烟草遗传转化体系的建立

本科生毕业设计（论文）

（ 2015届）

农业与食品科学学院

题目：烟草遗传转化体系的建立

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2015 年 5 月18 日

本科生毕业设计（论文）诚信承诺书

我谨在此承诺：本人所写的毕业设计（论文）《烟草遗传转化体系的建立》均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了引用注释，如出现抄袭及侵犯他人知识产权的情况，后果由本人承担。

承诺人（签名）：

年月日

目录

本科生毕业设计（论文）.............................................................................................. 封1 本科生毕业设计（论文）诚信承诺书...................................................................................... 封2 1 前言. (1)

1.1 农杆菌介导法 (1)

1.2 基因枪法 (2)

1.3 PEG法 (2)

1.4 显微注射法 (2)

2 材料与方法 (3)

2.1 试验材料 (3)

2.1.1 植物材料 (3)

2.1.2 菌株和质粒 (3)

2.2 试验方法 (3)

2.2.1 农杆菌的制备 (3)

2.2.2 叶片表面消毒 (3)

2.2.3 预培养-侵染-共培养 (4)

2.2.4 特美汀对农杆菌的抑制作用 (4)

2.2.5 芽分化-卡那霉素浓度的测定 (4)

2.2.6 根分化 (5)

2.2.7 炼苗-移栽 (5)

2.2.8 转基因植株的分子鉴定 (5)

3 结果与分析 (6)

3.1 农杆菌菌液侵染时间对转化效率的影响 (6)

3.2 共培养时间对转化率的影响 (7)

3.3 特美汀对根瘤农杆菌的抑菌效果 (7)

3.4 卡那霉素浓度对烟草叶片外植体出愈率的影响 (8)

3.5 转基因植株的分子鉴定 (8)

4 讨论 (9)

参考文献 (9)

致谢 (11)

烟草遗传转化体系的建立

农业与食品科学学院农学111 吴春盛指导教师：郑志富摘要：利用农杆菌介导的转化法获得转基因植物,这是研究目的基因功能的一种有效方法。本研究将通过探索农杆菌的浸染时间、共培养时间、不同度浓度的特美汀抗生素抑制农杆菌的效果以及不同浓度的卡那霉素（Kan）影响抗性芽分化等因素对烟草K326叶盘转化率的影响,建立一种稳定、高效的烟草K326遗传转化体系。

关键词：烟草；组织培养；农杆菌；遗传转化

Eestablishment of a Tobacco Genetic Transformation

System

Abstract: Using agrobacterium-mediated transformation to genarate transgenic plants is an effective way to study gene function. This study was aimed to investigate the factors influencing the efficiency of tobacco leaf disc-based transformation, including the infection time of Agrobacterium, co-cultivation time with Agrobacterium, various concentrations of timentin with inhibitory effects on Agrobacterium growth, and different concentrations of Kanamycin (Kan) affecting differentiation rates of the resistant buds in attempt to establish a robust and efficient genetic transformation system of Nicotiana tabacum L. cv K326.

Key words: Nicotiana tabacum, Tissue culture, Agrobacterium, Genetic transformation

1前言

所谓遗传转化，是指通过自然或人工感受态细胞的摄取，将同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA分子)转入受体细胞或组织中，并在后代中表达基因特性的基因转移过程。根据感受态细胞的构建方式，遗传转化可以分为自然遗传转化和人工转化两种，其中，自然遗传转化的感受态细胞的出现是细胞本身在一定生长阶段的生理特性，而人工转化则是在人为诱导的基础上，细胞的结构发生一定的变化而具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA分子直接注入细胞内[4]。常用的遗传转化方法有如下几种：

1.1 农杆菌介导法

根瘤农杆菌介导的遗传转化方法获得了第一批能表达外源基因功能的转基因植物。用根瘤农杆菌转化体系获得的转基因植株占到了已转化成功的近200种转基因植株的80%以上[4]。这种方法具有操作简单、转基因拷贝数低、转化率高、操作成本低等优点[5]，已受到人们的高度重视，并成为植物转基因研究的主要方法之一。

