手性医药化学品生物催化合成进展与实践_郑裕国

第11卷第2期2013年3月生物加工过程

Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol．11No．2Mar．2013

doi ：10．3969/j．issn．1672－3678．2013．02．004

收稿日期：2013－01－04

基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）（2012AA022201）

作者简介：郑裕国（1961—），男，教授，浙江象山人，研究方向：生物催化与生物转化，

E-mail ：zhengyg@zjut．edu．cn 手性医药化学品生物催化合成进展与实践

郑裕国，沈寅初

（浙江工业大学生物工程研究所生物转化与生物净化教育部工程研究中心，杭州310014）

摘要：手性生物催化是利用生物催化剂对手性分子构型的识别能力进行选择性催化的新型物质加工过程，具有

催化效率高、

选择性强和反应条件温和等优势。近十年来，生物催化技术快速崛起，树立了多个大品种原料药过程替代的成功范例，成为手性医药化学品绿色制造不可或缺的重要工具。笔者分析了生物催化商业和学术发展的新动向，并结合笔者在手性药物生物催化合成的产业化开发实践，指出了今后的发展方向。关键词：手性药物；生物催化；酶工程；绿色制药中图分类号：TQ46

文献标志码：A

文章编号：1672－3678（2013）02－0024－06

Biocatalysis and green process for chiral pharmaceutical chemicals

ZHENG Yuguo ，SHEN Yinchu

（Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification of the Ministry of Education ，Institute of Bioengineering ，Zhejiang University of Technology ，Hangzhou 310014，China ）

Abstract ：Enantioselective biocatalysis is a modern material processing technology based on the recognition capability of biocatalyst to chiral molecular configuration ，it had major advantages of high efficiency ，high selectivity and ambient reaction conditions．In the last 10years ，rapid advances in large-scale DNA sequencing and enzyme directed evolution rendered biocatalysis as necessary synthetic tool in green pharmaceutical process．Several successful examples were given and a biocatalytic process was developed to replace existing chemical routes for blockbuster drugs．Advances in synthesis of chiral pharmaceutical chemicals by biocatalysis were analyzed combined with research experiences in recent years and development directions of the area were pointed out．

Key words ：chiral drugs ；biocatalysis ；enzyme engineering ；green pharmaceutical process 随着酶催化工艺在辉瑞、默克等多个国际制药

巨头全球畅销药物工业制造中的应用，生物催化技术在制药工业中的显示效应不断扩大，尤其在过程替代、实现更绿色的制药工艺中发挥了重要作用，多次荣获美国总统绿色化学挑战奖，重要地位获得

广泛认可。与十年前相比，

生物催化领域出现了2个重要转变：①生物催化不再是化学家和过程工程

师无计可施之后的最后选择，而成为他们主动选择、不可或缺的工具；②生物催化应用模式由基于品种有限的生物催化剂设计合成路线转向基于低成本、低能耗和高产出的过程需求来设计理想的生物催化剂。

从各酶制剂及医药制造企业的发展中可明显窥见生物催化融入制药工业且日益受到重视的路径［1］。成立于2002年的代表性生物催化创新性公司Codexis，其2011年酶制剂及相关产品的销售额达到4900万美元，采购商绝大部分为医药和精细化学品制造企业。另据Codexis的统计，其合作企业，如Ampac Fine Chemical、Dishman Pharmaceutical ＆Chemicals、Lonza和DSM等共生产10t Codexis自主研发的酶用于医药中间体的制造。另外一些知名的医药化学品供应商如BASF、Kaneka、Almac Sciences、Novasep和Fabbrica Italiana Sintetici等纷纷成立了生物催化研发部门。同时，生物催化蕴含的商机催生了相关企业合并重组和创新企业涌现。如Cambrex收购IEP，PACS收购Protéus，Johnson Matthey收购X-zyme，Codexis则合并了Jülich Fine Chemicals、Enizis和BioCatalysis。

