体外培养细胞取材方法(通用型)
体外培养细胞的取材方法
样品收集和固定过程对于最后的数据质量具有决定性作用，所以以下细节请同学们仔细阅读，严格遵守。细胞取材基本注意点：
1.体外培养细胞一个样品量，需要一个6cm直径培养皿，或离心后固体体
积达到10ul以上。
2.细胞离开培养液环境之后尽快进入固定环节。
3.收集过程应避免过度消化和机械损伤。
4.细胞必须成团固定，如果固定时过于分散，将在制样过程中丢失。
细胞收集步骤：
1.倒出培养液，用磷酸盐缓冲液清洗培养皿后使用胰酶消化（注意消化
程度不可太过）。消化结束后倒出胰酶。
2.使用PB或者培养液轻轻收集细胞，如需吹打，只吹一遍。
3.将悬液转移到离心管中，离心机4℃低速离心（1000-1500转/分）5分
钟，使细胞聚成团块，弃去上清，沿壁小心加入新鲜的固定液。
4.保持细胞成团状态，于4℃冰箱中固定，如细胞团体积大于15 ul，固
定30 min后用注射器针头将细胞团挑离管壁，可将大团细胞划开成小
团，因为团块太大会影响内部固定效果，但是不可挑成弥散状。原则
是必须保证至少有数个不小于芝麻大小的固体团块，才可以后续操作。
5.冰箱内固定2-3小时或过夜。
6.固定结束后，将固定液用PB稀释2-3倍，样品于该溶液中在4℃冰
箱保存。
7.送样时间一般为每周一早上九点半，周一早上送样前请用PB于4度
冰箱浸泡清洗15 min，共3次。
8.将样品转移到2 ml离心管，用记号笔在离心管管壁上写好编号，用透
明胶带缠绕。后续管子会接触丙酮和乙醇，一定要用透明胶带缠绕，
以防记号被洗掉。
特别提醒：
1.请严格按照预约时间送样，如特殊情况样品有延迟或取消，需通知工作人员。
2.以上流程为通用流程，适合大多数细胞，但部分细胞具有特殊性，在收集和
固定环节有异于常规的操作方法，如实验室有自己稳定的收样流程，可按照自己的流程收样，但需事先跟工作人员进行交流。
3.
诱导分化成熟脂肪细胞方案
Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018) Dexamethasone (Sigma D-4902) Insulin (Bovine; Sigma I-5500) gibco血清：小牛血清(GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198) 胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566) 培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084） MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070) Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016) 一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿，3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。 二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。 三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。 一、诱导液配制 1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。分子量222，几乎不溶于水，现配现用，过滤除菌。100×母液（50mmol/L）：IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。每毫升培养基加10ul IBMX.
体外细胞培养
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
脂肪细胞的基础知识
脂肪细胞的基础知识 脂肪细胞的生长全过程及其形态变化脂肪母细胞，是指能向脂肪细胞分化的ADSCs在激素、生物活性因子、寒冷等因素刺激下均能逐渐分化成为单能干细胞。它可保持着干细胞增殖活跃的特性，脂肪母细胞再进一步分化为前脂肪细胞，即通常人们所说的脂肪细胞前体。前脂肪细胞再经历细胞融合、接触抑制和克隆扩增等步骤启动向成熟脂肪细胞分化，并在胰岛素、地塞米松等诱导剂作用下完成向成熟脂肪细胞的分化。全过程可以表示为：多能干细胞——脂肪母细胞——前脂肪细胞——不成熟脂肪细胞——成熟脂肪细胞。生长期前脂肪细胞的形态与成纤维细胞相似，经诱导分化，其细胞骨架和细胞外基质发生变化，开始进入不成熟细胞向成熟细胞转变。细胞形态由成纤维细胞样逐渐趋于类圆或圆形，胞体逐渐增大，胞质中开始出现小脂滴，脂质开始累积，以后小脂滴增多并融合为较大的脂滴，可经油红“O”染色等方法于显微镜下显色，从而获得成熟脂肪细胞的形态特征。此时的细胞无分裂增殖能力，为脂肪细胞分化的终末阶段。 张高娜,梁正翠.动物脂肪细胞的研究进展[J].饲料工业,2009,30(2):42-44. 脂肪细胞由起源于中胚层的间充质干细胞逐步分化形成,按间充质干细胞→脂肪母细胞→前脂肪细胞→不成熟脂肪细胞→成熟脂肪细胞的过程发展。前脂肪细胞在多种转录因子调控下,激活脂肪组织相关基因,并在这些基因的顺序性调控下,经一系列复杂的步骤分化为成熟脂肪细胞。 张艳.脂肪细胞分化过程中的分子事件[J].儿科药学杂志,2008,14(1):56-57.
