噬菌体的分离与纯化 优化版
噬菌体的分离与纯化
实验用具及材料
1.菌种：大肠杆菌
2.试剂：氯仿
3.培养基：
1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，
NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；
2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，
NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭
菌；
3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入
1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌；
4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加
入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌
4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌
过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴锅，离心机等
实验步骤
1.噬菌体的分离
（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置
37℃培养过夜。/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下
菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混
合后置37℃振荡培养12～24h。
（3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一
无菌离心管中。
（4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用。
（5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养
基表面上。待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，
置37℃培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明
或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。
2.噬菌体的纯化
（1）取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀；
（2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃（可预先溶化后置45～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的
混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37℃培
养12~24h；
（3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。此过程制备的裂解液中往往
有多种噬菌体，需进一步纯化；
（4）纯化时，通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一下，蘸取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中，置37℃振荡培
养，直至试管中菌悬液由浑浊变清；培养物经离心后取上清
液，再重复步骤⑵、⑶直到出现的噬菌斑形态一致为止
注意事项
1.使用仪器要保证是灭菌的；
2.注意琼脂的浓度；
3.氯仿是易燃品，应远离火焰
一、生物测定法
1、双层琼脂平板法
1）倒下层琼脂
融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。
2）倒上层琼脂
融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入大肠杆菌菌液0.2mL，上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。
3）恒温培养
30℃恒温培养6～12h观察结果。
4）观察结果
如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑──噬菌斑。
2、单层琼脂平板法
省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%，融化后冷却至45℃左右，如同上法加入大肠杆菌和噬菌体增殖液，混合后迅速倒平板。30℃恒温培养6～16h后观察结果。
噬菌体效价的测定
1、倒平板
将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11
个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培
养皿底部注明噬菌体稀释度。
2、稀释噬菌体
按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有
4.5mL1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6稀释度。噬菌体与菌液混合
将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，
每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，
并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬
菌体液混合均匀，置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸
附并侵入菌体细胞。
接种上层平板
将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基
5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立
即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅
速地铺展表面。水平静置，凝固后置37℃培养。
观察并计数
观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于实验报告表格内，选取每皿
有30～300个噬菌斑的平板计算噬菌体效价。
?计算公式：N=Y/V×X
（Ｎ：效价值，Ｙ：平均噬菌斑数／皿，Ｖ：取样量，Ｘ：稀释度）
例如：当稀释度为10-6时，取样量为0.1mL/皿，同一稀释度中３个平板上的噬菌斑的平均值为186个，则该样品的效价为：Ｎ＝186
／0.1×10-6＝1.86×109。
结果
1、噬菌体检查
2）绘出平板上的噬菌斑检测结果，指出噬菌斑和宿主细菌。
2、噬菌体效价测定
1）平板上噬菌斑数目
噬菌体稀释度10-410-510-6对照
噬菌斑数（个）/皿
平均每皿噬菌斑数目
