单克隆抗体制备简要流程

单克隆抗体制备是指由经过严格筛选的单一B淋巴细胞克隆所产生的免疫球蛋白。与

多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更高的特异性和亲和力，常用于临床诊断、治疗和生物

学研究等领域。

1. 免疫原制备

选择适当的免疫原，如蛋白质、多肽、糖类、细胞表面标志物等，制备纯度高的免疫原。

2. 动物免疫

将免疫原注射到小鼠、大鼠、兔子、山羊等动物体内，使其产生抗体。多次免疫可提

高抗体产量。

3. 获得脾细胞

动物免疫一定时间后，取获得抗体最高的动物的脾脏，制备成脾细胞悬液。

4. 杂交瘤细胞的制备

将获得的脾细胞与哺乳动物体系中的恶性肿瘤细胞进行杂交并筛选得到杂交瘤细胞。

杂交细胞的特点是具有脾细胞的免疫能力和长时间的生长能力。

5. 筛选单克隆抗体

使用ELISA、免疫印迹等技术检测杂交瘤细胞是否产生抗体。筛选出产生单一种抗体

的细胞克隆。

将筛选得到的细胞克隆大量培养，并收集其分泌的单克隆抗体。通过某些纯化技术，

如蛋白A、蛋白G亲和层析，将单克隆抗体制备成较纯的制剂。

7. 鉴定和应用

对制备好的单克隆抗体进行活性和特异性的检测，鉴定其性质和效力。通过结构修饰

或复合其他物质，制备具有更高效能和生物学适应性的单克隆抗体，用于临床诊断、治疗、疫苗开发和科学研究等领域。

以上就是单克隆抗体制备的主要流程，这一技术的发明与发展给医学和生物科技领域

带来了重大的推动和创新。

单克隆抗体制备步骤及注意事项

单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备： 1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。无菌操作取出脾脏，置于盛有 5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。 2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。 3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。再以同样的方法洗涤离心一次。 4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。注意事项： ➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。二、骨髓瘤细胞的准备： 1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。 2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。 3.制备细胞悬液，计活细胞数。 4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。注意事项：

➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。 ➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。 ➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20%。细胞的最大密度不得超过106个/mL。 ➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时。➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。 ➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。三、细胞融合： 1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。 2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。 3.用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散。 4.将离心管置于37℃水浴中，吸取1mL预热的50% PEG，缓慢滴入离心管内，30秒内加完，边加边轻轻搅拌，作用1～5min。 5.沿管壁滴加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1mL，2mL，3mL， 4mL，5mL和10mL，同时边滴加边轻轻转动离心管。 6.800r/min条件下离心5～10min，弃上清。 7.将沉淀细胞轻轻混悬于含有20%的小牛血清的HAT选择培养液中，使细胞重悬。切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

单克隆抗体制备流程图

单抗制备流程 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。一、细胞融合前准备（一）免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1X107/0.5ml ip （腹腔内注射） I 2〜3周后第二次免疫1X107/0.5ml ip I 3周后加强免疫（融合前三天）1X107/0.5ml ip或iv（静脉内注射） I 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。初次免疫Ag 1〜50ug 加福氏完全佐剂皮下多点注射（一般0.8〜1ml 0.2ml /点）

J3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip I （ip剂量不宜超过0.5ml） J3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip I （5〜7天后采血测其效价，检测免疫效果） J2〜3周后加强免疫，剂量50〜500 11g为宜，ip或iv J3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。（二）饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb/c小鼠6〜10周龄 I 拉颈处死浸泡于75%酒精，消毒3〜5分钟 I 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

单克隆抗体的制备过程

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。制备过程 1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。 2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融