农杆菌属于革兰氏阴性菌种，在基因操作中，常用的两类菌种是根瘤农杆菌（含致瘤Ti质粒）和发根农杆菌（含致根Ri质粒）[6]。目前，在遗传转化中研究得最广泛且最常用的是Ti质粒，当外植体被根瘤农杆菌感染时，根瘤农杆菌环状Ti质粒上的一部分DNA可以整合到被感染植物的基因组中，且其携带的基因能在后代中稳定表达，但农杆菌本身不侵入植物的细胞[12-13]。农杆菌介导的遗传转化法的主要过程为：（1）细菌亲近植物的感受态细

胞；（2）Ti质粒环状DNA上的相关基因被激活；

（3）Ti质粒上的T-DNA被切割并形成T-DNA 复合物；（4）T-DNA复合物进入植物细胞；（5）T-DNA整合到植物基因组中并表达[14]。

1.2 基因枪法

基因枪法，又称散弹轰击法，它的基本原理是：将携带有外源DNA的微粒，如金粒、钨粒等，在高压作用下高速射人受体细胞或组织。微粒进入细胞或组织后，其携带的外源DNA便可以整合到植物的基因组中并表达，从而实现基因的转化。基因枪法的缺点是转化率低、价格昂贵、整合过程中易发生重排等[15]。

1.3 PEG法

PEG即聚乙二醇，是一种多聚化合物，它能与DNA在电荷电场力的作用下形成特殊的复合物，并由植物原生质体的内吞作用直接进入细胞。PEG法对禾本科作物有重要作用，水稻、玉米、小麦、高梁等多种作物的原生质体已用PEG法进行了成功的转化。但要使原生质体分化形成再生植株难度很高，且PEG法在遗传转化中转化效率很低，因此PEG法至今还没有得到广泛应用[16]。

1.4 显微注射法

显微注射法是指利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核中。显微注射中的一个重要问题是受体细胞的固定。显微注射用的微针要求极细，针尖直径以0. 5 μm 左右为宜，一次注入细胞质中的DNA量约为109/ mL。该方法转化效率高，在多种植物的原生质体转化率高达60 %以上，如烟草、油菜等[17]。

自1983年比利时根特大学研制成第一例可育的转基因植物以来，现在转基因植物巳扩展到包括根食作物、经济作物、花卉、树木等在内的35个属、120多个物种[6]。

在烟草种植中引入转基因技术已有多年的历史，最初生物学家在某些烟草品种中进行了许多尝试，被整合到烟草中的细菌基因为数不多，在下一代烟草中都继承了这些基因的属性。

烟草的组织培养技术简单，且以烟草作为外植体的遗传转化能获得较高的转化率，因此，烟草已经成为遗传转化研究的模式植物。近年来，我国已经有许多关于烟草转基因的研究，研究工序也日趋完善。国内已有成功将甜蛋白基因、人组织型纤溶酶激活剂（t-PA）基因、渗透胁迫相关基因等等导入烟草基因组的研究[1-3]，转基因烟草给许多烟农带来了可观的收益。

自1996年起，转基因烟草相继引进到国内的许多地方开始种植，并做了许多国内外的贸易。这些转基因烟草的主要特点是，烟草中导入了抗病菌性的基因，这在控制烟草疾病方面非常有效。对农民来说，他们对很少了解转基因烟草的种植信息。但很接受抗病毒的技术在烟草中得到应用。

从全球范围来看，转基因作物的种植面积从1995年开始逐步增长，到2002年，全球大约有550-600万亩的烟草种植面积。美国、加拿大、中国、印度、德国等国家都有种植商业转基因作物，其中美国的转基因烟草种植面积达到了全球的67%，加拿大为6%，中国为4%[9]。用生物技术种植作物的优势有环境优势、作物的潜在生产、加工者和消费者的利益等[20]。

有人断言：“21世纪将是生命科学的世纪”。这个命题囊括三层意思：；①与其他学科相比，生命科学有更显著的发展；②与其他学科相比，生命科学对人类社会的进步和科技业的发展有更大的影响；③生命科学对其他学科将发挥较大的推动作用[10-11]。随着现代科学技术的不断创新，我们已经进入了一个以高科技引领生产与生活的时代。在生物学领域，植物组织培养、基因工程等生命科学技术为现代农业生产提供了高效、高产的生产手段，同时，这