2）计算噬菌体效价(即噬菌斑形成单位pfu,plague-formingunit).
噬菌体的分离与纯化
大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化 【实验目的】 1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。 2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。 3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。 4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。 5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。 【实验原理】 1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。 2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是： （1）培养寄主细胞（大肠杆菌）； （2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）； （3）将样品内的细胞进行富集培养； （4）制备噬菌体裂解液； （5）检测噬菌体是否存在； （6）噬菌体的纯化及效价测定。 3.培养基的配制（配方）与灭菌 （1）3×牛肉膏蛋白胨培养液： 牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4. （2）牛肉膏蛋白胨培养液： 牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4. （3）牛肉膏蛋白胨固体培养基： 牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。 （4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基： 牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。 封好做好标记于121℃灭菌20min备用 【实验材料及器皿】 1.菌种：大肠埃希氏菌。 2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水 3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。 4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。 【实验方法步骤】 第一周：实验方案的讨论与完善 第二周：培养基的配制及相关实验器材的灭菌 牛肉膏蛋白胨固体培养基100ml，并取三个试管各加入3—4ml以搁斜面保留菌种 3X牛肉膏蛋白胨培养液50ml，装小三角瓶内 牛肉膏蛋白胨培养液100ml分装到5个大试管中，每管9ml，并依次标记10-5—10-1，剩余的装试管做好标记 离心管12个（包好） 无菌水2管（3—4ml每管）
生物大分子分离技术综述
生物大分子分离技术综述 摘要：生物大分子包括核酸DNA和RNA、多糖、酶、蛋白质以及多肽等。生物大分子分离技术是生物研究中的核心技术之一，当前医学，药学及生命科学学科之间的交叉渗透为大分子分离技术的发展提供了更多的契机。本文对以沉淀、透析、超滤和溶剂萃取为代表的传统分离技术, 以及色谱, 电泳等现代分离技术的发展概况、方法、特点及应用进行了综述。 关键字：分离技术生物大分子 1前言 生命科学的发展给生物大分子的分离技术提出了新的要求。各种生化、分子研究要求提取分离高纯度，结构完整和具有生物活性的活性的生物大分子样品，这就使得分离技术在各项研究中起着至关重要的作用。对生物大分子分离技术的研究也就随之产生。同时，随着各学科之间的交叉渗透，纳米材料、计算机自动化等技术的发展也为生物大分子技术的发展提供了更多的空间。 生物大分子的制备具有如下特点：生物样品的组成极其复杂，许多生物大分子在生物样品中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，耗时长；许多生物大分子在分离过程中就非常容易失活，因此分离过程中如何保证生物大分子的活性，也是提取制备的困难之处；生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的,温度、PH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。这些都要求生物大分子的分离技术以此为依据，突破这些难点，优化分离程序以获得符合要求的生物大分子试剂。 2传统分离技术 被广泛应用传统的生物大分子分离方法有透析、溶剂萃取、沉淀和超滤等，它们都是一些较早就建立起来比较完善的的分离方法。 2.1透析法 1861年Thomas Graham发明透析方法,已成为生物化学实验中最简易常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的分离过程中,除盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品等都需用到透析。现在，除半透膜的材料更加多样化，透析方式也更加多样。透析法主要是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。例如分离和纯化DNA、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制：透析是否成功与透析膜的规格关系极大。透析膜的膜孔有大有小，要根据欲分离成分的具体情况而选择。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等。分离时，加入欲透析的样品溶液，悬挂在纯化水容器中，经常更换水加大膜内外溶液浓度压，必要时适当加热，并加以搅拌，以利透析更快。最后，透析是否完全，须对透析膜内溶液进行检测。
生物分离与纯化技术模拟试卷三答案培训讲学
生物分离与纯化技术模拟试卷三答案
精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢2 生物分离与纯化技术模拟试卷三答案 一、名词解释（每小题3分，共15分） 1．CM-Sephadex C-50：羧甲基纤维素、弱酸性阳离子交换剂，吸水量为每克干胶吸水五克。 2．絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程 3．离心过滤：使悬浮液在离心力场作用下产生的离心力压力，作用在过滤介质上，使液体通过过滤介质成为滤液，而固体颗粒被截留在过滤介质表面，从而实现固液分离，是离心与过滤单元操作的集成，分离效率更高 4．膜分离：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。 5．层析分离：是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。 二、单选题（每小题1分，共15分） 1．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（ B ）。 A．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 2．