苏云金芽孢杆菌的研究——综述

苏云金芽孢杆菌的研究

摘要苏云金芽孢杆菌是目前应用最广泛、研究最深入、生产量最大的微生物杀虫剂。目前已发现多种Bt亚种或血清型对害虫具有杀虫活性,同时也发现了一些新的杀虫晶体蛋白，通过纯化得到高效的杀虫晶体蛋白也是目前研究热点之一。本文简要介绍了Bt的发展历史、晶体蛋白的纯化及在杀虫方面的一些应用。

关键词苏云金芽孢杆菌、历史、伴孢晶体、杀虫

苏云金杆菌(Bacillu .thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，为昆虫病原细菌，其菌体为短杆状、有鞭毛，一般单生或形成短链。在芽孢形成期可产生具有杀虫活性的伴孢晶体,且伴孢晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有毒杀活性[15]。苏云金杆菌是一种应用广泛的绿色环保型微生物杀虫剂，全世界年产值已突破1亿美元[1]。自20世纪60年代实现工业化生产以来,已成为世界上用途最广、商业开发最成功、产量最大的微生物杀虫剂,每年以20%的速度增长[2,3]。苏云金杆菌杀虫剂的稳定性较差、残效期短、杀虫速度慢等问题都待解决，关于苏云金芽孢杆菌的研究都将继续进行。

1Bt的发展历史

1901年，日本学者石渡繁胤(Ishiwata)从虫尸体液中分离出苏云金杆菌猝倒变种(Bacillus.thuringiensis var.sott) 成为苏云金杆菌研究的起点[4]。1911年，Berliner 发现一杆菌，并详细描述了该菌的形态和培养特征，定名为苏云金杆菌(Bacil-lus.thuringiensis)，指明苏云金杆菌含伴孢晶体(Paraspora crystl) 。

1938年，苏云金杆菌商品化，用于防治地中海粉螟。20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。从发现该菌至今已有整整105年历史,世界上有超过万篇的研究报道,涉及生物学、分类命名、有效成分、杀虫机理、分子生物学、遗传学、产品化和安全性,包括近年来的转基因植物等诸多方面[5]。

1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并和Fitz-James于1955年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。1981年，Schnept和Whiteley 首次将HD21菌株伴孢晶体的基因克隆到大肠杆菌中，并得到表达。用血清学技术进行Bt的鉴定和分类始于20世纪60年代。

我国对苏云金芽孢杆菌的研究和应用起步较晚，但发展迅速，据统计，在在70年代，我国苏云金杆菌制剂年产量大1000吨以上，并且部分产品用于出口。

1992年联合国“世界环境和发展大会”在巴西的召开促进了全球生物防治的发展，推进了苏云金杆菌制剂产业化进程。世界上许多科学家致力于Bt的研究，并作出卓越贡献，时至今日，Bt在农药上所占的比例仍处于劣势，许多问题依然有待解决。

2 苏云金芽胞杆菌的伴孢晶体的纯化方法

2.1等密度梯度离心法

等密度梯度离心法是利用密度的差异将伴孢晶体与杂质分离,获得纯品的方

法。常用的密度试剂有蔗糖[6]、碘化密度梯度介质(Renografin、Metrizamide、泛影葡胺)[7]、人工聚合蔗糖(Ficoll)、碱金属盐(CsCl、NaBr)、硅溶胶(Ludox)[8]等。其中蔗糖密度梯度离心方法简单,成本较低,但蔗糖溶解在水中的密度为 1.3,分离孢晶混合物(平均密度为1.31)时不理想。碘化密度梯度介质渗透压低,不易破坏分离物。溴化钠作为一种理想的梯度介质得到了广泛的应用,其价廉、粘度低,且有足够大的密度。等密度梯度离心法获得的伴孢晶体纯度较高,缺点是产量较低、试剂及实验条件要求比较严格。

2.2离子交换分离法

离子交换分离法是利用离子交换树脂上的可交换离子发生的变换反应进行分离和纯化[9]。该方法设备简单、操作方便、分离速率快且效率高,广泛应用于化工、医药、食品、造纸和冶金等领域。离子交换反应是可逆平衡反应,为使反应不断地朝反应正方向进行,需采取不断分离产物的操作,通过借助离子交换柱进行动态离子交换来达到这个目的。由于酶和蛋白质都有电解质性质,可用离子交换法进行分离提纯。吴洪福[10]等通过Resource Q进行阴离子交换层析纯化Cry8Ca2蛋白；韩岚岚等[11]通过HiTrap Q柱层析分离纯化Bt Cry毒素及原毒素蛋白;Bietlot 等[12]用40%(质量体积比)的硫酸铵沉淀,再对缓冲溶液透析后分离纯化毒素蛋白。

