单克隆抗体制备的基本原理
单克隆抗体制备的基本原理
一、单克隆抗体的概念抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了
众多学科的发展。德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设
计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。
（二）杂交瘤技术的基本原理细胞融合是一个随机的物理过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬中，经融合后细胞将以多种形式出现，如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。细胞的DNA合成有源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路
途径)两种方式。源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂, 能有效地阻断DNA合成的源性途径。B淋巴细胞具有HGPRTTK 这两种酶, 因此在源性途径被阻断后仍能利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA，可在HAT培养基中存活, 但B淋巴细胞是正常细胞, 故不能长期存活。杂交瘤技术中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞为HGPRT-的TK-缺陷型, 缺乏HGPRT酶和TK酶在源性途径被阻断后不能进行DNA的外源性合成，故不能在HAT培养基中存活。杂交瘤细胞由于继承了B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT养基中能长期存活。因此将融合后的混合细胞在HAT 培养基中培养两周后，只有杂交瘤细胞能存活下来，成为制造单克隆抗体的细胞源。
三、单克隆抗体制备的方法与步骤（一）单抗制备的基本流程单克隆抗体制备的主要步骤有：①正常小鼠免疫处理；②用物理、化学和生物方法促使细胞融合；③杂交瘤细胞的筛选与培养；④单克隆抗体的提纯。（二）单克隆抗体制备的基本方法抗原提纯与动物免疫对抗原的要纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原，可取1×107
个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2～3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3～4天，分离脾细胞融合。骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％）。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞（feedercell）。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细
胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至1×105/ml，提前一天或当天置板孔中培养。细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后吧培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等，常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min 滴加4.5ml培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml。
③培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。
有限稀释法筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后（一般稀释至0.8个细胞/ 孔），按Poisson法计算，应有36％的孔为1个细胞/孔。细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。单克隆抗体的制备和冻存筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方