下列哪项酶的特性对利用酶作为亲和层析固定相的分析工具是必需的？（ B ） A.该酶的活力高 B.对底物有高度特异亲合性 C.酶能被抑制剂抑制 D.最适温度高 E.酶具有多个亚基 3．盐析法沉淀蛋白质的原理是（ B ） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 4．凝胶色谱分离的依据是（B）。 A、固定相对各物质的吸附力不同 B、各物质分子大小不同 C、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 D、各物质与专一分子的亲和力不同 5．如果要将复杂原料中分子量大于5000的物质与5000分子量以下的物质分开选用（D）。 A、Sephadex G-200 B、Sephadex G-150 C、Sephadex G-100 D、Sephadex G-50 6．工业上强酸型和强碱型离子交换树脂在使用时为了减少酸碱用量且避免设备腐蚀，一般先将其转变为（B）。 A、钠型和磺酸型 B、钠型和氯型 C、铵型和磺酸型 D、铵型和氯型 7．下面哪一种是根据酶分子专一性结合的纯化方法（ A ）。 A. 亲和层析 B. 凝胶层析 C. 离子交换层析 D. 盐析 8．以下哪项不是在重力场中，颗粒在静止的流体中降落时受到的力（ B ） A.重力 B. 压力 C.浮力 D. 阻力 9．关于用氢键形成来判断各类溶剂互溶规律，下列（A）项是正确的叙述。 A、氢键形成是能量释放的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。 B、氢键形成是能量吸收的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。 C、氢键形成是能量释放的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。 D、氢键形成是能量吸收的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。 10．关于萃取下列说法正确的是（C） A. 酸性物质在酸性条件下萃取 B碱性物质在碱性条件下萃取 C. 两性电解质在等电点时进行提取 D. 两性电解质偏离等电点时进行提取 11．下列关于固相析出说法正确的是（B） A.沉淀和晶体会同时生成 B析出速度慢产生的是结晶 C.和析出速度无关 D.析出速度慢产生的是沉淀 12．那一种膜孔径最小（C） A.微滤 B超滤 C.反渗透 D. 纳米过滤 13．酚型离子交换树脂则应在（B ）的溶液中才能进行反应 A. pH＞7 B pH＞9 C. pH﹤9 D. pH﹤7 14．一般来说，可使用正相色谱分离（B） A. 酚 B带电离子 C. 醇 D. 有机酸 15．离子交换层析的上样时，上样量一般为柱床体积的（C）为宜。 A. 2％-5％ B1％-2％ C. 1％-5％ D. 3％-7％ 三、判断题（每小题1分，共10分） 1．珠磨法中适当地增加研磨剂的装量可提高细胞破碎率。（×） 2．进料的温度和pH会影响膜的寿命。（√） 3．应用有机溶剂提取生化成分时，一般在较高温度下进行。（×） 4．溶剂的极性从小到大为丙醇＞乙醇＞水＞乙酸。（√） 5．蛋白质为两性电解质，改变pH可改变其荷电性质，pH﹤pI蛋白质带正电。（√） 6．进行水的超净化处理、汽油超净、电子工业超净、注射液的无菌检查、饮用水的细菌检查使用孔径为0.2μm的膜。（×） 7．只有树脂对被交换离子比原结合在树脂上的离子具有更高的选择性时，静态离子交换操作才有可能获得较好的效果。（√） 8．制备型HPLC对仪器的要求不像分析型HPLC那样苛刻。（√） 9．Sephadex LH-20的分离原理主要是分子筛和正相分配色谱。（√） 10．水蒸气蒸馏法是提取挥发油最常用的方法。（√） 四、填空题（每小题1分，共15分） 1．常用的蛋白质沉析方法有（等电点沉淀），（盐析）和（有机溶剂沉淀）。 2．蛋白质分离常用的色谱法有（凝胶色谱法），（多糖基离子交换色谱法），（高效液相色谱法）和（亲和色谱法）。 3．离子交换树脂由（载体），（活性基团）和（可交换离子）组成。 4．膜分离过程中所使用的膜，依据其膜特性（孔径）不同可分为（微滤膜），（超滤膜），（纳滤膜）和（反渗透膜）。 五、简答题（每小题7分，共35分） 1．在色谱操作过程中为什么要进行平衡？ 答：1、流速平衡：流速是柱层析操作当中的主要影响因素，流速的快慢直接影响着分离的效果，流速过快，混合物得不到完全的分离，流速过慢，整体分离的时间要延长，因此在分离前首先要确定留宿。
噬菌体的分离与纯化优化版
噬菌体的分离与纯化实验用具及材料 1.菌种：大肠杆菌 2.试剂：氯仿 3.培养基： 1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6g， NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌； 2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g， NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭 菌； 3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入 1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌； 4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入 0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌 4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌 过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴 锅，离心机等 实验步骤 1.噬菌体的分离 （1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置 37℃培养过夜。/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下 菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混 合后置37℃振荡培养12～24h。 （3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一 无菌离心管中。 （4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯 仿，稍作混合，备用。 （5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养 基表面上。待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上， 置37℃培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明 或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。 2.噬菌体的纯化 （1）取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀； （2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃（可预先溶化后置45～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的 混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37℃培 养12~24h； （3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。此过程制备的裂解液中往往 有多种噬菌体，需进一步纯化； （4）纯化时，通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一下，蘸取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中，置37℃振荡培