生物催化技术的不断崛起是与以下三方面因素密不可分的。第一，手性是药物安全性和药效的关键因素，生物催化是获得手性药物和中间体最有前景的手段之一［2］。目前，国际上正在开发的1200种药物中，有820种属于手性药物，手性药物的比例今后将进一步上升至80%左右。单一对映体药物的生产在制药工业中占有越来越重要的地位。生物催化是利用生物催化剂对手性分子构型的天然识别能力进行选择性催化的物质加工过程，在手性合成中具有独特优势。第二，生物催化本身迎来革命性技术变革，技术体系日臻完善，开发和使用成本显著降低。如从几何级数增长的基因序列中快速发现工业酶工具包技术、强大的定向进化和高通量筛选技术、酶高效表达技术。这些技术使酶催化剂的功能改善和低制备成本成为可能。尽管工业生物催化的许多方面还依赖于经验，通过酶活性指纹图谱等技术，许多类型酶的功能已经相对可预测。第三，绿色化学呼唤新的物质加工模式。除立体选择性外，生物催化还具有优异的化学和区域选择性，反应条件温和，避免传统合成中的异构化、消旋化和重排等副反应，减少有害重金属、过度金属催化剂和作为反应介质和分离纯化产物时有机溶剂的使用［3］，从而显著提高原子经济性，减低过程的环境因子（E factor）［4］。

1生物催化在手性医药化学品绿色制造中应用的历史与现状

生物催化在手性医药化学品生产中应用最具规模化、技术体系最为完整的例子当属β内酰胺类抗生素的合成。荷兰DSM公司在该领域做了大量工作，形成了系统的化学、生物催化与一体化技术［5］。首先是3个母核6氨基青霉烷酸（6 APA）、7氨基头孢烷酸（7ACA）、7氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7ADCA）的酶法制备，涉及青霉素G酰化酶、D氨基酸氧化酶和戊二酰基酰化酶等。以年产量超过10000t的6APA为例，传统化学水解法需使用三甲基氯硅烷（TMSCl）将青霉素G保护，进一步与PCl5反应生成氯代亚胺，再经水解得到6APA（图1）。该工艺在40?下进行，且使用危险化学品PCl5和CH2Cl2、n-BuOH等有机溶剂，每生产1kg产品，产生10 100kg废物。该工艺直到20世纪90年代酶法工艺发展后才被替代，废物减少5倍［6］。β内酰胺类抗生素的侧链如D（对羟基）苯甘氨酸也实现了酶法生产，根据路线不同，涉及腈转化酶、海因酶、脂肪酶等。最后，母核与侧链的链接也是由青霉素酰化酶实现的

。

（i）TMSCl then PCl5，PhNMe2，CH2Cl2，－40?；

（ii）n-BuOH，－40?，then H2O，0?；

（iii）Pen-acylase，H2O，37?

图1青霉素G的化学和酶法脱乙酰化

Fig．1Deacetylation of penicillin G by chemical

and enzymatic methods

近年来，国际上涌现了大量生物催化技术改造畅销处方药合成工艺的范例（表1），进一步显示了该技术在绿色制药中的潜力。如2012年度美国总统绿色化学挑战奖更绿色合成路线奖授予Codexis 公司开发的酰基转移酶法合成辛伐他汀（Simvastatin）路线［7］。辛伐他汀是以洛伐他汀（Lovastatin）为底物，在洛伐他汀侧链碳2位置增加1个甲基。在传统合成工艺中，先将洛伐他汀水解为莫纳考林J（Monacolin J），进一步通过内酯化、三

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第2期郑裕国等：手性医药化学品生物催化合成进展与实践

甲基硅烷化保护C11和C13位羟基。保护的莫纳考林J经α二甲基丁酰氯酰化后生成保护的辛伐他汀，再经去保护得到辛伐他汀。该工艺理论产量少于70%，还需使用大量有毒有害的试剂［8］。美国加州大学洛杉矶分校的Yi Tang教授团队发明了以克隆自洛伐他汀生物合成基因簇的酰基转移酶LovD为催化剂的辛伐他汀半合成新工艺［8］。改进后的工艺首先水解洛伐他汀成水溶性的莫纳考林J 铵盐，在LovD催化下与酰基供体α二甲基丁酰S甲基巯丙酸酯（DMB S MMP）反应生成不溶于水的辛伐他汀铵盐。莫纳考林J质量浓度为75g/L 时，辛伐他汀铵盐的产率超过97%，显示了新工艺巨大的优越性。辛伐他汀化学和酶法合成工艺比较如图2所示。