些技术也为人们研究植物的潜在用途提供了途径，使其在植物育种与繁殖、生物化合物的工业化生产和植物的种质资源保护等方面得到了广泛的应用[18-19]。

植物组织培养是以植物细胞具有全能性作为理论基础的一项植物无性繁殖技术。广义的植物组织培养也叫离体培养，是指从植物体分离出所需的组织、器官或细胞作为外植体，在无菌条件下，接种到含有植物所需营养物质和植物激素的培养基上培养，最终获得完整植株或其他有价值产品的技术。狭义的植物组织培养是指用植物的各部分组织，如叶组织、胚乳等在培养基上诱导愈伤组织，进而继续分化芽和根，最终获得完整组织的技术。在培养过程中，需要根据植物的特性来配制合适的培养基，可以通过加入不同种类和不同浓度的植物激素来使愈伤组织向指定方向分化，同时要控制好光照、温度、湿度等外界条件[21-23]。

近年来，随着分子技术的飞速发展，遗传转化的方法在植物转基因工程中的转化率越来越高，且可以在植物中转入大片段的DNA，表达效果也越来越好，而且，随着简单仪器和操作技术的开发，转基因技术已引起了人们的极大关注[8]。

本研究将以普通烟草品种K326的叶片作为外植体，通过根瘤农杆菌GV3101介导法，将质粒pBI121导入烟草中，经不同浓度的卡那霉素（Kan）帅选，获得Kan抗性植株，其中部分抗性植株的PCR检测呈阳性，为烟草K326建立一个稳定、高效的遗传转化体系。

2材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 植物材料

本试验用的是普通烟草品种K326，将烟草种子放于小布袋中，并置于20℃左右的水中浸种一昼夜，使种子吸收充足的水分，然后除去多余水分，进行催芽。催芽时，每天翻动种子一次，并用温水冲一次，以洗去种子的代谢物，催芽5天左右种子胚根长出，便可播种到基质培养基中。经正常的浇水、施肥管理约2个月后，可获得本试验所用的烟草小苗。

2.1.2 菌株和质粒

本试验使用的转化受体菌为根瘤农杆菌GV3101，载体为含卡那霉素抗性基因和目的基因的质粒pBI121。

2.2 试验方法

2.2.1 农杆菌的制备

挑单克隆于10 mL肉汤培养基（LB培养基，Kan的终浓度为50 μg/mL）中，在28℃、转速220 rpm的条件下培养。

培养24 h后取80 μL菌液转接于10 mL LB培养基（Kan的终浓度为50 μg/mL），在28℃、转速220 rpm的条件下继续培养。

12 h后测得菌液的OD600 =1.0，则在转速3000 rpm、4℃条件下离心5 min，弃上清。

用30 mL TSM悬浮农杆菌，在转速3000 rpm、4℃条件下离心5 min，弃上清。

再用TSM悬浮农杆菌，使菌浓度的最终OD600 =0.8-1.0。

2.2.2 叶片表面消毒

取普通烟草品种K326顶部的嫩叶片作为实验材料（长约8 cm,宽约5 cm）。

在超净工作台上，用75%的酒精将材料浸泡30 s，边浸泡边摇晃。

去掉酒精，用无菌水洗一遍。

再用10%的次氯酸钠（0.05%的吐温-20）浸泡材料10 min ,边浸泡边轻轻振荡。

最后用无菌水洗4遍，完成材料的表面消毒。

2.2.3 预培养-侵染-共培养

在超净台工作上用经灭菌处理后的剪刀或刀片将消毒后的叶片切成边长0.5-1.0 cm的

正方形小块，平铺于（正放）不加抗生素的TSM培养基上，并用镊子轻轻顶叶片的正面，使叶片底面与培养基充分接触，每个培养皿放10个左右的小叶片，用封口膜把培养皿封好，放于暗处、25±1℃的条件下预培养2-3天。

