抗的1×PBS （pH=7.4）清洗若干次以去除心脏内部的大部分血液； 3、将清洗好的心脏组织剪成2mm3大小，加入含双抗的1×PBS （pH=7.4）清洗；然后转入15ml离心管，300r/min,离心3min后弃上清液。重复2-3次，直至离心后的液体中观察不到明显的红色。 4、将清洗好的组织块重新转至无菌的培养皿中，用无菌的200ml
鸡肠上皮原代细胞体外分离培养与鉴定
鸡肠上皮原代细胞体外分离培养与鉴定 师润;杨霞;陈陆;余秋颖;王川庆 【期刊名称】《江苏农业科学》 【年(卷),期】2013(41)1 【摘要】为了探讨鸡肠上皮原代细胞分离培养方法,进一步研究人源志贺菌对鸡的致病性和为相关侵袭特性提供体外模型,分别取不同日龄鸡胚,用0.1 g/mLⅠ型中性蛋白酶和300 U/mLⅪ型胶原酶联合分离纯化鸡肠上皮原代细胞,筛选其最佳培养方法,并对培养细胞进行鉴定；然后采用0.125％胰酶和0.01％ EDTA联合消化进行鸡肠上皮原代细胞传代.结果显示,应用Ⅰ型中性蛋白酶和Ⅺ型胶原酶消化15日龄鸡胚肠组织可获得满意的肠上皮细胞分离效果,细胞贴壁性良好.培养出圆形或多角形单层生长呈“铺路石样”的细胞,培养的细胞在12 h内贴壁,24 ～48 h明显增殖,72 h后细胞增殖速度减慢,生长状况不良.经透射电镜观察鉴定为肠上皮细胞.且传代后细胞贴壁生长良好.建立的鸡肠上皮原代细胞分离培养方法可获得纯度较高的鸡肠上皮原代细胞,制备的细胞可以连续传代3次. 【总页数】4页(P34-37) 【作者】师润;杨霞;陈陆;余秋颖;王川庆 【作者单位】河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002 【正文语种】中文 【中图分类】S831.2 【相关文献】
1.仔猪小肠黏膜上皮细胞体外分离培养及鉴定 2.肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞的体外分离、鉴定及其原代培养吸收模型的构建与评估 3.鸡胚小肠上皮细胞的体外分离培养和鉴定 4.新生家兔空肠上皮细胞的体外分离培养与鉴定 5.牛乳腺上皮细胞体外分离、培养和鉴定的研究 因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买
鲫肠道上皮细胞原代培养方法的研究
鲫肠道上皮细胞原代培养方法的研究 宋增福;吴天星;潘晓东 【摘要】探讨了健康鲫(Carassius auratus)幼鱼肠道上皮细胞的原代培养方法.结果显示,用含有抗生素、胶原蛋白酶Ⅰ、EDTA和胶原蛋白酶Ⅳ组成的D-Hanks液消化无菌分离的鲫肠道可以获得大量细胞团及绒毛隐窝;用含有抗生素、胎牛血清(FBS)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素的DMEM培养液进行培养,并根据肠道上皮细胞与成纤维细胞贴壁时间的差异进一步纯化,连续培养12d后可以得到纯化的肠道上皮细胞. 【期刊名称】《淡水渔业》 【年(卷),期】2008(038)001 【总页数】4页(P67-69,34) 【关键词】鲫(Carassius auratus);肠道上皮细胞;原代培养 【作者】宋增福;吴天星;潘晓东 【作者单位】浙江大学动物科学学院,杭州,310029;上海水产大学生命学院,上海,200090;浙江大学理学院,杭州,310029;浙江大学动物科学学院,杭州,310029【正文语种】中文 【中图分类】Q172 肠道是人和动物重要的消化吸收器官和最大的黏膜免疫器官[1,2]。肠道上皮细胞直接与食物、微生物等接触，与动物机体的生理、营养、免疫密切相关。因此，肠
道上皮细胞是研究肠道生理功能、药物代谢以及病理变化重要的细胞模型。尽管人和哺乳动物肠道上皮细胞的培养在已经获得成功[3～5]，但是国内未见有关鱼肠道细胞培养的详细报道，国外对鱼肠道上皮细胞分离培养的研究也较少[6]。本试验拟参照人的肠道黏膜上皮细胞(IECs)分离培养方法[7]，探索了鲫肠道上皮细胞原代的分离培养方法及纯化技术，以期为开展鱼肠道上皮细胞相关的生理及病理等相关研究提供基础资料。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 鲫：体长4～6 cm，体重10～12 g左右的健康鲫幼鱼。 试验试剂：DMEM高糖培养液(GIBCO)，D-Hanks液，胶原蛋白酶Ⅰ型、Ⅳ型(Sigma),抗生素液(青霉素、链霉素、庆大霉素)，鼠表皮生长因子，胰岛素(Sigma)，胎牛血清(GIBCO)。 1.2 方法 1.2.1 材料前处理及细胞分离 鲫饲养于含抗生素液(青霉素、链霉素、庆大霉素)的水体中，禁食数天。头部敲打致死，放入70%乙醇中消毒1 min。在无菌室中取出中段肠道，剪除肠系膜，纵行剪开肠壁，用D-Hanks液(其中含青霉素20万IU/L、链霉素200 mg/L和庆大霉素20万U/L)冲洗数次，洗去黏液。将肠壁剪碎，加入含有胶原蛋白酶Ⅰ0.2 g/L、EDTA0.02%和胶原蛋白酶Ⅳ0.2 g/L的D-Hanks液，28 ℃水浴中振荡消化20 min，吸管反复吹打直到光镜下出现大量细胞及细胞团，加入DMEM含5%胎牛血清终止消化，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入含抗生素的DMEM 制得细胞悬液。 1.2.2 培养与纯化 将细胞悬液接种于24孔培养板，培养板底壁涂有Ⅰ型胶原，每孔接种浓度为