表1生物催化技术用于生产部分重大疾病治疗药物Table1Biocatalytic production of major diseases drugs

公司商品名通用名

（API）

2011年

销售额/亿元

生物催化剂

Pfizer Lipitor atorvastatin￥95.77Ketoreductase，halohydrin dehalogenase

Pfizer Lyrica pregabalin￥36.93Lipase Merck＆Co．Inc Singulair montelukast￥54.79Ketoreductase Merck＆Co．Inc Januvia sitagliptin￥33.24Transaminase Merck＆Co．Inc Zocor simvastatin￥ 4.56Acyltransferase Merck＆Co．Inc Victrelis Boceprevir￥ 1.40Amine oxidase Merck＆Co．Inc Crixivan indinavir￥ 1.92Toluene dioxygenase Merck＆Co．Inc Emend Aprepitant￥ 4.19Alcohol dehydrogenase GlaxoSmithKline Paxil paroxetine? 4.35Protease

图2辛伐他汀化学和酶法合成工艺比较

Fig．2Comparison of simvastatin synthesis process by chemical and enzymatic methods

2生物催化合成手性医药化学品产业化开发实践

笔者研究团队依托浙江高端原料药制造的产业优势，在国内较早开展了生物催化合成手性医药化学品的基础和应用研究，在C—N裂解酶、腈转化酶、氧化还原酶、脱卤酶和脂肪酶等手性催化方面做了一些工作。

62生物加工过程第11卷

2．1高纯度井冈霉素生物催化合成井冈霉醇胺井冈霉素是我国自主发明并大规模生产的第一个农用抗生素，一直是防治水稻纹枯病的首选品种。其有效组分A经多步水解、C—N裂解后的产物井冈霉醇胺是新一代酶制剂类糖尿病治疗药物的关键中间体。笔者研究团队筛选获得高效催化裂解井冈霉素生产井冈霉醇胺的微生物新菌株。井冈霉素A先在糖苷酶的作用下，水解为井冈羟胺和葡萄糖，井冈羟胺经过葡萄糖3酮脱氢酶脱氢后，再通过C—N键裂解酶的定向裂解，得到井冈霉烯胺。井冈霉烯胺进一步经化学合成，得到井冈霉醇胺［9－10］（图3）。研究了高纯度井冈霉素裂解产物分离方法，缩短了工艺流程，解决了分离难题，产品收率从31%提高到76%以上。建立了从井冈霉素到井冈霉醇胺的生物催化水解裂解产业化技术。

图3生物催化裂解井冈霉素A合成井冈霉醇胺

Fig．3Production of valienamide from validemycin A by microbial hydrolysis and lysis

2．2腈水合酶/酰胺酶双酶耦联制备（S）（+）2，

2二甲基环丙烷甲酰胺

西司他丁钠是高效的肾脱氢二肽酶I抑制剂，与

亚胺培南的复配是目前抗重症感染的首选药物，市场

需求广阔。（S）（+）2，2二甲基环丙烷甲酰胺是西

司他丁钠的关键手性中间体，占其原料成本的1/3以上，掌握（S）（+）2，2二甲基环丙烷甲酰胺高效合成技术对控制西司他丁钠的成本具有重要意义。

目前工业上应用的化学合成工艺反应步骤多，条件苛刻，收率低（不超过10%），且过程使用大量有毒有害溶剂，环境污染严重，原子经济性低。笔者所在实验室以2，2二甲基环丙腈为底物，开发了腈水合酶/酰胺酶双酶耦联（S）（+）2，2二甲基环丙烷甲酰胺合成新工艺（图4）［11－12］。该工艺的批次转化率达到47%以上，产物e．e．值大于99%；考虑副产物回收后，综合收率达到72%以上。而且，通过工艺创新，从源头上革除了有毒有害溶剂的使用，三废排放量大大减少。

2．3脂肪酶/酯酶催化合成普瑞巴林手性中间体普瑞巴林（商品名乐瑞卡（Lyrica））首次上市被美国FDA批准用于带状疱疹后神经痛、糖尿病外周

图4双酶耦联法制备（S）（+）2，2二甲基

环丙烷甲酰胺

Fig．4Nitrile hydratase/amidase coupled synthesis of （s）-（+）-2，2，-dimethylcyclopropa necarboxamide

神经痛、癫痫、纤维肌痛等。国际疼痛学会（IASP）、欧洲神经病理学会联盟（EFNS）和英国国立卫生与临床研究所（NICE）等多个国际权威指南共同推荐普瑞巴林为一线治疗药物。辉瑞公司开发的以外消旋2羧乙基3氰基5甲基己酸乙酯（CNDE）为底物，经脂肪酶立体选择性水解，再经原位回流脱羧、碱性水解、加氢还原制得普瑞巴林（图5）的化学酶法工艺是目前最为先进的普瑞巴林合成工艺。但其所用生物拆分用酶为来源于Novozymes公司的商品化脂肪酶Lipolase（TLL，来源Thermomyces lanuginosus），已申请相关专利保护。