预培养2-3天后，在干净的培养皿中准备好所配制的农杆菌菌液5 mL左右，在超净台上用镊子将预培养过的叶片从TSM培养基中取出，放入所制备的OD600 =0.8-1.0的农杆菌菌液中分组编号侵染，侵染时间为2、5、8、11 min，侵染过程中轻轻摇晃菌液，使叶片充分侵泡在菌液中。统计结果从而确定农杆菌的侵染时间。

叶片经不同时间的农杆菌侵染后，用无菌滤纸吸干叶片上多余的菌液，并用镊子将叶片反放于不加抗生素的TSM培养基上，同时用镊子轻轻挤压叶片，使叶片正面与培养基充分接触，每个培养皿放4-5个小叶片，用封口膜封好培养皿后，放在室温23±1℃、暗处条件下进行共培养，每个不同的侵染时间处理共培养的时间设四组对照，共培养时间分别为1天、3天、5天、7天。整理试验结果数据，确定共培养的最适宜时间。

2.2.4 特美汀对农杆菌的抑制作用

将共培养后的外植体分别转到含不同浓度特美汀（600、500、400、300、200、100 mg/L）的分化培养基上培养，每个处理20个外植体，设4组重复，统计外植体的污染率和芽分化率，从而确定本试验最适宜的抗生素浓度。

此过程中的分化培养基（TSM）配方（1 L）如下：

基本培养基（MS）：4.4 g

蔗糖（Sucrose）：30 g

萘乙酸（NAA）：终浓度0.1 mg/mL，预先做灭菌处理

6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）：终浓度1 mg/mL，预先做灭菌处理

特美汀（Timentin）：终浓度分别为600、500、400、300 、200、100 mg/L，预先做灭菌处理

配制方法：取500 mL左右蒸馏水倒入干净的大烧杯（2 L）中，用天平分别称取MS 4.4 g、蔗糖30 g放入烧杯中，搅拌烧杯中的溶液至固体物质完全溶解，然后用量筒取蒸馏水将烧杯中的溶液定容至1 L，最后用氢氧化钠溶液（NaOH，或氯化氢溶液HCl）将溶液的氢离子浓度指数（pH值）调节至5.8。

将经上述处理后的溶液分装到3个500 mL的容量瓶中，并放在120℃的高温灭菌锅中（在灭菌锅温度达到90℃时放入）快速灭菌15 min后取出，待瓶中培养基冷却至55℃左右时（注意温度不能冷却得太低，以防止培养基凝固），在无菌操作条件下，用移液枪分别取1 mL的NAA、1 mL的6-BA和10 mL的特美汀注入容量瓶中并轻轻摇匀，将培养基倒至培养皿中，培养基约占培养皿1/3的体积，用封口膜封好培养皿，并对培养皿编号以备用。

2.2.5 芽分化-卡那霉素浓度的测定

在超净台上用经灭菌后的镊子将达到共培养时间后的外植体正放分化培养基上分组培养，每组培养基中含有不同浓度的卡那霉素，浓度分别为20、40、60、80、100 μg/mL，在室温23±1℃、16 h/d的光条件下进行筛选培养，统计外植体的出芽率，从而确定卡那霉素