合，形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。 5、单克隆抗体的大量制备

单克隆抗体制备过程

单克隆抗体制备过程单克隆抗体是指在免疫反应中仅由一种克隆的B细胞分泌的抗体，其特异性是由单个B细胞的表面受体所决定的。单克隆抗体具有高度的特异性和亲和力，因此在生命科学和医学领域中得到了广泛的应用。本文将介绍单克隆抗体制备的过程。 1. 免疫原制备制备免疫原是单克隆抗体制备的第一步。免疫原应该是具有高度特异性的抗原，能够刺激机体产生高亲和力的抗体。常用的免疫原有蛋白质、多肽、糖类、核酸等。在制备免疫原的过程中，需要注意免疫原的纯度和活性。 2. 免疫动物免疫在制备单克隆抗体的过程中，需要使用免疫动物进行免疫。常用的免疫动物包括小鼠、兔子、大鼠等。在免疫过程中，需要注意免疫动物的健康状况和免疫方案的制定。免疫方案应该包括适当的免疫原剂量、免疫时间和免疫途径等。 3. 脾细胞提取在免疫过程中，免疫动物的脾脏是提取免疫细胞的主要来源。提取脾细胞的方法包括机械破碎、胶原酶消化等。在脾细胞提取的过程

中，需要注意细胞的纯度和活性。 4. 杂交瘤细胞制备单克隆抗体的制备需要使用杂交瘤技术。杂交瘤细胞是由脾细胞和肿瘤细胞融合而成的细胞系，具有不限增殖能力和稳定性。在杂交瘤细胞制备的过程中，需要注意肿瘤细胞的选择和融合条件的优化。 5. 筛选单克隆抗体在杂交瘤细胞制备完成后，需要对杂交瘤细胞进行筛选，以筛选出具有特异性的单克隆抗体。常用的筛选方法包括ELISA、免疫印迹、流式细胞术等。在筛选过程中，需要注意抗体的特异性和亲和力。 6. 生产单克隆抗体在筛选出具有特异性的单克隆抗体后，需要进行大规模的制备。制备单克隆抗体的方法包括体外培养和体内制备。在制备过程中，需要注意抗体的纯度、活性和稳定性。单克隆抗体制备过程是一个复杂的过程，需要对各个环节进行精细的操作和严格的控制。通过合理的制备过程，可以得到高品质的单克隆抗体，为生命科学和医学领域的研究和应用提供了重要的工具。

单克隆抗体的制作流程

单克隆抗体的制作流程一、前期准备工作 1. 确定目标抗体：根据研究需求确定需要制备的单克隆抗体。 2. 筛选免疫原：选择适合的免疫原，如蛋白质、多肽、细胞等。 3. 动物选择：选择适合的动物，如小鼠、大鼠、兔子等。 4. 免疫计划设计：设计出合理的免疫计划，包括免疫剂量、次数、间隔时间等。二、免疫过程 1. 免疫原制备：将所选的免疫原纯化或合成后进行检测和确认。 2. 免疫动物注射：将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，按预定计划进行多次注射。 3. 血清采集：在最后一次注射后采集动物血清，检测抗体滴度是否达到预期水平。三、杂交细胞制备 1. 细胞系选择：选择适合的细胞系如SP2/0或NS0等。 2. 细胞培养：将细胞系培养至稳定生长状态，并进行筛选和确认。 3. 细胞融合：将免疫小鼠脾细胞与SP2/0或NS0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。 4. 杂交瘤筛选：利用HAT培养基对杂交瘤进行筛选，筛选出产生单克

隆抗体的杂交瘤。四、单克隆抗体制备 1. 单克隆细胞培养：将单个杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养。 2. 单抗酶标法检测：利用ELISA等技术检测单克隆抗体的特异性和亲和力。 3. 大规模培养：将筛选出的单克隆细胞进行大规模培养，得到足够多的单克隆抗体。 4. 纯化和鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对单克隆抗体进行纯化，并进行质量鉴定。五、应用 1. 体外实验应用：如ELISA、Western blotting等技术中作为检测试剂使用。 2. 体内实验应用：如流式细胞术、组织切片染色等技术中作为荧光标记或特异性结合试剂使用。 3. 临床应用：如治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面的治疗药物。六、总结单克隆抗体的制备流程包括前期准备工作、免疫过程、杂交细胞制备、单克隆抗体制备和应用等环节。其中，前期准备工作和免疫过程是制备成功的关键，而单克隆抗体制备需要经过多次筛选和鉴定才能得到