《生物分离与纯化技术》授课教案
《生物分离与纯化技术》授课教案 第一章绪论 教学目的：熟悉生物物质的概念、种类和来源；了解分离纯化技术及其基本原理；熟悉分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；掌握分离纯化的特点与一般步骤；了解生物分离纯化技术的发展历史；熟悉生物分离纯化技术的发展趋势。 教学重点：生物物质的概念、种类和来源；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；分离纯化的特点与一般步骤；生物分离纯化技术的发展趋势。 教学难点：分离纯化技术及其基本原理；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作。教学课时：4 学时 教学方法：多媒体教学 教学内容： 第一节生物分离与纯化的概念与原理 一、生物物质的概念、种类和来源 1. 生物物质：氨基酸及其衍生物类、活性多肽类、蛋白质、酶类、核酸及其降解 物、糖、脂类、动物器官或组织制剂、小动物制剂、菌体制剂 2. 生物物质来源：动物器官与组织、植物器官与组织、微生物及其代谢产物、细胞培养产物、血液、分泌物及其代谢物 二、生物分离纯化概念 指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或动植物组织细胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。 三、生物分离纯化技术
生物技术 上游：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程及组织工程；下游：生物产品的回收——生物分离与纯化技术，主要包括离心技术、细胞破碎技术、萃取技术、固相析出技术、色谱技术和膜分离技术等。 四、分离纯化基本原理 有效识别混合物中不同组分间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质或扩大这些差别的分离设备来实现组分间的分离或目标产物的纯化。
第二节分离纯化策略 一、生物分离纯化技术的特点 1. 环境复杂、分离纯化困难 2. 含量低、工艺复杂
噬菌体分离
变形杆菌（大肠杆菌）噬菌体生理特性研究 1.变形杆菌、大肠杆菌的纯化 划线分离纯化 2. 变形杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体分离 器材： 菌种：变形杆菌、大肠杆菌 噬菌体样品：阴沟污水（100ml），土壤 培养基：3倍牛肉膏蛋白胨培养液（4瓶，每瓶50ml），牛肉膏培养液，牛肉膏蛋白胨半固体培养基（倒上层用），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（倒底层用） 仪器：离心机，细菌滤器，抽滤装置，恒温水浴锅，无菌涂布器，无菌吸管等 步骤： a.培养大肠杆菌至对数期600nm（OD值0.8左右） b.增殖噬菌体样品：取上述大肠杆菌培养液6ml于盛有50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，后加入污水样100ml（离心并过滤除菌），继续37℃摇床振荡培养12-14h，以增殖噬菌体。 c.制备裂解液：将以上培养液3000r/min离心30min，将上清液过滤除菌，取100ml 滤液及5ml大肠杆菌液加入50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃培养12-18h 进行噬菌体富集。 d.将以上富集液3000r/min离心30min后，取上清液10mL加入5mL 3×倍牛肉膏蛋白胨培养液及相应宿主菌液1mL，室温下放置1h，37℃ 120rpm振荡培养 3.5h。 e.收集噬菌体：将上述培养液于4℃下12,000g 离心30min，上清液再经微孔滤膜（0.22μm）过滤，滤液即为拟含有相应宿主菌噬菌体的原液。 f.验证噬菌体存在：在大肠杆菌平板上，滴加上述滤液5-7小滴,同时滴加生理盐水作为对照，进行标记，37℃培养18-20h，若出现噬菌斑，则证明滤液中存在噬菌体。 3. 变形杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体纯化 (1)用接种环取菌液一环接种于液体培养基内，再加人0.1ml大肠杆菌悬液，使混合均匀。 (2）取上层琼脂培养基，溶化并冷至48℃（可预先溶化、冷却，放48℃水溶箱内备用）,加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2ml，立即混匀，并立即倒人底层培养基上，混匀，置37℃培养12h。 (3）此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内。于37℃
噬菌体的分离与纯化优化版
噬菌体的分离与纯化优 化版 集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
噬菌体的分离与纯化 实验用具及材料 1.菌种：大肠杆菌 2.试剂：氯仿 3.培养基： O至1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6 g，NaCl 1g，加H 2 200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌； O至2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏 0.9g，NaCl 1.5g，加H 2 100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌； 3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉， 121 ℃20min高压灭菌； 4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉， 121℃20min高压灭菌 4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌过滤器（孔径 0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴锅，离心机等 实验步骤 1.噬菌体的分离