间充质干细胞 概念： 不同文献中，分别命名为抽脂处理细胞（processed lipoaspirate cells, PLA），脂肪基质微管碎片细胞（stromal vascularfraction cells, SVF），脂肪组织源基质细胞（adipose-tissue derived stromal cells, ATSCs），脂肪源中胚层干细胞（adipose-derived mesodermal stem cells, ADMSCs）等。这些不一致的名称均指从脂肪组织中分离的、可在体外大量扩增并具有多向分化潜能的细胞。 李惠侠,屈长青. 脂肪组织源性干细胞研究进展[J]. 生理科学进展,2007,38(2) 脂肪细胞是由起源于中胚层的间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)逐步分化、发育而来，MSC主要分布于脂肪组织和骨髓中。脂肪细胞不同发育阶段的两类细胞系为多能干细胞系和前体脂肪细胞系，前者为不定向的细胞系，能转变为稳定的脂肪细胞、肌细胞和软骨细胞，后者为定向的细胞系，是目前体外研究脂肪细胞分化应用最为广泛的细胞系。 庞卫军,李影. 脂肪细胞分化过程中的分子事件[J]. 细胞生物学杂志,2005,27: 497-500. 脂肪来源的间充质干细胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells, ADMSCs) 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有自我更新及多向分化潜能,是一种 具有潜力的组织工程种子细胞。目前研究得比较多的是骨髓来源的MSCs,但骨髓中的间 充质干细胞数量很少(约占细胞总数的1/105),且存在取材困难等问题。MSCs广泛分布于 其他组织中,包括肌肉、血管、肝脏、胰腺和脂肪等。 ADMSCs表面有CD29、CD44、CD71、CD90、CD105/SH-2、SH-3、STRO-1等多 种抗原标志。 李冬艳,宇丽. 脂肪来源的间充质干细胞分离方法的改进[J]. 暨南大学学报(医学版),2007,28(6). 脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs） Zuk等从脂肪组织中分离出了一种成纤维细胞样细胞，它与骨髓间充质干细胞(MSCs)形态相似，称之为脂肪干细胞（ADSCs)，平均每300 ml脂肪组织可获得2×108～ 6×108个这样的细胞。ADSCs和MSCs具有相同的表现型，对CD29、CD44、CD71、 CD70、CD105/SH2和SH3为阳性反应，对CD31、CD34和CD45为阴性反应。此外， 它们还具有各自特征性的表达分化抗原：ADSCs具有特征性表达分化抗原CD49d，而MSCs具有特征性表达分化抗原CD106。 张高娜, 梁正翠. 动物脂肪细胞的研究进展[J]. 饲料工业,2009,30(2) 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具备干细胞特点的细胞系，具有自我更新能力、长期的活性和多系分化潜能。 脂肪来源的间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs），以其取材方便、来源丰富等多种优势逐渐取代骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）。 免疫表型：研究发现ADSCs主要表达CD13、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、CD29、CD49e和HLA-ABC，而不表达CD34、CD3、CD19、CD45、CD14、CD117、CD31、CD62L、CD95L和HLA-DR。这个结果和其他的MSCs几乎一致。但ADSCs与BMSCs也有差别：大部分BMSCs表达CD10，而表达CD10的ADSCs仅占5%～20%；几乎所有的ADSCs表达CD49f和CD54，而BMSCs极少表达。 周苏娜,张明鑫. 脂肪来源的间充质干细胞的生物学特征及临床应用[J]. 中国现代普通外科进展,2009,12(1). 不同细胞的表面标志是不同的，脂肪干细胞的表面标记为：CD9、CD10、CD13、CD29、CD10、CD44、CD49e、CD49d、CD54、CD55、CD59、CD90、CD105、CD107、CD146、
诱导分化成熟脂肪细胞方案
诱导分化成熟脂肪细胞 方案 集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018) Dexamethasone (Sigma D-4902) Insulin (Bovine; Sigma I-5500) gibco血清：小牛血清 (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198) 胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566) 培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084） MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070) Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016) 一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿， 3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。 二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。 三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。 一、诱导液配制 1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。分子量222，几乎不溶于水，现配现用，过滤除菌。100×母液（50mmol/L）： IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。每毫升培养基加10ul IBMX.