法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c 小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当，一般为5×105/鼠，可根据腹水生长情况适当增减。选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好，冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在－70℃冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种，冻存过程中需格外小心。二甲亚砜（DMSO）是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复后的活性多在50％～95％之间。如果低于50％，则说明冻存复过程有问题。单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化，腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法，多用葡萄球菌A 蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体（最常用Sepharose）交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达90％以上。蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合，同时还结合少量的IgM。洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测，小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm 时，1.44
（吸光单位）相当于1mg/ml。经低pH洗脱后在收集管预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。
单克隆抗体制备的基本原理
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了
制备单克隆抗体的原理
制备单克隆抗体的原理 单克隆抗体是一种高度特异性的抗体，它可以识别并结合到特定的抗原上。制备单克隆抗体的原理是通过克隆单个B细胞，使其产生同一种特异性的抗体。这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。 制备单克隆抗体的过程可以分为四个步骤：免疫、细胞融合、筛选和扩增。 第一步是免疫。在这一步中，动物（通常是小鼠）被注射一种特定的抗原，以刺激其免疫系统产生抗体。这些抗体会被B细胞产生并分泌到血液中。 第二步是细胞融合。在这一步中，从免疫小鼠的脾脏中收集B细胞，并与一种特殊的癌细胞（称为骨髓瘤细胞）融合。这种融合产生的细胞称为杂交瘤细胞，它们具有两种细胞的特性：B细胞的抗体产生能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。 第三步是筛选。在这一步中，杂交瘤细胞被分配到96孔板中，每个孔中只有一个细胞。然后，每个孔中的细胞被检测其是否产生特定的抗体。这种检测通常使用酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫荧光染色法。只有产生特定抗体的细胞才会被保留下来。 第四步是扩增。在这一步中，产生特定抗体的杂交瘤细胞被扩增，
以获得足够的单克隆抗体。这些抗体可以通过培养杂交瘤细胞或通过收集细胞培养液来获得。 制备单克隆抗体的原理是利用B细胞的特异性和骨髓瘤细胞的无限增殖能力，通过细胞融合和筛选，获得同一种特异性的抗体。这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。 单克隆抗体的应用非常广泛。它们可以用于诊断、治疗和研究。例如，单克隆抗体可以用于检测病原体、肿瘤标志物和药物残留物。它们还可以用于治疗癌症、自身免疫性疾病和传染病。此外，单克隆抗体还可以用于研究蛋白质结构和功能，以及开发新的生物技术产品。 制备单克隆抗体的原理是通过克隆单个B细胞，使其产生同一种特异性的抗体。这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。
简述单克隆抗体技术的基本原理
简述单克隆抗体技术的基本原理 单克隆抗体技术是生物技术领域的一项重要技术，在医药研发、诊断和治疗等方面都 有着广泛的应用和前景。单克隆抗体技术的基本原理是通过选择一种特定的免疫细胞，获 取它产生的特异性抗体并使其进行不限制性复制，最终获得具有高度特异性和稳定性的单 克隆抗体。下面将详细介绍单克隆抗体技术的基本原理，包括鼠源性、嵌合型和人源性单 克隆抗体技术，以及单克隆抗体生产的流程和应用。 一、鼠源性单克隆抗体 鼠源性单克隆抗体是最早使用的单克隆抗体，其制备原理是将鼠类动物免疫一种抗原，收集其脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞，然后将杂交瘤细胞单克隆化， 即从杂交瘤中分离出单个克隆细胞并培养扩大。鼠源性单克隆抗体的优点是制备简单、产 量高，但由于小鼠免疫系统与人类的巨大差异，鼠源性抗体往往容易引起免疫原性反应， 从而限制了其在临床应用中的使用。 二、嵌合型单克隆抗体 为了克服鼠源性单克隆抗体的局限性，研究人员提出了嵌合型单克隆抗体技术。嵌合 型单克隆抗体是由人源性的Fc区和鼠源性的可变区域组成，它可以确保高度特异性和稳定性的又可以降低免疫原性反应。嵌合型单克隆抗体的制备方法是将人源性的IgG1的Fc片 段与包含鼠源性单克隆抗体的可变区域进行基因重组，最终获得嵌合型单克隆抗体。