原代细胞培养之——细胞分离技术（二）
原代细胞培养之——细胞分离技术（二） （2）胶原酶（Collagenase）消化法 胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS 和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。 经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。 鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性（见表4-1）和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间（小时）有差异（见表4-2），以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶（对细胞表面糖基有作用），采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。 表4-1 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别 项目胰蛋白酶胶原酶 消化特性适用于消化软组织适用于消化纤维多的组织 用量 0.01%～0.5% 0.1～0.3mg/mL(200u/mL) 消化时间 0.5～2小时（小块） 1～12小时 pH 8～9 6.5～7.0 作用强度强烈缓和 细胞影响时间过长有影响无大影响 血清、钙、镁离子有影响无影响 表4-2 胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块时所需时间(小时)(0.5～1cm3) 酶种类较硬组织软组织
细胞原代培养实验具体步骤及方法
细胞原代培养实验具体步骤及方法 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。 一、实验材料准备 1. Hank's液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至1 000 ml。Hank's液可以高压灭菌。4℃下保存。 二、具体操作 1. 将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。 2. 用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 3. 用手术剪将肝脏剪成小块（1 mm2），再用Hank's液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 5. 加入3-5 ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 6. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 7. 1 000 rpm，离心10分钟，弃上清液。 8. 加入Hank's液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 9. 加入培养液1-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。 10. 将细胞调整到5x105/ml左右，转移至25 ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 注意 1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。 2. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
原代细胞培养之--细胞分离技术
原代细胞培养之－－细胞分离技术 原代细胞的分离和制作 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下： 一、悬浮细胞的分离方法 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。 二、实体组织材料的分离方法 对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。 （一）机械分散法 所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。 （二）消化分离法 组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。 1、酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下： （1）胰蛋白酶分散技术