（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置37℃培养过夜。/取大肠杆菌斜面一支，加4ml 无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。 （2）增殖培养：在盛有10mL 3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混合后置37℃振荡培养12～24h。 （3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经 4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中。 （4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用。 （5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌 液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上。待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，置37℃培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。 2.噬菌体的纯化 （1）取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀； （2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃（可预先溶化后置45～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37℃培养12~24h； （3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。此过程制备的裂解液中往往有多种噬菌体，需进一步纯化；
生物分离与纯化技术模拟试卷九答案
生物分离与纯化技术模拟试卷九答案 装 订 线 一、名词解释（每小题3分，共15分） 1．离心分离技术：是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。 2．物理萃取：即溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应。 3．有机聚合物沉析：利用生物分子与某些有机聚合物形成沉淀而析出的分离技术称为有机聚合物沉析。 4．平衡离子：离子交换树脂中与功能基团以离子键联结的可移动的平衡离子，亦称活性离子。 5．离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。 二、单选题（每小题1分，共15分） 1．葡聚糖凝胶可使用那种溶剂溶胀（C ） A.甲醇 B 乙醇 C.缓冲液 D.乙酸乙酯 2．不能用于固液分离的手段为（C ） A.离心 B 过滤 C.超滤 D.双水相萃取 3．最常用的干燥方法有（ D ） A 、常压干燥 B 、 减压干燥 C 、喷雾干燥 D 、以上都是 4．物理萃取即溶质根据（ B ）的原理进行分离的 A.吸附 B.相似相溶 C 分子筛 D 亲和 5．适合小量细胞破碎的方法是（ B ） A.高压匀浆法 B.超声破碎法 C.高速珠磨法 D.高压挤压法 6．关于分配柱层析的基本操作错误(D )。 A 装柱分干法和湿法两种 B 分配柱层析法使用两种溶剂，事先必须先使这两个相互相饱和 C 用硅藻土为载体，需分批小量地倒入柱中，用一端是平盘的棒把硅藻压紧压平 D 分配柱层析适用于分离极性比较小、在有机溶剂中溶解度大的成分，或极性很相似的成分。 7．颗粒与流体的密度差越小，颗粒的沉降速度（ A ） A.越小 B.越大 C.不变 D.无法确定 8．“类似物容易吸附类似物”的原则,一般极性吸附剂适宜于从何种溶剂中吸附极性物质（ B ） A ．极性溶剂 B ．非极性溶剂 C ．水 D ．溶剂 9．关于大孔树脂洗脱条件的说法，错误的是： （ A ） A 、最常用的是以高级醇、酮或其水溶液解吸。 B 、对弱酸性物质可用碱来解吸。 C 、对弱碱性物质可用酸来解吸。 D 、如吸附系在高浓度盐类溶液中进行时，则常常仅用水洗就能解吸下来。 10．亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作 （ D ） A 、 阴性洗脱 B 、剧烈洗脱 C 、正洗脱 D 、负洗脱 11．下列哪一项不是常用的滤布材料 （ C ） A. 法兰绒 B. 帆布C. 滤纸 D.斜纹布 12．阴树脂易受有机物污染，污染后，可用（ B ）处理 A 柠檬酸 B 10%NaCl+2%～5%NaOH 混合溶液 C 氨基三乙酸 D EDTA 13．HPLC 是哪种色谱的简称（ C ）。 A ．离子交换色谱 B.气相色谱 C.高效液相色谱 D.凝胶色谱 14．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（ B ）。 A ．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 15．分离纯化早期，由于提取液中成分复杂，目的物浓度稀，因而易采用 （ A ） A 、分离量大分辨率低的方法 B 、分离量小分辨率低的方法 C 、分离量小分辨率高的方法 D 、各种方法都试验一下，根据试验结果确定 三、判断题（每小题1分，共10分） 1．有机溶剂被细胞壁吸收后，会使细胞壁膨胀或溶解，导致破裂，把细胞内产物释放到水相中去。（√ ） 2．向含有生化物质的水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，能使生化物质沉淀析出。（√ ） 3．等电点沉淀在实际操作中应避免溶液pH 上升至5以上。（√ ） 4．在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS ），影响凝胶的形成。（× ） 5．当气体的温度超过其临界温度，压力超过临界压力之后，物质的聚集状态就介于气态和液态之间，成为超临界流体。（√ ） 6．冻结-融化法冻结的作用是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性来破坏细胞的。（√ ） 7．盐析作用也能减少有机溶剂在水中的溶解度，使提取液中的水分含量减少。可以促使生化物质转入有机相从而提高萃取率。（√ ） 8．氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等两性物质可用等电点沉析。（√ ） 9．甲醇沉淀作用与乙醇相当，但对蛋白质的变性作用比乙醇、丙酮都小，所以应用广泛。（×） 10．若两性物质结合了较多阳离子（如Ca2+、Mg2+、Zn2+等），则等电点pH 升高。（√ ）
噬菌体的检测