的筛选浓度。

2.2.6 根分化

待芽体长至2-3 cm（培养约40天后）时，在超净台中将芽切下，放于生根培养基中做生根培养，培养条件为23±1℃、16 h/d光照。

大约1周后就可观察到根的形成。

转入生根培养基约3周后，芽体的根部发育基本完成，可获得无菌苗，这时无菌苗可炼苗移栽。

此步骤所需的生根培养基（TRM）配方（1 L）如下：

1/2MS：2.2 g

Sucrose：15 g

NAA：终浓度1 mg/mL，预先做灭菌处理

Timentin：终浓度30 mg/mL，预先做灭菌处理

生根培养基的配制方法参照配制分化培养基的配制方法进行配制以备用。

2.2.7 炼苗-移栽

当无菌苗的根须长长至4-5 cm时，打开培养瓶的瓶盖，向瓶内倒入高出培养基约1 cm 的水，并放在室内进行炼苗培养，培养条件为23±1℃、16h/d光照。

炼苗培养3-5天后，将附在移栽苗根部的培养基除去，此过程要小心，以免破坏根须。

将小苗盘栽到基质培养基中培养，培养的8株小苗全部成活，成活率为100%。

此次培养过程如图1所示：

图1 烟草遗传转化体系的构建过程图示

2.2.8 转基因植株的分子鉴定

(一）植物总DNA的提取（SDS法）

1）药品试剂

①提取缓冲液：200 mM Tris-HCl，250 mM NaCl，25 mM EDTA，0.5% SDS，用HCl

调pH值至7.5，各药品在用前经高压灭菌（120℃，20 min）

②双蒸水（ddH2O），高压灭菌

③异丙醇（用前预冷）

④70%乙醇（配制方法：30 mL ddH2O+70 mL无水乙醇混匀）

⑤1×TE：10 mM Tris，1 mM EDTANa2，两药品混合后用浓HCl调溶液的pH值至7.5

2）方法步骤

①取拇指盖大小的幼嫩烟草叶片放在1.5 mL的离心管中，加400 μL提取缓冲液，用小杵将叶片充分捣碎。

②将离心管盖好并放到离心机上离心，离心条件为12000 rpm，时间10-15 min。

③用移液枪取上清至另一1.5 mL离心管中，加入200 μL的异丙醇（异丙醇提前4℃下冷却），混匀后放在—20℃的条件下沉淀10 min。

④沉淀10 min后6000 rpm离心10 min，除干净上清。

⑤加500 μL 70%乙醇洗沉淀，震荡离心管使沉淀悬浮。

⑥沉淀完全悬浮后12000 rpm离心5 min，重复上述⑤步骤一次。

⑦再次12000 rpm离心5 min，弃掉上清，将离心管放在超净台上吹干离心所得的沉淀，然后加入30-50 μL的TE溶解DNA。

（二）PCR检测

1）定量引物做做常规PCR反应，反应体系（20 μL）为：

双蒸水（ddH2O）：14.2 μL

10×PCR扩增缓冲液（10×buffer）：2 μL

dNTP：1.6 μL

上游引物（FP）：0.5 μL

下游引物（RP）：0.5 μL

Taq酶：0.2 μL

Template：1 μL

以上操作均在冰上进行。

将以上反应体系加到一0.2 mL的PCR管中，瞬时离心，在PCR仪上按如下条件反应：95℃热变性，5 min，然后95℃变性，30 s，55℃复性，30 s，72℃延伸，1 min，32个循环，最后72℃延伸，10 min，10℃保温。

序列：

FP（5’—3’）：GCTATGACCA TGA TTACGCCAA

RP（5’—3’）：GACTGACCCACCCGGGGAT

3结果与分析

3.1 农杆菌菌液侵染时间对转化效率的影响

农杆菌侵染时间对转化效率的影响很大，侵染时间过短，农杆菌不能有效附着在叶片上，就会降低共培养时农杆菌质粒的侵入效率，转化率就会降低；农杆菌侵染时间过长，外植体受到农杆菌的伤害程度增大，抗性芽分化的效率也会降低。所以，本试验中农杆菌的侵染时间要严格控制。由图2数据，本试验的共培养时间定为5 min，此时的抗性芽分化率为42.3%。

图2 农杆菌侵染时间对转化效率的影响

3.2 共培养时间对转化率的影响

随着共培养时间延长，外植体的污染率也逐渐增大。共培养时间短，抗性分化率低，外植体污染率也最低；共培养时间过长时，农杆菌生长旺盛，除菌不彻底，致使抗性芽的分化率明显下降。根据本试验结果（图3），共培养时间为3天时，抗性芽的分化率达到最高的32.5%，所以，本试验中外植体与农杆菌的共培养时间选定为3天。