单克隆抗体研制最详细步骤

单克隆抗体研制最详细步骤 1.抗原选择：首先，选择需要制备单克隆抗体的目标抗原。这个抗原可以是来自于生物体的蛋白质、多肽、糖或其他小分子。 2.免疫动物选择：根据抗原的种类选择适当的动物进行免疫。一般常用的动物包括小鼠、大鼠和兔子。 3.免疫接种：将选定的抗原注射到免疫动物体内，激发其产生抗体。在接种前，可以根据需要选择适当的免疫佐剂来增强免疫效果。 4.血清采集：在免疫动物产生了充分的免疫应答后，采集免疫动物的血清。 5.B细胞获取：从免疫动物的脾脏或骨髓中获取B细胞，这些细胞可以产生特定的抗体。 6.融合细胞生成：将B细胞与骨髓瘤细胞（如鼠骨髓瘤细胞NS1或人骨髓瘤细胞SP2/0）用聚乙二醇等化学物质或电穿孔法进行细胞融合，形成杂交瘤细胞。 7.杂交瘤筛选：通过增殖选择方法（如HAT培养基）对细胞进行筛选，筛选出具有产生抗体能力的杂交瘤细胞。 8.单克隆细胞扩增：选出抗体阳性的培养皿（通常是96孔板）中的单克隆细胞，继续进行扩增培养。 9.抗体检测：通过ELISA、免疫组化等方法检测细胞上所产生的抗体的特异性和亲和力。

10.抗体纯化：对单克隆抗体进行纯化，可借助离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等技术。这些技术可以去除与抗体无关的其他蛋白质或污染物。 11. 抗体鉴定：对纯化的抗体进行进一步的检测和鉴定，包括亲和力测定、特异性检验、Western blot等。 12.抗体应用：经过鉴定合格的单克隆抗体可以应用于免疫组化、免疫印迹、流式细胞术、免疫沉淀等多种分子生物学和生物医学研究领域。需要注意的是，单克隆抗体的研制是一项技术较为复杂和专业化的工作，需要科研人员具备一定的实验技术和经验。同时，不同抗原和动物的特点也需要在实验设计时进行充分的考虑。

单克隆抗体制备的基本流程和应用

英文回答： The basic process for the preparation of monoclonic resistance consists of the selection of suitable antigens and the immunisation of animals to induce the production of specific antibodies。 The nucleic acid is then extracted from the spleen cells of immunosuppressants and， when integrated with tumour cells， it is formed into a hybrid tumour cell。 A hybrid cell is screened to obtain a single cloned hybrid cell strain of high—yield antibodies。 These monoclonal antibodies are strictly identified to ensure their purity and specificity。 This preparation process aims to ensure the quality and stability of monoclon antibodies， in line with the country ' s approach to scientific and technological development， and to promote innovative development in the field of medicine and the flourishing of health。单克隆抗体制备的基本流程包括以下环节：选择合适的抗原，对动物进行免疫，以诱导产生特异性抗体。随后，从免疫动物的脾细胞中提取核酸，在与肿瘤细胞融合后，形成杂交瘤细胞。对杂交瘤细胞进行筛选，以获得高产抗体的单克隆杂交瘤细胞株。对这些单克隆抗体进行严格鉴定，确保其纯度和特异性。这一制备流程旨在保证单克隆抗体的质量和稳定性，符合国家的科学技术发展方针，有利于推动医药