最新 人脂肪间充质干细胞体外分离培养方法-精品
人脂肪间充质干细胞体外分离培养方法 间充质干细胞属于成体干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪和脐带等组织，下面是小编搜集整理的一篇探究干细胞体外分离培养方法的，供大家阅读查看。 大面积皮肤缺损、重度烧伤的传统修复方法-自体或异体皮肤移植，因存在免疫排斥和供区不足等缺陷而限制了广泛临床应用。近年来，干细胞相关机制及应用的研究为皮肤创伤的治疗带来了新突破。研究显示，间充质干细胞能维持皮肤稳态和促进皮肤创面修复，其机制包括促进细胞分化、免疫调节和分泌生长因子来促进创面再上皮化和血管形成[1-2].人脂肪间充质干细胞(humanadipose-derivedmesenchymalstemcells,hAD-SCs)是由Zuk等[3]首次从抽脂术脂肪中分离出的一类具有多向分化能力的细胞群，因其具有来源丰富、容易获取和扩增快等优点，是组织工程的理想种子细胞。本实验旨在提供一种有效的hADSCs体外分离培养方法，为以后临床细胞移植提供实验基础。 1材料与方法 1.1材料成人腹部大网膜脂肪组织7例取自江苏大学附属医院产科剖宫产手术患者，年龄17~33岁，平均为26岁，健康状况良好，无系统性疾病。低/高糖DMEM、Ⅰ型胶原酶(Gibco公司),胎牛血清(Hyclone公司),鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其相应同型对照(eBio-sciences公司),地塞米松、抗坏血酸磷酸盐、β-甘油磷酸钠、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素(Sigma公司). 1.2方法 1.2.1hADSCs细胞分离培养产科无菌条件下取出腹部大网膜脂肪组织约 10ml,PBS清洗，剪碎，0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化45min,10%胎牛血清终止消化，离心，沉淀重悬，200目细胞筛过滤，再离心。加入完全培养液(含10%胎牛血清、1×双抗的低糖DMEM)重悬，以5×104/ml接种于6孔板，置于37℃,5%CO2培养箱中培养，48h后首次换液，之后每周换液2次，待细胞生长至80%融合时，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化传代。实验时用第3~9代细胞。 1.2.2细胞免疫表型检测取消化消化贴壁的第3代hADSCs,1000r/min离心5min,用PBS重悬分装于1.5ml的EP管中，每管100μl,细胞密度为105/ml,加入鼠抗人CD29、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166E、HLA-DR等单克隆抗体及其同型对照。4℃避光孵育30min,PBS洗2次，加PBS300μl重悬后流式细胞仪检测细胞表面抗原。 1.2.3细胞生长曲线和倍增时间取处于对数生长期的第3、6和9代细胞，消化贴壁细胞，将细胞按5×103/孔接种于24孔板，分7组，每组3孔，置培养箱培养。每24h用台盼蓝计数一次，每次计3孔，取其平均数;连续计数7d,
胚胎干细胞体外培养
胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
人脂肪干细胞(ADSCs)体外培养的研究及应用进展
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/a96787904.html, 人脂肪干细胞（ADSCs）体外培养的研究及应用进展 作者：徐巧瑜等 来源：《中国美容医学》2012年第13期 干细胞是一类具有自我更新与增殖能力的细胞，按其分化阶段不同分为胚胎干细胞与成体干细胞，目前对成体干细胞的研究较为广泛。人的脂肪干细胞（adipase derived stem cells，ADSCs）是来源于脂肪组织的干细胞，具有自我更新及多向分化的能力，在适宜诱导条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。自从2001年ZUK[1]首次通过吸脂术抽取脂肪组织悬液培养出多能干细胞，ADSCs因其取材方便，一次取材获取的细胞数量大，对供体创伤 小等优点已成为近年来种子细胞的研究热点。 1 ADSCs的获取 脂肪组织是人体中含量最丰富的组织，占正常体重的10%～29%[2]。它的存在主要有两种形式：棕色脂肪组织及白色脂肪组织。