2.3液体双相分离法

液体双相分离法利用互不相溶的两种液体对晶体和芽孢的亲和性不同(即晶体、芽孢表面特性不同)而达到分离目的。该方法具仪器简单、试剂便宜、产量高的优点，但纯度较低，操作复杂。常用的有三种液体双相体系,一是聚合物-聚合物双相体系,如聚乙二醇(PEG)-葡萄糖-水、聚乙二醇-硫酸葡聚糖钠和聚丙烯酰胺-葡聚糖钠;二是聚合物-盐体系,如聚乙二醇-磷酸盐-水;三是盐水与有机溶剂组成的液体双相体系，如三氟三氯乙烷-硫酸钠、氯仿-水等。

2.4 等电点沉淀法

由于氨基酸存在三种形式即带正电荷、带负电荷、两性离子，在等电点时氨基酸溶解度最低，利用此特点制备伴孢晶体纯品，操作简单、制备量大且工作量小。

2.5 碱裂解法

苏云金芽孢杆菌产生的伴孢晶体为由cry基因和cyt基因所编码的碱溶性蛋白,在pH值高于9.5时,大多数的cry毒素和cyt毒素溶解,少数pH值为12时完全溶解。碱裂解法是选用pH值9.6的碳酸钠缓冲溶液使大多数的蛋白质从菌体中溶出得到伴孢晶体纯品[16]。

2.6高速离心法

高速离心法是利用惯性离心力和物质的沉降系数或密度的不同而进行分离提纯的。该方法适用于固体颗粒很小、液体粘度很大及难于过滤的悬浮液,也适于那些忌用助滤剂或助滤剂使用无效的悬浮液的分离[13]。该方法具制备时间缩短、试剂便宜的优点,且得到的伴孢晶体纯度可达99%以上,是大规模生产中应用最广泛的方法[14]。

3苏云金芽孢杆菌在杀虫的应用

苏云金芽胞杆菌作为一种生物农药，广泛应用于杀害虫。其杀虫机理主要是杀虫晶体蛋白的杀虫作用过程要经过溶解、酶解活化、与受体结合、插入以及孔洞或离子通道的形成等五个环节。当被敏感昆虫吞噬后，在昆虫中肠碱性环境条件下溶解释放出原毒素，原毒素又在中场蛋白酶的作用下被激活为毒素，然后与中肠上皮细胞刷状缘膜的受体结合，迅速不可逆地插入到细胞膜中，形成孔洞或离子通道，引起离子渗透，导致细胞膨胀解体。扰乱中肠内正常的跨膜电势及酸碱平衡，导致上皮细胞退化，内脏机能麻痹，进食停止，最终害虫因饥饿和(或)败血而。苏云金芽孢杆菌对鳞翅目害虫也有较大的效用，黄素芳[17]等该实验室筛选出对小菜蛾、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫具有高效毒力的Bt LSZ9408菌株；吴洪生[20]等利用Bt S387菌株防治水稻一代二化螟具有较好的效果；王爽[21]研究表明Bt20菌株对MbNPV具有增效作用；等同时Bt在防治线虫方面有重要作用，1972年Prasad等报道了B.t.外毒素对根结线虫的卵和幼虫有较高毒力活性[18]；Bottjer等报道，苏云金芽孢杆菌以色列亚种(B.t.subsp.Israelensis)和库斯塔克亚种(B.t.subsp.Kurstaki)伴胞晶体能杀死蛇形毛圆线虫的虫卵和幼虫[19]。苏云金芽胞杆菌也是一种重要的生物杀蚊制剂，目前已发现多种亚种或血清型具有灭蚊活性,如Canadensisi亚种、Morrisoni亚种、Darmstadiensis亚种、Thompsoni亚种和Jegathesan亚种等[22,23]。

4苏云金芽孢杆菌（Bt）的应用前景

我国是一个农业大国，农业的发展事关重大。为了更好地落实科学发展观，建立环保型、节约型农业，微生物农药将为农产品优质安全生产和降低有毒物质残留提供技术和物质保证[24]。但苏云金杆菌还存在一些问题需要进一步完善，首先Bt毒蛋白的基因抗虫谱较窄；其次当转基因抗虫植物在大田广泛应用时，昆虫易对杀虫结晶蛋白产生耐受力，失去毒杀作用；第三Bt毒蛋白基因在植物体内表达的水平和稳定性有问题。这些问题都是未来研究者的重要方向[25]。

参考文献：

[1] 杨开杰. 生物农药苏云金芽孢杆菌的优化培养研究[J].科技创新导报，

2008,10:248-249.

[2] 朱仕房,杨曜中.双水相体系分离苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究[J].世界农药,2000,22(5):39-42.