嵌合 型单克隆抗体优点是高度特异性和稳定性、免疫原性反应小。嵌合型单克隆抗体的制备过 程较为复杂，且其效价可能比鼠源性单克隆抗体略低。 随着生物技术的不断发展，研究人员逐渐开始研制具有人源性的单克隆抗体，其能够 更加充分地体现在人体内生物学免疫动态，从而降低了潜在的体内免疫原性反应。人源性 单克隆抗体制备方法有两种，一种是在小鼠背景中将人源性单克隆抗体进行筛选和生产， 另一种是通过人免疫系统获得人源性单克隆抗体。人免疫系统产生抗体的原理与小鼠类似，但需要额外进行一系列的筛选和优化步骤，以保证细胞系的干净和稳定性。由于人源性单 克隆抗体与人体内的免疫系统具有良好的兼容性和相似性，因此在临床应用中具有极高的 价值。 四、单克隆抗体生产流程 单克隆抗体的生产流程步骤主要包括抗原的制备和纯化、免疫动物的制备、细胞融合、杂交瘤的克隆、分析和纯化等过程。 1. 抗原的制备和纯化：抗原是获得单克隆抗体的前提条件，其制备必须满足一定的 纯度和特异性。一般抗原的制备通过细胞培养、人工合成化合物或从动物收集，然后通过 一定的生化分离操作获得纯化的抗原。
简述单克隆抗体的原理
简述单克隆抗体的原理 单克隆抗体是指由一种单一的抗体细胞克隆体所产生的抗体，具有高 度的特异性和稳定性。与多克隆抗体不同，单克隆抗体只能与一种特定的 抗原结合。 单克隆抗体的制备原理主要包括以下几个步骤：抗原制备、小鼠免疫、混合细胞瘤的构建、单克隆细胞的筛选和扩增、抗体的纯化和验证。 首先，制备抗原。抗原可以是蛋白质、多肽、糖蛋白、糖类等物质。 通常，抗原的制备需要纯化目标物质，并在其上面引入适当的荧光标记物 或辅助蛋白。 然后，将抗原注射到小鼠体内，通过免疫刺激来引起小鼠产生抗体。 小鼠一般被注射多次，每次注射相隔数周。为了增强免疫反应，抗原通常 与佐剂混合。 接下来，从免疫小鼠的脾脏中取出淋巴细胞和骨髓细胞。淋巴细胞和 骨髓细胞都是产生抗体的细胞，其中淋巴细胞主要分泌IgM抗体，而骨髓 细胞则可以产生IgG抗体。 将免疫小鼠的淋巴细胞和骨髓细胞进行融合。融合是通过将淋巴细胞 和骨髓细胞暴露于聚乙二醇（PEG）等化合物，使其融合为混合细胞瘤来 进行的。混合细胞瘤是淋巴细胞和骨髓细胞的杂交体，可以继承两者之间 的染色体。 混合细胞瘤的培养基中加入肿瘤抑制剂，以限制非融合细胞的生长。 肿瘤抑制剂可以选择使用有潜在致死作用的物质，使杂交细胞获得竞争性 优势。
接下来，通过挤压法将淋巴瘤细胞和骨髓瘤细胞与肿瘤抑制剂混合，培养于含有富集引发细胞融合和杀死其他细胞的细胞无血清培养基的培养瓶中，使细胞在无血清培养基下繁殖。 在培养的细胞中，有较高亲和性的单克隆细胞将分离并生长为独立的克隆细胞。在单克隆细胞的培养中，通常会添加一种名为含有甘露醇等低渗溶质的有速度限制性亚胺的培养基，以减慢生长速度，使得单克隆细胞的各种异质性微异质扩散具有显著效果。 接下来，将这些单克隆细胞分离并扩增到大规模培养。扩增的单克隆细胞可以进一步筛选，以选择亲和力最高的单个细胞株。 最后，从细胞培养基中收集含有抗体的上清液，并对抗体进行纯化和验证。纯化可以使用多种技术，如亲和层析和离子交换层析。验证通常使用酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫印迹等技术来确定抗体的特异性和活性。 综上所述，单克隆抗体的制备原理是通过免疫小鼠、细胞融合、筛选和扩增、纯化和验证等步骤，制备出具有特异性和稳定性的抗体。单克隆抗体在医学和生物学领域有着广泛的应用，可用于疾病诊断、治疗和科学研究。
单克隆抗体制备的原理
单克隆抗体制备的原理 引言： 单克隆抗体是一种与特定抗原高度亲和的抗体，它由单一的B细胞或其衍生的细胞克隆产生。单克隆抗体制备是一项重要的生物技术手段，广泛应用于医学诊断、药物研发和治疗等领域。本文将介绍单克隆抗体制备的原理及其在科学研究和医学应用中的重要性。 一、单克隆抗体的起源和背景 抗体是机体免疫系统中产生的一种特殊蛋白质，可以识别和结合抗原，从而参与免疫应答。传统的抗体制备方法主要依赖于动物免疫，但存在许多局限性，如免疫反应的不可控性、抗体来源有限等。为了解决这些问题，科学家发展出了单克隆抗体制备技术。 二、单克隆抗体制备的原理 单克隆抗体制备的原理基于混合细胞瘤技术和免疫细胞培养技术。具体步骤如下： 1. 抗原免疫：将目标抗原注射到小鼠等哺乳动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。 2. 细胞融合：从免疫小鼠体内提取B细胞和骨髓细胞，将它们与骨髓瘤细胞（如骨髓瘤细胞株SP2/0）融合，形成杂交瘤细胞。 3. 杂交瘤筛选：将杂交瘤细胞悬浮于含有选择性培养基的培养皿中，
使非杂交细胞死亡，只留下杂交瘤细胞。 4. 单克隆细胞扩增：将杂交瘤细胞分装到96孔板中，每孔只包含一个细胞，培养并扩增单克隆细胞。 5. 单克隆抗体收集：从培养上清中收集单克隆抗体，经过纯化和鉴定，获得纯度较高的单克隆抗体。 三、单克隆抗体制备的重要性 1. 高亲和力和特异性：与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更高的亲和力和特异性，可以更准确地结合目标抗原。 2. 可重复性和稳定性：单克隆抗体制备的过程可以被重复进行，从而获得相同的抗体产品。此外，单克隆抗体也具有较长的稳定性，可以在不同实验条件下保持一致的性能。 3. 应用广泛：单克隆抗体广泛应用于医学诊断、药物研发和治疗等领域。例如，单克隆抗体可以用于肿瘤标记、疾病诊断、药物靶点鉴定等。 4. 抗体工程的基础：单克隆抗体的制备为后续的抗体工程提供了基础。通过改变单克隆抗体的结构和功能，可以获得更加理想的抗体产物。 结论： 单克隆抗体制备的原理基于混合细胞瘤技术和免疫细胞培养技术，