噬菌体的检测 双层琼脂平板法测定噬菌体操作： 器材以及药品： 1.器材：试管及试管塞（已灭菌）、移液枪（200ul以及5ml）以及相应的无菌枪头、90mm 平板（已灭菌）、250ml三角瓶、酒精灯、琼脂粉、分离提纯的噬菌体液以及敏感菌（已经活化好的）。 方法及步骤： 1.配制培养基：LB液体培养基（1000ml水：10g蛋白胨：5g酵母粉：5g氯化钠）、1.5%的固体培养基、0.7%的半固体培养基； 2.倒平板：将1.5%的固体培养基熔化，每个平板倒10-15ml的1.5%固体培养基，然后静置至平板上没有水珠为好，平板数根据实际需要而定； 3.分装0.7%的半固体培养基：将0.7%的半固体培养基加热熔化，然后用5ml的移液枪向每个试管（已灭菌）加入5ml的半固体培养基；试管的数量和上一步平板数是相同的。如果试管很多，防止培养基凝固，可将已分装好的试管放入水浴温度为55℃左右的水浴锅中保温； 4.等到试管中培养基温度降至45 ℃-50 ℃之间（不烫手）时，迅速向试管中加入100ul 敏感菌和100ul的噬菌体液（噬菌体浓度要适当，这样才能看到明显的噬菌斑），摇匀； 5.将摇匀好的该培养基迅速倒入之前已倒有1.5%固体培养基平板中，晃动平板，使其铺满平板，静置； 6.待所有平板倒好后（最好静置2h左右），将其放入30 ℃恒温箱中培养12h左右，即可观察有无噬菌斑。 注：所有操作在酒精灯旁进行！ 噬菌斑效果图
培养噬菌体的方法： 一. 液体培养法 1. 将指定之寄主细菌以液体培养法于适当温度下培养，一般培养16~24小时。 2. 将噬菌体原液100 μl 与寄主细菌悬浮液300 μl均匀混合，静置15分钟使其感染。 3. 将混合液接种至含10 ml新鲜液体培养基的试管中，于适当温度下振荡培养约8~24小 时，培养时间依噬菌体之不同而异。 4. 将培养液移入离心管中，以10,000 rpm (5,000 g)离心10分钟，以沉淀寄主细菌。 5. 将上清液移至新管中，以0.22μm孔径之过滤器(filter)去除残余菌体，即得不含寄 主细菌之噬菌体原液。但因噬菌体原液呈透明状，无法以肉眼直接判断其增殖效果，故应测定其效价以确认增殖培养之成效。 二. 双层琼脂培养法 1. 将指定之寄主细菌以液体培养法于适当温度下培养，一般培养16~24小时。 2. 将噬菌体原液100 μl 与寄主细菌悬浮液300 μl均匀混合，静置15分钟使其感染。 3. 将混合液加入5 ml 冷却至45℃的0.7﹪琼脂培养基中，均匀混合后立即平铺在已倒 好的1.8﹪琼脂培养基平板上。 4. 待平板凝固后移至适当温度之培养箱中，一般培养8~24小时，培养时间依噬菌体之 不同而异。 5. 以上述相同之步骤制作另一不含噬菌体之对照组。 6. 将培养好的平板与对照组比较其澄清度，一般含噬菌体之平板呈澄清状，而仅含寄主 细菌之对照组则呈混浊状。 7. 将含有噬菌体之平板置于-20℃下4~5小时后，取出置于室温下解冻。 8. 将解冻后产生的液体移入离心管中，以10,000 rpm (5,000 g)离心10分钟以沉淀寄主 细菌。 9. 将上清液移至新管中，以0.22 μm孔径之过滤器(filter)去除残余菌体，即得不含寄 主细菌之噬菌体原液。 三. 表面琼脂培养法 1. 将指定之寄主细菌以液体培养法于适当温度下培养，一般培养16~24小时。 2. 将寄主细菌悬浮液3 ml均匀平铺于1.8﹪琼脂培养基平板上，静置2小时。 3. 将多余的寄主细菌悬浮液吸出，再将噬菌体原液0.3 ml均匀涂抹于平板上。 4. 于适当温度下培养约16~24小时，培养时间依噬菌体之不同而异。 5. 取5 ml 新鲜液体培养基加入平板中，以L 形玻棒刮洗下平板表面之菌体。 6. 将刮洗下之液体移入离心管中，以10,000 rpm (5,000 g)离心10分钟以沉淀寄主细菌。 7. 将上清液移至新管中，以0.22 μm孔径之过滤器(filter)去除残余菌体，即得不含寄 主细菌之噬菌体原液。
噬菌体的分离与纯化优化版
噬菌体的分离与纯化优化 版 This manuscript was revised on November 28, 2020
噬菌体的分离与纯化 实验用具及材料 1.菌种：大肠杆菌 2.试剂：氯仿 3.培养基： 1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6g， NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌； 2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g， NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭 菌； 3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入 1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌； 4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入 0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌 4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌 过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴 锅，离心机等 实验步骤 1.噬菌体的分离 （1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置 37℃培养过夜。/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下 菌苔，制成菌悬液。 （2）增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混 合后置37℃振荡培养12～24h。 （3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一 无菌离心管中。
（4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯 仿，稍作混合，备用。 （5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养 基表面上。待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上， 置37℃培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明 或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。 2.噬菌体的纯化 （1）取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀； （2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃（可预先溶化后置45～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的 混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37℃培 养12~24h； （3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。此过程制备的裂解液中往往 有多种噬菌体，需进一步纯化； （4）纯化时，通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一下，蘸取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中，置37℃振荡培 养，直至试管中菌悬液由浑浊变清；培养物经离心后取上清 液，再重复步骤⑵、⑶直到出现的噬菌斑形态一致为止 注意事项 1.使用仪器要保证是灭菌的； 2.注意琼脂的浓度； 3.氯仿是易燃品，应远离火焰 一、生物测定法 1、双层琼脂平板法 1）倒下层琼脂 融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。 2）倒上层琼脂