其中棕色脂肪组织仅在婴儿期发挥作用，而白色脂肪组织在人体起到储存及释放能量的调节器作用，主要分布在腹腔内的网膜、肠、肾周及臀部、大腿、腹部的皮下区域[3]。因此研究重点集中在白色脂肪组织。目前，ADSCs主要通过局部脂肪切除术及抽脂术后的脂肪组织中获取，但Vallee等[4]发现由抽脂术获得的脂肪有更好的成 脂潜力、重建三维脂肪替代物能力。供者的年龄也是影响ADSCs的因素。一般来说供者的年龄越小，细胞增生能力越好，反之亦然。然而，AustL等[5]却认为ADSCs的衰老与供体的体质指数呈负相关，而与年龄无关。取材部位不同，ADSCs数量凋亡倾向也不同。Schipper等[6]发现人前臂脂肪组织中含有更多的脂肪干细胞，而腹部的ADSCs不容易凋亡；腹部似乎比臀部或大腿更有利于获取ADSCs[7]。 2 ADSCs分离培养 2.1分离：目前常用的是酶消化法，将脂肪组织剪碎后采用胶原酶或胰酶消化、过滤离心后，使用含血清的培养基将沉淀重悬后接种于培养瓶中。沉淀物是多种细胞的混合物，又称为血管基质成分（Stromal vascular fraction，SVF），其中含有内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、前脂肪细胞、间充质干细胞及血液来源的细胞，常需传代来纯化。 2.2 培养：体外培养需要合适的生长条件，培养基的选择很重要。常用的培养基有DMEM、a-MEM、RPMI1640。Lee等[8]报道L-DMEM比a-MEM更适合培养ADSCs。Mischen等[9]研究表明低糖更有利于维持ADSC的多分化潜能，而培养液中的抗生素对ADSC 的细胞表型和分化能力无影响。Bunnell等[10]认为25%血清浓度可能使ADSC向脂肪细胞分化，而低氧低血清可增加ADSC凋亡。对于最优的糖浓度及血清浓度尚不明确。为了消除动物血清的使用带来的不良影响，部分文献开始介绍低人血清培养基或无血清培养基的使用。
细胞体外培养时为什么会贴到培养皿壁上
生物学通报２００７年第４２卷第９期细胞体外培养时为什么会贴到培养皿壁上 刘梅芳徐国恒‘（北京大学医学都生理系北京１０００８３） 北京市第２２中学的生物学教师陈珊问：动物细胞培养时为什么会出现贴壁现象？ 答：第１。绝大部分细胞在机体内的环境下是与其他细胞或者细胞外基质结合的，不是孤立存在的。第２，细胞与细胞或者细胞外基质结合的物质基础以及在体外培养中贴壁的物质基础是什么。 在体内，大部分细胞不是孤立存在的（血液中的细胞除外）。一般一种细胞具有一种特定的功能．不同种细胞有机组合在一起就构成能够完成较为完整的一项功能的器官。细胞之问，细胞与细胞外基质之间结合在一起，这使得每一部分组织或者器官具有一定的外形及特定的功能。血液在体内是起运输作用的，不停地流动，要通过只有几个“ｍ的毛细血管，所以血液中的细胞是单个存在的。否则就会发生血管阻塞。但是它们受到刺激．其表面与黏附有关的蛋白会被激活然后与其他细胞或细胞外基质结合．如血小板接触到破损内皮下的胶原被激活而黏附在局部，从而发挥止血的功能；如巨噬细胞可以将衰老的红细胞、血液中凋亡的中性粒细胞结合并将其吞噬，这些都应该是属于细胞之间的结合。另外有些研究表明细胞必须与其他的细胞发生联系才能够生存．如果没有其他细胞或者细胞外基质与之结合．此细胞就会发生凋亡，称为失巢凋亡。 细胞在体外培养的条件下的贴壁，首先并不是所有的细胞在体外培养的情况下都会贴壁，但大部分来自实体组织器官的细胞都会贴壁。贴壁的过程可能是这样的。细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面（培养瓶，培养皿的底面），然后细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。所以细胞贴壁与否与细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子的数量有关，也与培养皿壁的表面结构有关。 细胞贴壁的过程使形态发生很大变化．细胞变形运动是细胞内骨架本身和细胞外基质共同作用的结果。细胞为什么要贴壁，可以想象一下．密度大于培养基的细胞（绝大部分细胞）会沉在底面上，那么细胞要生存必定改善这个环境。分泌细胞外基质，然后很自然就贴附在底面上了，而悬浮细胞．如淋巴细胞由于重力原因沉在培养瓶的底面，但是并不贴附，这可能与细胞表面的黏附分子少，以及分泌的细胞外基质过少有关．有人研究用细胞外基质处理培养器皿的底面．即增加细胞外基质，可以使悬浮的淋巴细胞贴壁。另外悬浮生长的细胞系ＴＨＰ一１受到某些药物刺激之后也可以贴壁．这可能与细胞本身分泌的细胞外基质以及细胞表面的黏附分子表达增多有关。密度小于水的细胞，如脂肪细胞，漂浮在液面上。