单克隆抗体纯化过程

单克隆抗体纯化过程引言单克隆抗体是一种高度特异性的蛋白质，被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域。单克隆抗体的纯化是制备高纯度、高活性的单克隆抗体的关键步骤之一。本文将详细介绍单克隆抗体纯化过程及其相关技术。单克隆抗体纯化过程 1. 细胞培养与收获单克隆抗体的制备首先需要进行细胞培养。通常使用哺乳动物细胞（如CHO细胞）作为表达宿主，将表达目标单克隆抗体的重链和轻链基因转染到CHO细胞中。经过适当的培养条件，使得CHO细胞表达目标单克隆抗体。当细胞达到一定密度后，可以进行收获。收获过程中，需要将培养基与细胞分离，并将细胞沉淀下来。常用的方法有离心和滤液等。 2. 细胞破碎与抗体提取收获的细胞需要进行破碎，以释放细胞内的抗体。细胞破碎可以通过超声波、高压均质器、刀式破碎机等方法实现。破碎后的细胞溶液中含有目标单克隆抗体、细胞碎片和其他杂质。为了提取目标单克隆抗体，需要进行固液分离。常用的方法有离心和滤液等。离心可以将细胞碎片和大颗粒杂质沉淀下来，而滤液可以去除较小颗粒的杂质。 3. 亲和层析亲和层析是单克隆抗体纯化过程中最常用的方法之一。通过利用抗体与特定配体（如蛋白A或蛋白G）之间的特异性结合，将目标单克隆抗体选择性地吸附到固定在亲和树脂上的配体上。亲和层析通常包括以下步骤： - 树脂平衡：将亲和树脂与缓冲液进行平衡，以确保树脂处于最佳状态。 - 样品加载：将含有目标单克隆抗体的样品加入亲和树脂中，使得抗体与配体结合。 - 洗脱：使用特定的洗脱缓冲液，将非特异性结合的杂质洗脱，保留目标单克隆抗体。 - 再生：通过使用再生缓冲液，将目标单克隆抗体从亲和树脂上解离下来，以便进行下一轮层析。

单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN

单克隆抗体制备操作方法及注意事项 JEN

无菌室清洁要求：1、进入无菌间，须更换白大褂，口罩、鞋套必须戴上，最好戴上帽子、手套； 2、进去后用酒精棉球擦洗手； 3、生物安全柜常见酒精棉球擦洗，擦后棉球不显黑；柜内垃圾当日及时清理；柜内所有实验操作应在酒精灯前进行；经常紫外杀菌； 4、无菌间物件传递，经窗口紫外照射方可； 5、有关试剂使用后及时用封口膜封住； 6、细胞培养盖子旋松，以便二氧化碳气体进入；拿瓶、加液体均需注意瓶口，避免污染瓶盖； 7、出门后需要用钥匙锁上； 8、整个无菌间两周清洁一次；免疫动物：选择与瘤细胞同一品系的动物做为免疫对象，现在常见的是Balbc/c小鼠，6-8周龄，一种抗原一次性注射2-3只小鼠，小鼠不宜过大，雌性相对较好；首次注射抗原100微克与等体积弗氏完全佐剂混匀，在背部两侧皮下与腹腔分别注射，形成几个小泡；间隔两周左右时间（14天）二次免疫注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在；间隔两周左右时间（14天）三免小鼠注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部

皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在；间隔7-10天左右时间尾部采血测定抗体效价：方法一：手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝下，小鼠保定后将其尾巴置于50°热水中浸泡数分钟，使尾部血管充盈。擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖1～2mm，用试管接流出的血液，同时自尾根部向尾尖按摩。取血后用棉球压迫止血并用6%液体火棉胶涂在伤口处止血。每次采血量0.1ml。方法二：固定小鼠，一人捏住小鼠耳朵固定小鼠，同时抓住尾梢协助取血，另一个人左手捏住小鼠尾巴根部，右手用酒精棉球擦洗，使尾部血管充盈，食指抵住尾巴，用一次性1ml注射器穿刺血管，用10微升移液枪及时吸取全血2.5微升，加在盛有97.5微升的PBS缓冲液中稀释10倍，再稀释一百倍，之后做倍比稀释测定效价，读数到阴性血清值的 2.1倍，合理效价应高于12.8万倍。实际操作显示，采血使用剪尾方法较好，一人固定小鼠，另一人直接在尾端剪掉1-2mm，从尾根部向尾尖部按摩，在尾端可见一滴血，吸取2.0微升加在2ml的PBS溶液中，直接稀释1000倍，混匀，再倍比稀释测定效价；当日或次日，对全血用生理盐水进行倍比稀释，测定抗体效价，效价未达到标准，则继续进行常规免疫，效价达到标准，则选择效价最高的一只小鼠作为脾细胞源鼠，并在细胞融合三天前尾静