噬菌体的分离与纯化
噬菌体的分离纯化及一步生长曲线的绘制 前言 噬菌体是以细菌为寄主的一类非细胞微生物。目前对于噬菌体的研究大多数集中在人和动物传染性疾病的防治方面，在环境的治理方面的研究报道较少，因此我们试图分离纯化污水中的噬菌体，掌握其生物学性质，应用所得噬菌体处理、净化生活污水，减少生活污水中病原性细菌的危害。本研究以从小鹅中提取的大肠杆菌为宿主菌，从污水中分离噬菌体并进行纯化，最后绘制一步生长曲线。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌种及样品 菌种：从小鹅中提取的大肠杆菌，由老师提供。 污水来源：主要来自于农大出水口。 1.1.2试剂 1mmol/L CaCl2溶液 1.1.3试剂的配制 (1) 液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨5g，牛肉膏1.5 g，NaCl 2.5g，加H2O至500mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌。 (2) 3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，NaCl 1.5g，加H2O 至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌。 (3) 固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌。
(4) 半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌。 1.1.4主要仪器 电热恒温培养箱（SHEL·LAB）、 电热恒温水温箱（HHW21·Cu600，XMTD）、 恒温摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）、 通风柜（M·TFG-A）、医用净化工作台（苏净集团安泰公司）、 台式离心机（eppendorf）、 台式高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER）、 超低温冰箱（Forma Scientific）、 YM50全自动不锈钢立式电热蒸汽消毒器、 针头式细菌过滤器、0.22μm微孔滤膜（上海市新亚净化器件厂）、 微量移液器（GILSON）、UVette(Eppendorf)。 1.2方法 1.2.1噬菌体的分离 1.2.1.1摇菌 老师提供的大肠杆菌液加入5mL1×牛肉膏液体培养基，混合后，37℃振荡（120rpm）14h，此时大肠杆菌达到了对数生长期，取出4℃保存。 1.2.1.2噬菌体分离 从农大出水口采集未经消毒处理的污水样本一瓶，经双层滤纸粗滤后取用50mL，加入氯化钙母液（终浓度为1mmol/L），再用0.22微米微孔滤膜过滤除菌。取10mL滤后液加入5mL3×牛肉膏培养液，再加
(高考生物)生物分离与纯化技术复习重点
（生物科技行业）生物分离与纯化技术复习重点
生化分离技术复习重点 1.生化分离，生化分离技术的基本步骤 生物分离与纯化的目的是从微生物发酵液，酶反应产物，动植物细胞培养和生物体本身分离并纯化对人类有用的，符合质量要求的各种生物药物和生物制品。 来源：（1）动物脏器（2）血液，分泌物和其它代谢物（3）海洋生物（4）植物（5）微生物 特点：（1）目的产物浓度低，纯化难度大（2）活性物质性质不稳定，操作过程容易失活（3）生物材料中生化组分数量大，分离困难（4）生物材料易变质，保存困难（5）生物产品的质量标准高 基本步骤：原料的选取和预处理，分离提取，精制和成品的制作 2.吸附技术 概念：是指在一定条件下，将待分离的料液（或气体）通入适当的吸附剂中，利用吸附剂对料液（或气体）中某一组分具有选择吸附的能力，使该祖坟富集在吸附剂表面，然后再用适当的洗脱机将吸附的组分从吸附剂上解吸下来的一种分离技术 吸附剂类型：（1）物理吸附（范德华力）（2）化学吸附（电子转移）（3）交换吸附（离子交换） 常用的吸附剂：一类有机吸附剂，如活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、聚酰胺等；另一类是无机吸附剂，如氧化铝、硅胶、人造沸石、磷酸钙‘氢氧化铝等。 活性炭吸附规律：对具有极性基团的化合物吸附力较大；对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对相对分子质量大的化合物的吸
附力大于相对分子质量小的化合物。 影响吸附的因素：吸附剂的性质；吸附物的性质；吸附条件（温度、PH、盐的浓度）、溶剂的影响。 3.膜分离技术 概念：指物质在推动力作用下由于传递速度不同而得到分离的过程。特点：易于操作；成本低、寿命长；高效；常温下操作无相态的变化，分离精度高，没有二次污染；膜材质的价格高；操作过程中膜面容易被污染；膜的耐药性，耐溶性，耐热性能有限。 类型：渗析；电渗析；微滤；超滤；反渗透；纳滤；气体分离 微孔滤膜清洗和再生方法：将滤膜平放于清洁盛器内，用60℃左右的蒸馏水浸泡，使全部湿润，数小时候（约4小时以）倾去水，再用上法浸泡12小时，使用前再用适量温蒸馏水清洗一次。 微孔滤过膜截留粒子的范围：0.1—10μm的粒子。 4.液膜分离技术 概念：是一种以液膜为分离介质，以浓度差为推动力的分离操作，是属于液—液系统的传质分离过程。 组成：膜溶剂；表面活性剂；流动载体；膜增强剂。 分类：乳状液膜；支撑液膜。 液膜分离步骤：制备液膜；液膜萃取；澄清分离；破乳。 影响因素：液膜乳液成分的影响；乳水比；连续的PH；搅拌速度的影响；料液的浓度和酸度的影响；操作温度的影响；接触时间。应用：分离氨基酸；提取抗生素；提取生物碱；提取蛋白质；分离
生物分离与纯化技术模拟试卷三答案
生物分离与纯化技术模拟试卷三答案 一、名词解释（每小题3分，共15分） 1．CM-Sephadex C-50：羧甲基纤维素、弱酸性阳离子交换剂，吸水量为每克干胶吸水五克。 2．絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程 3．离心过滤：使悬浮液在离心力场作用下产生的离心力压力，作用在过滤介质上，使液体通过过滤介质成为滤液，而固体颗粒被截留在过滤介质表面，从而实现固液分离，是离心与过滤单元操作的集成，分离效率更高 4．膜分离：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。 5．层析分离：是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。 二、单选题（每小题1分，共15分） 1．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（ B ）。 A．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 2．下列哪项酶的特性对利用酶作为亲和层析固定相的分析工具是必需的？（ B ） A.该酶的活力高 B.对底物有高度特异亲合性 C.酶能被抑制剂抑制 D.最适温度高 E.