单克隆抗体制备原理
单克隆抗体制备原理 抗体，又称抗血清球蛋白，是一种可以与外界的抗原物质结合的多肽链新颖的天然蛋白质，可以抗原（外源物质）的识别和结合。抗体是由一个或多个嗜碱性球细胞从各种动物体内分泌和降解出来的 蛋白质，有自身抗原特异性，能与外源抗原结合，具有特异性和可变性的抗原特性，一般由二肽链组成。 在免疫原理的基础上，人们研制出了一种利用免疫原理和现代生物技术来制备抗体的技术方法，叫做单克隆抗体技术。它以载体细胞为基础，利用免疫原理，制备出单克隆抗体，进而实现它们的分离与纯化，用于抗原的检测和药物的研究。 一般来讲，单克隆抗体制备技术包括以下几个步骤：免疫原理、载体细胞、免疫原制备、免疫动物获得免疫细胞、筛选、克隆和纯化。 首先，是免疫原理的利用。按照特定的原理，将免疫原添加到载体细胞上，触发载体细胞形成抗原特异性的抗体，负责抗原特异性的效应。同时，载体细胞也携带了抗体的抗原特异性的基因。 其次，是载体细胞的选择。一般来说，常用的载体细胞有灵长类动物细胞，如核膜细胞、白血病细胞、小鼠淋巴细胞等，一般利用大肠杆菌、嗜热性芽孢杆菌、放线菌。选择合适的载体细胞，不但可以以此保证抗体产量，而且可降低免疫毒性，减少抗体失活率，从而确保抗体质量。 第三步，是免疫原的制备。该步骤中要求抗原物质的制备、浓度的控制和质量的检查，以确保免疫原的有效性和品质。
第四步，是通过给定的抗原刺激动物后，获得免疫细胞。获得的免疫细胞主要包括淋巴细胞和巨噬细胞，其中巨噬细胞能够分泌抗体，而淋巴细胞则能够分泌促抗体物质。 然后，就是筛选阶段。克隆抗体技术的筛选主要通过竞争免疫的方式实现，利用竞争免疫的原理，可以获得能够特异性结合抗原的抗体。 最后，就是克隆和纯化，即通过基因重组的技术将抗体的特异性的基因克隆到大肠杆菌、嗜热性芽孢杆菌或放线菌中，进行繁殖，从而获得一定量的单克隆抗体，随后经过纯化，即得到纯净的结果。 总之，单克隆抗体制备技术是运用免疫原理和现代生物技术来制备抗体的技术方法，包括免疫原理、载体细胞、免疫原制备、免疫动物获得免疫细胞、筛选、克隆和纯化八个步骤。它拥有许多优点，如易操作、成本低、灵敏度高等，可以检测和调控免疫功能，广泛应用于生物学、制药、医学等领域。
单克隆抗体制备的基本原理
单克隆抗体制备的基本原理 一、引言 单克隆抗体（Monoclonal Antibodies，mAb）是指来源于同一个B细胞克隆的抗体，具有高度特异性和单一免疫反应性。单克隆抗体的制备是基于科学家科尔和米尔斯于1975年提出的杂交瘤技术。该技术的发明是继酶联免疫吸附试验（ELISA）之后，对于生物医药研究领域的重大突破。本文将重点介绍以单克隆抗体制备的基本原理。 二、单克隆抗体制备的基本原理 单克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：免疫原制备、小鼠免疫、融合细胞的制备、杂交瘤细胞的筛选和克隆、抗体纯化及鉴定。下面将详细介绍每个步骤。 1. 免疫原制备 免疫原是指诱导机体产生免疫应答的物质。在单克隆抗体制备中，免疫原通常是具有特定抗原性的蛋白质。可以通过基因工程技术或从天然来源提取免疫原。为了提高免疫原的免疫原性，通常会将其与适当的载体结合。 2. 小鼠免疫 将免疫原注射到小鼠体内，刺激小鼠产生特异性抗体。通常需要多次免疫，以增强免疫反应。免疫后，可以通过采集小鼠血清进行抗
体的初步筛选。 3. 融合细胞的制备 将小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合。小鼠的脾细胞负责产生特异性抗体，而骨髓瘤细胞则具有无限增殖的能力。融合细胞的制备通常使用聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）等化合物来促进细胞融合。 4. 杂交瘤细胞的筛选和克隆 将融合细胞悬浮液培养在含有选择性培养基的培养皿中，筛选出杂交瘤细胞。杂交瘤细胞是具有脾细胞和骨髓瘤细胞的特性，能够稳定地产生特异性抗体。为了获得单克隆抗体，需要进行单克隆化培养，即每个杂交瘤细胞分离为一个克隆。 5. 抗体纯化及鉴定 通过培养杂交瘤克隆细胞，可以得到大量的抗体。接下来需要对抗体进行纯化和鉴定。通常使用亲和层析、离子交换层析等技术对抗体进行纯化。鉴定抗体的方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹（Western Blot）等。 三、应用前景 单克隆抗体的制备在生物医药领域有着广泛的应用前景。单克隆抗体可以用于诊断、治疗和研究，具有高度特异性和亲和力，有助于提高疾病的早期诊断和治疗效果。目前已经有多种单克隆抗体药物
单克隆抗体的制备原理