所以不可能贴在底面上．但是如果将培养液加满，那么细胞能够与培养瓶上面的壁接触同样可以贴壁。因此可以说，细胞贴壁是适应环境的一种反应。 （Ｅ—ＩＩｌａｉｌ：ｘｕｇ＠ｂｊｗＬＩ．ｅｄｕ．ｃｎ） （ＢＨ） 欢迎订阅２００８年《生物学教学》杂志 《生物学教学）杂志是由华东师范大学主办，向国内外正式发行的全国教育类核心期刊。国内统一刊号：ｃＮ３１一Ｉ００９，ｃ４．国际标准刊号：１００４—７５４９。读者对象以中学生物学教师为主，兼顾高校和其他生物学工作者。主要栏目有：生物科学综述、国家课程标准与实验教材、现代教育论坛、教育教学研究、课堂教学设计与实践、信息技术、国外教育动态、考试与命题、实验教学、科技活动、教学参考、生物学科技信息、科学技术与社会、读者之窗等。另外，封面、封底刊登生物照片。 《生物学教学》杂志为８０页，月刊，国际标准１６Ｋ，２００８年定价：７．００元，全年８４元。国内订购：全国各地邮局，代号４—４５０。国外订购：中国国际图书贸易公司（北京３９９信箱，邮编：１０００４４），代号：Ｍ５１０５。如果错过了邮局订购时间，可以与杂志社联系邮购。杂志社地址：华东师范大学《生物学教学》杂志社，邮编：２０００６２．电话０２ｌ一６２２３２２２５。电子信箱：ｓｗｘｉｗ＠ｂｉｏ．ｅｃｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
体外培养细胞的种类和命名
体外培养细胞的种类和命名 体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。 （一）初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。 （二）细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。 由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。 （三）克隆细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain） （四）二倍体细胞 细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有8～10代，人胚神经胶质细胞15～30代；如从老龄个体取可传50则细胞生存期更短。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2～5代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。 （五）遗传缺陷细胞 从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。 （六）肿瘤细胞系或株 这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体
T细胞体外培养
目前应用于临床的治疗的T细胞有如下几种： 1、CD3AK细胞 CD3AK细胞全称为抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞，当淋巴细胞与抗CD3单克隆抗体共育2-3天，淋巴细胞可以明显增殖，此种激活为一次性完成，淋巴细胞一经激活即无需抗CD3单克隆抗体持续存在而发挥作用。只会在加入低剂量的IL-2继续培养即可维持起活跃增殖，经2-3周培养后可获得大量的表现为CD3+、CD4以及CD8+的混合体，且随时间延长，CD3+和CD8+双阳性细胞的比例增加，而CD4+和CD8+双阳性的比例则下降。因此，CD3AK细胞在表型上似乎接近于CTL。 具体培养方法: 1、培养前1天以含CD3Ab 5 mg／L的磷酸盐缓冲液 (PBS)20 ml平铺培养瓶，4℃过夜包被； 2、培养第1天弃去PBS，以PBS冲洗2 次及1640培养液 冲洗1次，加入1 000 U／ml的 IFN-γ，置于37℃体积分数为5％C02的饱和湿度培养箱中； 3、24小时后加入1 000 U／ml的lL-2。 4、继续培养 2、CIK细胞 CIK细胞的全称为细胞因子活化的杀伤细胞，它是在多种细胞因子（IFN-γ，CD3单抗，CD28单抗，IL-2和IL-1）作用下，外周血单核细胞可以被定向诱导并大量增殖成为具有抗肿瘤活性的细胞群。CIK细胞的表型主要为CD3+CD56+,是来源于PBMC中的T细胞（CD3+CD56-）。