单克隆抗体制备流程

单抗制备流程 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。一、细胞融合前准备 (一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射) ↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5ml ip ↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT 的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。 (四) 免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。二、细胞融合，选择杂交瘤 (一) 细胞融合流程 (1) 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。 (2) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。 (3) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml 塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。 (4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。 (5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。 (6) 在室温下融合: ①30秒内加入预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。 ②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。 ③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

单抗制备的详细步骤

单抗制备的详细步骤单抗（monoclonal antibody）是由单一细胞母克隆细胞系产生的抗体，具有高度特异性和一致性。单抗制备的过程通常包括免疫原的选择、动物免疫、细胞融合、克隆筛选和克隆扩增等步骤。下面将详细介绍这些步骤。第一步，免疫原的选择。免疫原是制备单抗必不可少的关键组成部分。免疫原的选择应基于目标抗体的特异性和重要性。常用的免疫原包括蛋白质、多肽、多糖、细胞表面分子等。为了提高免疫原的免疫原性，可以将免疫原与佐剂混合，以增强其免疫原性。第二步，动物免疫。将选择的免疫原注射到合适的动物体内。常用的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子等。在免疫过程中，通常需要多次免疫，在每次免疫之间有一定的间隔时间，以增强免疫效果。在免疫的过程中，可以通过采血检测免疫反应的进展，并决定最佳的免疫时间点。第三步，细胞融合。在免疫过程中，免疫细胞会产生针对免疫原的抗体。为了制备单抗，需要将这些抗体产生的免疫细胞与癌细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。常用的癌细胞包括骨髓瘤细胞、葡萄膜炎细胞等。第四步，克隆筛选。将细胞融合密度适宜的细胞悬浮液均匀分配到培养皿中，使单个杂交瘤细胞分布在不同的培养皿中。培养皿中含有特定选择性培养基，使只有杂交瘤细胞能够存活和生长。在适当的条件下，杂交瘤细胞会形成一个细胞克隆。然后，可以通过ELISA、细胞培养和动物注射等方法对克隆的细胞上清液进行筛选，以检测是否含有特定的抗体。

第五步，克隆扩增。通过继续培养和传代，可以扩增含有特定抗体的细胞克隆。克隆扩增的时间可能需要数周或数月，具体取决于细胞系的生长速度和特性。最后，可以将克隆扩增的细胞培养液进行纯化和浓缩，以获得高纯度的单抗。通常使用亲和层析、离心、电泳等技术进行单抗的纯化。单抗制备的最终产品可以用于医学研究、诊断和治疗等领域。尽管以上步骤可以概括标准的单抗制备过程，但实际制备中可能因为不同的实验目的和具体需求而存在一些变化。制备单抗是一个复杂而耗时的过程，需要专业的实验技术和丰富的经验。

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程 1.免疫原的制备和动物的免疫：在开始制备单克隆抗体之前，首先需要制备免疫原。免疫原可以是蛋白质、多肽、多糖、细胞表面抗原等。制备免疫原的常用方法包括化学合成、原核表达系统、真核表达系统等。制备好免疫原后，将其与适当的佐剂混合，然后通过注射等方式将免疫原引入到实验动物体内。通常使用小鼠、大鼠或兔子作为免疫动物。 2.脾细胞的获取和混合瘤细胞的建立：在免疫过程中，免疫原会刺激机体产生大量的抗体。当机体免疫反应达到一定水平时，需要从免疫动物体内获取脾脏，获得含有抗体产生细胞的脾细胞悬液。将脾细胞与能激活脾细胞的细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合，形成混合瘤细胞。 3.杂交瘤细胞的筛选和鉴定：将混合瘤细胞进行稀释，分装到96孔板中，使每个孔中只包含一个细胞。这样每个孔中的细胞都是一个潜在的单克隆细胞。随后，每个孔中的细胞在培养基中进行培养，以使细胞形成单个克隆。根据杂交瘤细胞产生的特定抗体，可以使用ELISA等方法进行筛选和鉴定，以确定具有所需抗体的杂交瘤细胞。 4.单克隆抗体的生产和纯化：将筛选出来的单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，并定期收集培养上清液以获取单克隆抗体。为了提高单克隆抗体的纯度和浓度，通常需要对培