酶具有多个亚基 3．盐析法沉淀蛋白质的原理是（ B ） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 4．凝胶色谱分离的依据是（B）。 A、固定相对各物质的吸附力不同 B、各物质分子大小不同 C、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 D、各物质与专一分子的亲和力不同 5．如果要将复杂原料中分子量大于5000的物质与5000分子量以下的物质分开选用（D）。 A、Sephadex G-200 B、Sephadex G-150 C、Sephadex G-100 D、Sephadex G-50 6．工业上强酸型和强碱型离子交换树脂在使用时为了减少酸碱用量且避免设备腐蚀，一般先将其转变为（B）。 A、钠型和磺酸型 B、钠型和氯型 C、铵型和磺酸型 D、铵型和氯型 7．下面哪一种是根据酶分子专一性结合的纯化方法（ A ）。 A. 亲和层析 B. 凝胶层析 C. 离子交换层析 D. 盐析 8．以下哪项不是在重力场中，颗粒在静止的流体中降落时受到的力（ B ） A.重力 B. 压力 C.浮力 D. 阻力 9．关于用氢键形成来判断各类溶剂互溶规律，下列（A）项是正确的叙述。 A、氢键形成是能量释放的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。 B、氢键形成是能量吸收的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。 C、氢键形成是能量释放的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。 D、氢键形成是能量吸收的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。 10．关于萃取下列说法正确的是（C） A. 酸性物质在酸性条件下萃取 B碱性物质在碱性条件下萃取 C. 两性电解质在等电点时进行提取 D. 两性电解质偏离等电点时进行提取 11．下列关于固相析出说法正确的是（B） A.沉淀和晶体会同时生成 B析出速度慢产生的是结晶 C.和析出速度无关 D.析出速度慢产生的是沉淀 12．那一种膜孔径最小（C） A.微滤 B超滤 C.反渗透 D. 纳米过滤 13．酚型离子交换树脂则应在（B ）的溶液中才能进行反应 A. pH＞7 B pH＞9 C. pH﹤9 D. pH﹤7 14．一般来说，可使用正相色谱分离（B） A. 酚 B带电离子 C. 醇 D. 有机酸 15．离子交换层析的上样时，上样量一般为柱床体积的（C）为宜。 A. 2％-5％ B1％-2％ C. 1％-5％ D. 3％-7％ 三、判断题（每小题1分，共10分） 1．珠磨法中适当地增加研磨剂的装量可提高细胞破碎率。（×） 2．进料的温度和pH会影响膜的寿命。（√） 3．应用有机溶剂提取生化成分时，一般在较高温度下进行。（×） 4．溶剂的极性从小到大为丙醇＞乙醇＞水＞乙酸。（√） 5．蛋白质为两性电解质，改变pH可改变其荷电性质，pH﹤pI蛋白质带正电。（√） 6．进行水的超净化处理、汽油超净、电子工业超净、注射液的无菌检查、饮用水的细菌检查使用孔径为0.2μm的膜。（×） 7．只有树脂对被交换离子比原结合在树脂上的离子具有更高的选择性时，静态离子交换操作才有可能获得较好的效果。（√） 8．制备型HPLC对仪器的要求不像分析型HPLC那样苛刻。（√） 9．Sephadex LH-20的分离原理主要是分子筛和正相分配色谱。（√） 10．水蒸气蒸馏法是提取挥发油最常用的方法。（√） 四、填空题（每小题1分，共15分） 1．常用的蛋白质沉析方法有（等电点沉淀），（盐析）和（有机溶剂沉淀）。 2．蛋白质分离常用的色谱法有（凝胶色谱法），（多糖基离子交换色谱法），（高效液相色谱法）和（亲和色谱法）。 3．离子交换树脂由（载体），（活性基团）和（可交换离子）组成。 4．膜分离过程中所使用的膜，依据其膜特性（孔径）不同可分为（微滤膜），（超滤膜），（纳滤膜）和（反渗透膜）。 五、简答题（每小题7分，共35分） 1．在色谱操作过程中为什么要进行平衡？ 答：1、流速平衡：流速是柱层析操作当中的主要影响因素，流速的快慢直接影响着分离的效果，流速过快，混合物得不到完全的分离，流速过慢，整体分离的时间要延长，因此在分离前首先要确定留宿。 2、液体环境：为了保持被分离物质运动的均一性，以及好的吸附和解析效果，因此要保持孔隙内部和外部液体环境的一致，所以进行液体环境的平衡。
【CN110172451A】一种高通量分离噬菌体的方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910366992.2 (22)申请日 2019.05.05 (71)申请人 昆明理工大学 地址 650093 云南省昆明市五华区学府路 253号 (72)发明人 邓先余 邓征宇 韩煜 张棋麟 林连兵 (51)Int.Cl. C12N 7/00(2006.01) C12R 1/92(2006.01) (54)发明名称 一种高通量分离噬菌体的方法 (57)摘要 发明公开了一种高通量分离噬菌体的方法， 该方法通过根据实际需要选择宿主菌或从环境 中分离宿主菌，将宿主菌置于液体生长培养基中 富集培养至对数生长期，获得宿主菌富集液，然 后采用考马斯亮蓝法通过检测蛋白含量变化在 96孔板中分离噬菌体；实验证明本发明方法能够 高效的分离检测各种环境如污泥和污水中对应 宿主菌的噬菌体，分离效率高且能对噬菌体的裂 解效果做评估；本方法具有操作简便、快速及价 格低廉等优点，因此，该方法将加速从环境中分 离新的噬菌体的速度，为噬菌体的应用提供帮 助。权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 110172451 A 2019.08.27 C N 110172451 A
权 利 要 求 书1/1页CN 110172451 A 1.一种高通量分离噬菌体的方法，其特征在于步骤如下： （1）根据实际需要选择宿主菌或从环境中分离宿主菌，将宿主菌置于液体生长培养基中富集培养至对数生长期，获得宿主菌富集液； （2）采用96孔板分离噬菌体 ①从环境中取样作为待测样品，若是固体，按1g添加5～20mL无菌水的比例，将固体放置于无菌水中混匀，离心，取上清液待用；若是液体样品，则直接离心，吸取上清液待用，上清液为待测样品液； ②将96孔板高压灭菌后冷却至常温； ③以500～600μL/孔的量，在96孔板中加入宿主菌富集液；以200～400μL/孔的量，在96孔板中加入待测样品液，作为实验组；同时设置对照组，对照组中添加与待测样品液等量的无菌水，混匀后培养12～15h； ④按每孔吸取500～600μL的量，从实验组和对照组中吸取培养后液体，离心收集上清液，按考马斯亮蓝使用说明，将上清液、考马斯亮蓝和无菌水按比例混合均匀后，在595nm下测量OD值； ⑤吸取相比于对照组OD值上升0.1～1的实验组液体，离心收集上清液，上清液使用 0.22μm滤膜过滤，获得对应宿主菌的噬菌体液。 2.根据权利要求1所述的高通量分离噬菌体的方法，其特征在于：离心是在4℃、8000～9000g下处理5～10min。 3.根据权利要求1所述的高通量分离噬菌体的方法，其特征在于：噬菌体的宿主菌为志贺氏菌属、沙门氏菌属、大肠杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、巴氏杆菌属中的一种或多种细菌菌株。 2