单克隆抗体的制备原理 单克隆抗体是一种高度特异性的抗体，它可以识别并结合到特定的抗原上。在生物医学研究和临床诊断中，单克隆抗体具有非常重要的应用价值。那么，单克隆抗体是如何制备的呢？下面我们将介绍单克隆抗体的制备原理。 首先，单克隆抗体的制备需要一种特殊的细胞——B细胞。B细胞是一种免疫细胞，它可以产生抗体来识别和结合抗原。在制备单克隆抗体的过程中，我们需要从免疫动物（通常是小鼠或兔子）的脾脏中获取B细胞。 接着，我们需要一种特殊的细胞——骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞是一种恶性浆细胞瘤，它具有不断增殖的能力。我们将B细胞与骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞具有B细胞产生抗体的特性，同时也具有骨髓瘤细胞的不断增殖能力。 随后，我们需要对杂交瘤细胞进行筛选和鉴定，筛选出产生特定抗原结合能力的单克隆细胞。这一步需要利用特定的实验方法和技术，如细胞培养、酶联免疫吸附实验（ELISA）等，来鉴定单克隆细胞的抗原结合能力。
最后，我们需要大规模培养和提取单克隆细胞，获得足够的单 克隆抗体。这些单克隆抗体可以用于生物医学研究、临床诊断、药 物研发等领域。在这个过程中，我们还需要对单克隆抗体进行纯化 和鉴定，确保其纯度和特异性。 总的来说，制备单克隆抗体的过程是一个复杂而精细的过程， 需要多种细胞、实验方法和技术的配合。通过这些步骤，我们可以 获得高质量、高特异性的单克隆抗体，为生物医学研究和临床诊断 提供有力的支持。 在单克隆抗体的制备过程中，我们需要严格控制各个环节，确 保单克隆抗体的质量和特异性。同时，随着生物技术的不断发展， 制备单克隆抗体的方法也在不断更新和改进，为单克隆抗体的应用 提供更多可能性。 综上所述，单克隆抗体的制备原理涉及到多个环节，需要细致 的操作和专业的知识。通过这些步骤，我们可以获得高质量、高特 异性的单克隆抗体，为生物医学研究和临床诊断带来更多的可能性。希望本文对单克隆抗体的制备原理有所帮助，谢谢阅读！
单克隆抗体制备的基本原理
单克隆抗体制备的基本原理 单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体( antibody )是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B 细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体( polyclonal antibody )，简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein 建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预 定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B 细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体( monoclonal antibody ，McAb，简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。 单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次** ，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒( Georges Ko1er )和英国科学家米尔斯坦( Cesar
单克隆抗体制备的基本原理
单克隆抗体制备的基本原理 单克隆抗体（monoclonal antibody）是指由同一抗体原型细胞（B 细胞）分娩的具有相同抗原结合能力和单一特异性的抗体分子。单克隆抗 体制备的基本原理是通过融合抗体原型细胞和肿瘤细胞，形成无限增殖的 杂交瘤细胞，利用这些细胞生产大量的单克隆抗体。 首先，制备免疫原。免疫原可以是纯化的蛋白质，也可以是从细胞、 病毒、细菌等生物体中提取的抗原。免疫原的选择要根据具体需要，确保 能够引发免疫应答。 接着，通过免疫程序激发抗体原型细胞。将免疫原注射给小鼠等实验 动物，促使其免疫应答产生特异性抗体。这个过程一般包括预免疫、主免 疫和增强免疫等步骤，以提高免疫应答的效果。 然后，收集免疫骨髓细胞或淋巴细胞，与肿瘤细胞进行细胞融合。肿 瘤细胞一般选择无限增殖能力的骨髓瘤或葡萄状囊肿瘤细胞，这些细胞能 够提供长期稳定的单克隆抗体分泌。融合过程中利用聚乙二醇等化学物质 提高融合效率。 杂交瘤筛选是在含有融合细胞的培养基中筛选出能够分泌目标抗体的 杂交瘤细胞株。筛选的方法包括细胞排序、ELISA、免疫组化和免疫磁珠等。通过这些方法，可以快速筛选出能够特异性地分泌目标抗体的细胞株。 最后，对单克隆细胞进行培养和扩增，得到大量的单克隆抗体。单克 隆细胞培养一般在无血清培养基中进行，可以使用悬浮培养方法或者固定 化培养方法。培养的细胞经过一定周期后可以分离单克隆抗体。 总的来说，单克隆抗体制备的基本原理是通过免疫应答激发产生抗体 原型细胞，然后与肿瘤细胞融合形成无限增殖的杂交瘤细胞，再通过杂交
瘤筛选和单克隆细胞培养等环节，最终获得大量单克隆抗体。这一技术在生命科学和医学领域中具有广泛的应用前景。