养上清液进行多次纯化。典型的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。综上所述，单克隆抗体的制备流程包括免疫原的制备和动物的免疫、脾细胞的获取和混合瘤细胞的建立、杂交瘤细胞的筛选和鉴定，以及单克隆抗体的生产和纯化等几个主要步骤。每个步骤都需要精确操作和耐心等待，但最终可以获得高纯度和高特异性的单克隆抗体，这在生物医学研究和临床诊断中具有重要的应用价值。

单克隆抗体制备流程

单克隆抗体制备流程首先，在单克隆抗体制备之前，需要选择一个适当的抗原。抗原可以是蛋白质、多肽、糖类或其他小分子。选取抗原时，需要考虑抗原的表达水平、抗原的免疫原性以及抗原的稳定性等因素。接下来，选择一个合适的实验动物进行免疫。常用的实验动物有兔子和小鼠。在免疫之前，需要先给实验动物注射适量的佐剂，以增强免疫效果。通常，实验动物会被多次免疫，每次免疫之间有一段时间的间隔。在实验动物免疫一段时间后，可以进行细胞融合以产生混杂瘤细胞。混杂瘤细胞通常是由B细胞和骨髓瘤细胞融合而成，对于小鼠骨髓瘤细胞，常用的有SP2/0和NS0细胞系。融合的方法主要有两种：一种是将免疫细胞和骨髓瘤细胞混合，然后使用聚乙二醇（PEG）进行融合；另一种是使用电击脉冲进行细胞融合。融合细胞会经过适当的培养条件进行筛选和扩增。在融合细胞扩增过程中，会进行筛选以保证融合细胞是产生单克隆抗体的。最常用的筛选方法是酶联免疫吸附测定（ELISA）。抗原会被固定在微孔板上，然后将培养液中的细胞涂覆在孔中。如果其中一孔中有抗体分泌，则抗原会被结合，并且可以通过添加辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗和基质来检测抗体的存在。经过筛选和鉴定后，选择一个或多个产生单克隆抗体的细胞进行单克隆扩增。单克隆扩增时，可以通过细胞有限稀释法以及酵母酶聚合酶链式反应（YAC-PCR）等方法进行。

最后，可以通过收集上述单克隆细胞的上清液或细胞提取物来得到单克隆抗体。上清液或细胞提取物中的抗体可以通过纯化方法，如蛋白A/G 亲和层析或蛋白L亲和层析等，得到纯化的单克隆抗体。综上所述，单克隆抗体的制备流程包括抗原选择、免疫动物、细胞融合、筛选和克隆等步骤。通过这些步骤，可以获得单克隆抗体用于科学研究和临床应用。

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程（一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺,离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原,再加佐剂. 常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂. 初次免疫抗原1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0。8～1ml,0。2ml/点) ↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0。5ml) ↓3周后第三次免疫剂量同一,不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价) ↓2～3周加强免疫,剂量50～500μg为宜,ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如:①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性. （2)颗粒抗原免疫性强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞. 初次免疫1×107/0。5ml ip ↓2～3周后第二次免疫1×107/0。5ml ip ↓3周后加强免疫（融合前三天）1×107/0。5ml ip或iv ↓ 取脾融合（二）细胞融合 1．细胞融合前准备（1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb 的过程中，许多环节需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