[3] 喻子牛,柯云,刘子铎,等.微生物农药在病虫害可持续控制中的应用及发展策略[M].北京:科技出版社,2000:11-20.

[4] 荣一兵.苏云金杆菌研究的历史和现状.黄石高等专科学校学报,2000,16 (3):33~35

[5] 关雄.苏云金芽孢杆菌研究回顾与展望. 中国农业科技导报, 2006, 8(6): 5~11

[6] Thomas W E,Ellar D J.Bacillus thuringiensis var israelensis crystalδ-endotoxin[J].J Cell Sci,1983,60:181-197.

[7] 王瑛,白成,温洁,等.苏云金杆菌晶体与芽孢分离的研究[J].微生物学报,1980,20(3):285-288.

[8] 李启隆.电分析化学[M].北京:北京师范大学出版社,1995:222.

[9]Clairmont F R,Milne R E,Pham V T.Role of DNA in the acti-vation of the Cry1A insecticidal crystal protein from Bacillus thuringiensis[J].The Journal of Biochemistry,1998,273(15):9292-9296.

[10] 吴洪福，张艳彩等.苏云金芽孢杆菌Cry8Ca2蛋白的纯化与活性的研究[J].植物保护，2007，33(4):29-32.

[11] 韩岚岚,宋福平,李长友,等.苏云金芽孢杆菌cry基因在大肠杆菌中表达产物和生物活性[J].植物保护,2002,28(5):5-9.

[12] Bietlot H,Carey P R,Choma C,etal.Facile preparation and characterization of the toxin from Bacillus-thuringiensis var.kurstaki[J].Biochemistry J,1989,260(1):87-91. [13] 弓爱君,孙翠霞,邱丽娜.Bt生物农药[M].北京:化学工业出版社,2006:106-107.

[14]周学永,金红,杨志生,等.苏云金芽孢杆菌发酵液后处理工艺研究进展[J].化学与生物工程,2006,23(1):4-6.

[15]Wight A P,Davis M E.Design and preparation of organic-inorgan-ic hybrid catalysts[J].Chem Rev,2002,102(10):3589-3614.

[16]蒋辰等.苏云金芽孢杆菌伴孢晶体纯化方法研究[J].化学与生物工程,2008,25(6):10-12.

[17] 黄素芳等 .苏云金芽孢杆菌LSZ9408伴孢晶体的形态特征研究[J].武夷科学，2006，22（12）：32-40.

[18]PRASAD S S V,TILAK KV B R,GOLLAKOTA K G.Role ofBacillusthuringiensisvat.thuringiensisontheLarvalSurviv-ability and Egg Hatching ofMeloidogyne spp.,the Causative Agent of Root-knot Disease[J].Journal of Invertebrate Pathology,1972,20:377-378.

[19] BOTTJER K P,BONE L W,GILL S S.Nematoda:Susceptibil-ity of the Egg to Bacillus thuringiensis Toxins[J].Experi-mental Parasitology,1985,60:239-244.

[20] 吴洪生等.苏云金杆菌S387防治水稻一代二化螟试验研究[J].河南农业大学学报,2001,35(9):103-104.

[21]王爽等.苏云金杆菌对甘蓝夜蛾核型多角体病毒增效作用的研究[J].东北农业大学学报,2008,39(6):40-42.

[22]张灵玲等.苏云金芽孢杆菌杀蚊机制研究概况[J].中国媒介生物学及控制

杂志，2008，19(4):377-378.

[23] 赵新民等.杀蚊苏云金芽孢杆菌及其晶体蛋白研究进展[J].昆虫知识，2007，44(3):336-342.

[24] 曹正明.苏云金芽孢杆菌与现代生物农药[J].现代农业科技,2008,20:140,142.

[25]高贵珍.苏云金杆菌杀虫剂研究概况[J].淮南师范学院学报,2003,19(3):38-40.

[26] 刘石泉.苏云金芽孢杆菌高效价杀虫剂的研究进展[J].微生物学通报，

2008，35(7):1091-1095.

[27] 张灵玲等.苏云金芽孢杆菌杀蚊新菌株LLP29对白纹伊蚊作用机理的研究

[J].寄生虫与医学昆虫学报,2007,14(1):16-20.

[28] 李梅云等.苏云金杆菌伴孢晶体形态特征观察[J].烟草科技/病虫害防治,2004,208(11):43-45.

[29]邵宗泽等.苏云金芽孢杆菌工程菌伴孢晶体的形态发生[J].微生物学报,2002,42(5):555-559.

[30] 易建荣等.苏云金杆菌悬浮剂杀灭白纹伊蚊不同龄期幼虫实验及其影响因素分析[J].中华杀虫卫生药械,2003,9(2)：15-18.