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第2期郑裕国等：手性医药化学品生物催化合成进展与实践

图5

化学酶法合成普瑞巴林

Fig．5

Chemo-enzymatic synthesis of Pregabalin

笔者课题组经前期大量筛选，从土壤中分离得到一株能够高立体选择性水解CNDE 生成（S ）2羧乙基3氰基5甲基己酸的酯酶产生菌Morgarella morganii ZJB 09203［13］。通过向反应体系中添加强阴离子树脂，可显著解除产物抑制现象，产物浓度达到0.45mol /L ，对映体过量值（e．e．值）＞98%，对映体选择率E 值达到92。同时又从Thermomyces lanuginosus DSM 10635中克隆到不同于TLL 的嗜热脂肪酶LIP ，

也可S 型选择性水解CNDE ，e．e．值＞99%，经多轮饱和突变，突变体S88T /A99N /V116D 的活力比野生型提高58倍［14］。2．4

阿托伐他汀侧链生物催化合成

他汀类药物能有效抑制胆固醇合成、显著降低

心脑血管疾病的发生，

已成为动脉粥样硬化疾病治疗的基础药物。他汀类药物的销售额高达全球医

药市场总销售额的5.5%，

在国际医药市场上畅销的各类降血脂药物中居于领先地位。在可以预见

的将来，

他汀类降脂药仍将是国际医药市场上的重磅炸弹。

6氰基（3R ，5R ）二羟基3，5O 亚异丙基己酸叔丁酯（TBIN ）为各种他汀类药物的关键中间体，广泛用于各种他汀类药物的合成，全球年需求量超过1000t 。阿托伐他汀合成对TBIN 光学纯度

要求极高，对映体过量值和非对映体过量值（d．e．值）分别超过99.5%和99%。因此，高光学纯度TBIN 的高效制备技术一直是他汀类药物产业的重要核心技术。国内采用的TBIN 化学合成技术存在以下缺陷：需要使用硼烷、正丁基锂和低于－70?深冷条件，存在爆炸风险；非对映诱导不充分，产物d．e．值低；反应形成的硼化物废弃物处理需要经过繁琐的反复甲醇淬灭、真空蒸馏等。

笔者课题组开发了TBIN 酶化学组合合成路线（图6）。新工艺选择廉价的潜手性试剂4氯乙酰乙酸乙酯（ATS 3）为出发原料，经羰基还原酶不对称还原合成（S ）4氯3羟基丁酸乙酯（ATS 4）。ATS 4经卤醇脱卤酶催化得到（R ）4氰基3羟基丁酸乙酯（ATS 5），后者与乙酸叔丁酯发生取代反应，生成（R ）6氰基5羟基3羰基己酸叔丁酯（ATS 6）。300g /L ATS 6经R 羰基还原酶不对称还原2h ，底物转化率100%，产物6氰基（3R ，5R ）二羟基己酸叔丁酯（ATS 7）e．e．值＞99.5%，d．e．值＞99.0%。ATS 7经2，2二甲氧基丙烷保护制得光学纯TBIN （ATS 8）。该酶化学组合合成工艺彻底革除了硼烷、正丁基锂和深冷条件，产物光学纯度高，副产物、废料量、溶剂用量和能耗大幅度降低，具有显著的优越性

。

图6

酶化学法合成TBIN

Fig．6

Preparation of TBIN by chemo-enzymatic method

82生物加工过程第11卷

3结束语

从美国FDA药品数据库资料来看，2011 2014年将是药品专利到期的高峰期，涉及上百个药品的80件核心专利，2014年药品专利到期数量将达到巅峰，高达186件。这些专利到期药将释放巨大的市场空间。因此，开发绿色、高效的高端原料药生物催化工艺具有广阔的应用和市场前景。除了传统的水解酶类如脂肪酶、酯酶、蛋白酶、脱卤酶、酰化酶、酰胺酶、环氧化物水解酶等外，酶催化氧化、卤代、氨基转移、C—C键耦联、C—C双键还原将是今后的新方向。在手性医药化学品路线重构过程中，同时熟悉化学和生物学方法，善于从逆合成分析角度设计高效的化学生物催化级联工艺变得至关重要。此外，原料药中手性碳原子的增多，过程开发周期的缩短等也给生物催化提出了新的挑战。

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