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤 一、原代培养与其操作步骤 原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后,经机械以与消化分离成单个细胞或单一型细胞群,使之在体外模拟人体生理环境,在无菌、适当温度和一定的营养条件下,生存、生长和繁殖.原代培养细胞常有不同的细胞成分,生长缓慢,但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征.利用原代细胞培养做各种实验,如药物测试、细胞分化与病毒学方面的试验效果很好.其操作步骤如下. 1.剪切组织先将所取得的组织,用D-Hanks或Hanks液清洗,以去除表面血污,并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织.再次清洗后,用手术刀将组织切成若干小块,移入青霉素小瓶或小烧杯中,加入适量缓冲液,用弯头眼科剪,反复剪切组织,直到组织成糊状,约1mm3大小.静置片刻后,用吸管吸去上层液体,加入适当的缓冲液再清洗一次. 2.消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞,以利于进一步的培养,常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶. 3.培养细胞悬液用计数板进行细胞计数.用培养液将细胞数调整为〔2～5〕×105 cells／ml,或实验所需密度,分装于培养瓶中,使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜.置CO2培养箱内,5％CO2,37℃静置培养.一般3～5d,原代培养细胞可以黏附于瓶壁,并伸展开始生长,可补加原培养液量1／2的新培养液,继续培养2～3d后换液,一般7～14d可以长满瓶壁,进行传代. 4.注意事项 〔1〕无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因,必须加强各个环节的无菌操作观念,以预防为主,一旦污染,一般很难消除. 〔2〕培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件.由于细胞来源的动物种类、组织类型不同,对培养液的要求有一定的差异,必要时可用预实验的方法选择适当的培养液. 〔3〕小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用.可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析.一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后,就保持应用至实验完成. 〔4〕胶原酶溶液：必须新鲜配制,贮存时间过长<即使是-20℃低温保存>,也将影响消化效力,导致消化时间过长,细胞损伤增加.
肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞的体外分离、鉴定及其原代培养吸收模型的构建与评估
肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞的体外分离、鉴定及其原代培养吸 收模型的构建与评估 张树敏;廖秀冬;吕林;张丽阳;罗绪刚 【摘要】本试验旨在评估十二指肠上皮细胞不同接种密度对细胞紧密连接性及细胞活力的影响,为建立肉鸡鸡胚体外原代培养十二指肠上皮细胞吸收模型选择最佳的细胞接种密度.试验采用单因子完全随机试验设计,共设3个组,Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞接种密度分别为2.90×106、6.25×106、8.75×106个/mL,每个组6个重复,共培养4 d.结果表明:1)刚分离的十二指肠上皮细胞团呈球形,且细胞团的大小均一,悬浮于培养液中,贴壁后细胞团开始向外伸展,逐渐铺成片,细胞之间界限清晰、贴壁均匀,呈单层"铺路石样"生长.2)经碱性磷酸酶染色,阳性试验组的十二指肠上皮细胞胞浆被染成了蓝黑色,阴性对照组的十二指肠上皮细胞不着色.3)在细胞培养的48和72 h,Ⅰ组和Ⅱ组细胞的跨膜电阻(TEER)值均满足大于300Ω·cm2的试验要求,酚红透过率均满足小于5％的试验要求,并且Ⅰ组细胞的TEER值显著高于Ⅱ组(P<0.05),细胞酚红透过率显著低于Ⅱ组(P>0.05).4)在细胞培养的24和48 h,Ⅰ组细胞培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)活力均显著低于Ⅱ组和Ⅲ组(P<0.05).以上结果表明,细胞接种密度为2.90×106个/mL,培养时间为48 h时,细胞间界限清晰、生长状态良好、紧密连接性强,细胞活力最佳,说明原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞物质吸收模型构建成功,可为后续十二指肠上皮细胞的吸收规律及其分子机制的研究提供了良好的试验模型. 【期刊名称】《动物营养学报》 【年(卷),期】2018(030)008