具体培养方法： 3、LAK细胞 LAK细胞全称为淋巴因子激活的杀伤细胞，可在外周血单核细（PBMC）中加入IL-2体外培养4-6天，能诱导出一种非特异的杀伤细胞，称为LAK细胞。LAK细胞的前体细胞是NK细胞和T细胞。 4、TIL细胞 TIL细胞的全称为肿瘤浸润淋巴细胞。它的制备方法与LAK细胞相似，所不同的是TIL的细胞来源是肿瘤组织中分离的浸润淋巴细胞，用少量的IL-2细胞刺激后，能大量扩增表型为CD4+及CD8+为主的T细胞。 外周血单核细胞（PBMC）分离实验 血标本：EDTA（2%）盐抗凝血：采集后可4度保存不超过半天，尽量早处理。10ml抗凝血分2份（分离淋巴细胞可稍多）。 外周血单核细胞（PBMC）分离步骤： 1.吸出10ml新鲜抗凝血（含2%EDTA）至50ml离心管中，加入 10mlPBS混匀，此时共20ml； 2.2个50ml离心管内分别加入10ml外周血单核细胞（PBMC）分离 分层液； 3.向装有分层液的50ml的离心管分别加入10ml稀释样品，注意缓 慢加入，不要冲破液面，2000r/min离心20分钟； 4.巴氏管插入液面，轻吸灰白色的淋巴细胞层，放入另一个离心管 中，避免吸入分层液和血浆（2管混入一个离心管）； 5.加入5ml PBS，1800r/min离心5分钟； 6.弃上清，取沉淀，再次加入5mlPBS混匀成细胞悬液，
成年小鼠心脏脂肪细胞分离培养的protocol
PROTOCOL 1.Anesthetize mouse with 150uL heparin (100U/ml) + 0.5mL ketamine/xylazine stock 2.Sacrifice by opening thorax after toe pinch test. 3.Remove and cannulate heart, secure with vascular clip then 6-0 silk. Check cannulation by inflation. Heart should swell. 4.Perfuse heart with 1xPB for 4 min at 4ml/min (16mL) 5.Switch to DB for 3 min at 4ml/min (12mL) 6.Perfuse with DB+CaCl2 for 8 min at 4ml/min (32mL) 7.Heart will be mushy when fully digested and dripping ~16 drops/min 8.Remove from cannula, remove atria and great vessels 9.Place ventricles in sterile 60mm dish with 2.5ml DB 10.Tease ventricles into several pieces. Add 5mL Stopping Buffer (37°C) and pipette several times to release cardiomyocytes from tissue. Solution should turn cloudy. 11.Transfer cell solution to conical tube with 100μm mesh to filter cells from tissue. 12.Rinse dish with 2.5mL Stopping Buffer and add to tube through mesh. Final volume is 10mL. 13.Let CMs settle 10-20 min at 37°C and plate supernatant in 60mm dish. Let cells settle 2-3 hours in TC incubator. Wash and harvest CFs (plated cells) or change media and passage. 14.Harvesting CFs: a.Wash 2x5ml 1xPBS, add 1ml of 1xPBS. b.Scrape cells into Eppie, cfg twice 3min at 5000rpm at 4°C. c.Lyse in 350ul RLT+. SOLUTIONS FOR LANGENDORFF 10x perfusion buffer (stored at 4°C up to 1 month) 1L 500mL NaCl 70.3g 35.15g KCl 11g 5.5g KH2PO4.82g .41g Na2HPO4.85g .425g MgSO4●7H2O 3g 1.5g HEPES**(1M) 100mL 50mL pH to 7.4 with 1N NaOH ~3mL mQ H2O to 1L to 500mL **if HEPES is in powder form, add 13.01mg HEPES to 50mL mQ H2O. 1x perfusion buffer (PB) (make fresh) 250mL 500mL 10x perfusion buffer 25mL 50mL NaHCO3.0975g .195g Taurine .9375g 1.875g BDM (butadionemonoxime) .25g .5g Glucose .25g .5g pH to 7.4 with NaOH mQ H2O to 250mL to 500mL Filter through 0.2μm Stopping buffer (7.5mL/heart, make fresh, heat to 37°C before use) 1xPB 9mL FBS 1mL 100mM CaCl2 1.25μL Digestion buffer (DB) 1xPB 50mL 320U/mg collagenase II*50mg 100mM CaCl2**15μL *add immediately before use **BEFORE adding, remove 12.5mL to fresh tube (for Step 5), THEN add 15μL CaCl2 to remaining DB. Mix, then put 2.5mL on 60mm plate (for Step 8). Culture (Fibroblast) medium MEM 48.5mL Pen/Strep 0.5mL (1% final) L-glutamine 0.5mL (1% final) FBS 50mL (10% final)
脂肪细胞培养试剂
脂肪细胞培养所需试剂 1、低糖-DMEM、高糖DMEM/F12 (1∶1)各2袋 2、胎牛血清10%1瓶 3、胰蛋白酶0.25% 4、0.1%胶原酶Ⅰ 5、1μmol.L-1地塞米松、50μmol.L-1吲哚美辛（200）、0.5 mmol 3-异丁基-1-甲基黄 嘌呤（IBMX）和胰岛素(Sigma, USA)链霉素、青霉素、10μmol.L-1胰岛素 6、25ml培养瓶20个 7、6孔培养板8个、24孔板4个 8、PBS、酒精、无菌棉球、油性记号笔、封口膜 10、油红O 11、4%多聚甲醛、苏木精 眼科剪、眼科镊各2把、200目筛网2个、150目筛网2个、CO2培养箱、25ml 离心管15支、吸管40支（长嘴）、5ml塑料带盖离心管10支、37℃水温摇床、培养皿5个、50ml烧杯4个 所需配制的试剂 1、PBS液： 2、DMEM普通培养基： 3、成脂诱导培养基 4、0.075%胶原酶 5、0.5%胰蛋白酶 方法 1、MA 提纯及去分化 手术切除的腹部脂肪5ml, 冷冻，在2h内将脂肪组织送至实验室。PBS反复冲洗，在通用培养液剔除血管，剪碎。PBS 反复冲洗，置于 0.075% Ⅰ型胶原酶 37℃恒温摇床消化 45 min，期间反复震荡混匀，等量体积的完全培养基（高糖 DMEM、10%FBS、1% 青、链霉素）中和后，200 μm 尼龙网过滤，滤过物以离心半径 4 cm、180r/min离心10min，收集第2层脂肪细胞用200μm和150μm尼龙网过滤，去除其他细胞污染。 采用 Tholpady 等 [11] 方法收集人成熟脂肪细胞（mature adipocytes，MA）接种于 25 cm2培养瓶，每瓶（0.5 ～ 1.0）×105个细胞，瓶内充满完全培养基，将培养瓶翻转倒置于 37℃、5%CO2 培养箱内，使漂浮的脂肪细胞接触培养瓶底；48 h 后翻正培养瓶，吸出漂浮的 MA 悬液，接种于新的 25 cm2 培养瓶，进行新一轮天花板贴壁培养；48 h 后重复上一过程，以清除成纤维细胞状贴壁细胞；重复该过程至倒置相差显微镜下观察无成纤维细胞状细胞污染为止。吸出 MA悬液，接种于一倒置、密封、充满完全培养基的 25 cm2培养瓶内，放入孵箱培养 10 d 使 MA 贴壁牢固。10 d后翻正培养瓶，每 2 天更换完全培养基，
T细胞体外培养
T细胞体外培养 Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】