图3 共培养时间对外植体抗性芽分化率的影响

3.3 特美汀对根瘤农杆菌的抑菌效果

由图4可知，当培养基中的特美汀浓度低于200 mg/L时，农杆菌的生长没有得到有效的抑制，外植体污染较严重，导致死亡率较高；当特美汀浓度时，外植体污染率明显降低，但白化现象严重，抗性芽的分化率也随之降低，特美汀浓度为600 mg/L时，抗性芽的分化率不足10%；当特美汀浓度为300 mg/L时，抗性芽的分化率达到最高值，为37.8%，这时的外植体污染率也相对较低。所以，本试验的特美汀浓度定为300 mg/L。

图4 特美汀浓度对农杆菌的抑菌效果

3.4 卡那霉素浓度对烟草叶片外植体出愈率的影响

在烟草转化系统中，叶外植体的分化能力很强，每片叶可分化的再生芽较多，这会导致后期假阳性植株的删除工作难度增大。因此，为了在早期的培养中获得较高频率的阳性植株，本试验在分化培养基中加入不同浓度的卡那霉素来确定外植体的筛选浓度。在含低浓度卡那霉素的培养基上外植体能正常长出愈伤，分化出芽；在含较高卡那霉素浓度的培养基中，叶片不能形成愈伤分化芽，并出现白化死亡现象。因此，选用的培养基中卡那霉素的筛选浓度是本试验的关键因素之一。

本试验结果（表1）表明，不同的卡那霉素浓度对烟草外植体的分化有不同程度的抑制作用。当培养基中的卡那霉素浓度在20-60 μg/mL时，烟草外植体能正常长出愈伤，也能正常分化出芽；当卡那霉素浓度大于60 μg/mL时，外植体的分化受到不同程度的抑制；当卡那霉素浓度为100 μg/mL时，外植体不能正常长出愈伤组织，甚至出现白化死亡现象。因此，为避免后期的假阳性删除工作难度增大，本试验中培养基的卡那霉素浓度选定为100 μg/mL。

表1 卡那霉素浓度对外植体出芽率的影响

卡那霉素浓度（μg/mL）外植体数

（个）

芽数

（个）

出芽率

（%）

20 50 41 82

40 50 30 60

60 50 17 34

80 50 8 16

100 50 2 4

3.5 转基因植株的分子鉴定

由图5可以看出，除了阴性对照植株9没有扩增出与质粒DNA扩增产物相同的特异性条带，其余的转基因植株1-8的DNA都扩增出了与质粒DNA扩增产物相同的特异性条带，初步验证试验烟草品种成功导入了目的基因。

图5 转基因烟草PCR鉴定结果

图6 转基因烟草基因组PCR

4讨论

要建立一个高效、稳定的烟草遗传转化系统，需要考虑很多因素对遗传转化的影响。首先，选择合适的培养基至关重要，在配制培养基时要严格控制个成分的用量。在高温灭菌培养基时，要等灭菌锅的温度到达80℃或以上时再放入培养基，且灭菌时间不宜过长，以15 min左右为宜，以免破坏培养基中营养成分，使外植体在培养过程中出现玻璃化、白化死亡等现象。

在抗生素浓度的选择上，浓度过低会使外植体污染率增大，从而不能获得足够多的抗性分化芽；浓度过高时，虽然污染率降低了，但外植体白化死亡现象严重，同样不能满足试验要求。以特美汀为例，抗生素浓度以300 mg/L为宜，此时的抗性芽分化率达到了最高的37.8%，而污染率也相对较低。

在共培养时间的选择上，时间过长，农杆菌疯长，导致除菌不彻底；时间过短，转化不充分，抗性芽分化率低下。本试验中，共培养时间为3天。

卡那霉素抗性基因是目前植物转化中最常用的基因，但不同植物对卡那霉素的敏感性不同，因此，确定被转化植物的卡那霉素筛选浓度非常必要。在本实验中，当培养基中的卡那霉素浓度为100 μg/mL时，普通烟草品种K326的出愈率达到了4%，大部分外植体出现白

化死亡现象，所以卡那霉素的适宜浓度为100 μg/mL。

参考文献

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致谢

在本次毕业论文的制作过程中，感谢指导老师郑志富教授的悉心指点，让我在论文的理论构架与逻辑结构方面受益非浅。同时也感谢郑志富实验工作室其他老师和研究生提供的指导与帮助，让此次论文得以顺利完成。