目前应用于临床的治疗的T细胞有如下几种： 1、CD3AK细胞 CD3AK细胞全称为抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞，当淋巴细胞与抗CD3单克隆抗体共育2-3天，淋巴细胞可以明显增殖，此种激活为一次性完成，淋巴细胞一经激活即无需抗CD3单克隆抗体持续存在而发挥作用。只会在加入低剂量的IL-2继续培养即可维持起活跃增殖，经2-3周培养后可获得大量的表现为CD3+、CD4以及CD8+的混合体，且随时间延长，CD3+和CD8+双阳性细胞的比例增加，而CD4+和CD8+双阳性的比例则下降。因此，CD3AK细胞在表型上似乎接近于CTL。 具体培养方法: 1、培养前1天以含CD3Ab5mg／L的磷酸盐缓冲液(PBS)20ml平铺培养瓶， 4℃过夜包被； 2、培养第1天弃去PBS，以PBS冲洗2次及1640培养液冲洗1次，加入 1000U／ml的IFN-γ，置于37℃体积分数为5％C02的饱和湿度培养箱中； 3、24小时后加入1000U／ml的lL-2。 4、继续培养 2、CIK细胞 CIK细胞的全称为细胞因子活化的杀伤细胞，它是在多种细胞因子（IFN-γ，CD3单抗，CD28单抗，IL-2和IL-1）作用下，外周血单核细胞可以被定向诱导并大量增殖成为具有抗肿瘤活性的细胞群。CIK细胞的表型主要为CD3+CD56+,是来源于PBMC中的T细胞（CD3+CD56-）。 具体培养方法： 3、LAK细胞
LAK细胞全称为淋巴因子激活的杀伤细胞，可在外周血单核细（PBMC）中加入IL-2体外培养4-6天，能诱导出一种非特异的杀伤细胞，称为LAK细胞。LAK细胞的前体细胞是NK细胞和T细胞。 4、TIL细胞 TIL细胞的全称为肿瘤浸润淋巴细胞。它的制备方法与LAK细胞相似，所不同的是TIL的细胞来源是肿瘤组织中分离的浸润淋巴细胞，用少量的IL-2细胞刺激后，能大量扩增表型为CD4+及CD8+为主的T细胞。 外周血单核细胞（PBMC）分离实验 血标本：EDTA（2%）盐抗凝血：采集后可4度保存不超过半天，尽量早处理。10ml抗凝血分2份（分离淋巴细胞可稍多）。 外周血单核细胞（PBMC）分离步骤： 1.吸出10ml新鲜抗凝血（含2%EDTA）至50ml离心管中，加入10mlPBS混 匀，此时共20ml； 2.2个50ml离心管内分别加入10ml外周血单核细胞（PBMC）分离分层液； 3.向装有分层液的50ml的离心管分别加入10ml稀释样品，注意缓慢加入， 不要冲破液面，2000r/min离心20分钟； 4.巴氏管插入液面，轻吸灰白色的淋巴细胞层，放入另一个离心管中，避免 吸入分层液和血浆（2管混入一个离心管）； 5.加入5mlPBS，1800r/min离心5分钟； 6.弃上清，取沉淀，再次加入5mlPBS混匀成细胞悬液，1000r/min离心5 分钟，弃去上清，保留沉淀; 7.2ml1640培养基重悬后移至培养瓶中培养 需要购买的试剂：外周血淋巴细胞分离液、anti-CD3抗体、IL-2、IL-1、IFN-γ。
细胞培养复习题(含答案)
1.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型 ⑴按生长方式分为二型： 粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。） ⑵可分四型：(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞 2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程 ⑴通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段： ①原代培养期：也称初代培养，是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。 ②．传代期：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。 ③衰退期：处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。 以上特点，主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。 ⑵每代贴附生长细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。时间：10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等③潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。⑤停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度限制 3.简述体外培养细胞对生存环境的基本要求.