Western基本步骤
Western基本步骤
Westen blot
一、配胶
（一）安装胶架
（二）配胶
1、分离胶：10%（10ML）
O 4 ml
DdH
2
30%Acr 3.3ml
Tris-Hcl(8.8) 2.5ml
10%SDS 0.1ml
10%过硫酸铵AP 0.1ml
TEMED O.OO4ML
2、积层胶: 4ml
O 2.7 ml
DdH
2
30%Acr 0.67ml
Tris-Hcl(6.8) 0.5ml
10%SDS 0.04ml
10%过硫酸铵AP 0.04ml
TEMED O.OO4ML
注意事项：1、TEMED催化AP产生自由基，加速Acr凝胶聚合，一般于4度存放。
不宜多加，否则胶易变硬脆裂。
2、TEMED易燃、腐蚀性、神经毒性，要注意防护。易挥发，使用后立
即盖紧瓶盖，佩戴PE手套。
3、每加完一样晃匀，TEMED最后加。
（三）灌胶
1、分离胶1ml枪吹打均匀，避免气泡，尽快灌入固定好的玻璃板中。
O，压平分离胶界面。待胶凝后可见分割折线。
2、分离胶上灌满ddH
2
O，分隔线先清楚后不清楚，待胶凝后又可见。
可用乙醇代替ddH
2
O，用滤纸吸干。
3、分离胶凝后，倒去顶部ddH
2
4、积层胶1ml枪吹打均匀，灌入玻璃板中至顶部。
5、插入梳子，注意梳子底部应无气泡。略倾斜插入梳子可避免出现气泡
6、20-30分钟后胶凝。
二、电泳
（一）准备
1、装上电泳装置，倒入1*电泳液。先倒内槽（新）没过短玻璃板，如内槽不漏液再加外槽，没过钢丝电极即可，内外槽不能相通。
2、拔出梳子（用力均匀缓慢拔出），用10vl枪点样。
（二）上样和电泳
1、10vl枪点样。（1.0胶最大上样量30vl，0.75胶最大上样量25vl）
2、样尽量点在中间孔位，空孔位用残样或5*buffer填补，避免边缘效应，使电流在胶板中均匀分布。
3、maker 3-3.5 vl。Maker一般-20℃保存，尽快上样尽快放入冰箱。
4、盖上电泳槽，接通电源。积层胶电压80V，分离胶160V。电
流28mA。（恒压80V待Maker变红，转为160V，待成为一条直线）注意事项：1、枪头顶着泳道正上方加样。
2、电泳时温度上升，用冰袋围绕电泳仪使降温。
3、跑分离胶电压在130-160V之间，低于130V时时间较长，高于150V时较快
但温度高电压大易烧坏胶。
4、细胞蛋白上样10vl左右，组织蛋白上样20vl左右。
5、当需要上样量较大或超过孔位最大上样量时，可先加一部分样跑电泳，然后再加剩下样本，使全部分样本在积层胶内汇集。
三、转膜（湿法）
1、电泳结束后，撬开短玻璃板，切去积层胶，浸泡于转膜液。
2、用直尺或梳子量出凝胶大小，按尺寸剪滤纸和硝酸纤维素滤膜（PVDF膜）。
3、PVDF膜先浸入泡膜液（甲醇）中活化，然后放入转膜液中清洗。
4、海绵，滤纸，膜湿润，阴极电极（黑面）在下，从下到上顺序为：海绵，滤
纸，胶，膜，滤纸，海绵。膜与胶精准对齐，盖好滤纸后用玻璃棒赶出气泡。
5、转膜一般为80Ma,2小时。当目标蛋白为72bp以上时转3h，72bp以下时转
1.5-2h。（210V，200MA，时间根据蛋白分子量来定）
注意事项：1、撬胶时尽量把胶留在厚板上，记录上样顺序。
2、滤纸为3层，可重复利用，但最好使用1-2次后更换。
四、染胶
考马斯亮蓝染料浸染，摇床5h。使用脱色液脱去多余染料，可见胶中有蛋白的部位出现蓝色条带，证明胶中相应条带有目的蛋白。
在转膜前染胶可验证所提蛋白中是否有目的蛋白；在转膜后染胶验证转膜知否彻底。
五、染膜
丽春红染料染膜，可见膜上有蛋白的部分出现红色条带，沿条带剪膜可避免漏剪或剪歪。用dd水即可洗净染料。
六、封闭
把膜放入装有封闭液的塑封袋中，一张膜1ml左右。30°摇床1h。
O加入0.3g。
封闭液为3%BSA（牛血清蛋白），10mlddH
2
注意事项：1、首次做蛋白时可不做封闭，此时膜显色后背景较深。看情况需要背景较浅时可做封闭。
2、封闭液4℃保存
七、结合一抗
1、蛋白一抗：稀释液为含有1%BSA的TBST（稀释的比例按说明说来进行条件摸索）
2、将膜放入相应的塑封袋中，拍出气泡，4℃摇床过夜（12h）或常温2h摇床。
3、一张膜1.5ml左右，2张膜2-3ml，2张一起时膜的背面相贴。
注意事项：1、一抗放4℃保存半个月，可重复利用多次。应一抗价格昂贵一般使用3-4次。
2、稀释抗体使用含有1%BSA的TBST溶液。
八、结合二抗
1、取出一抗回收，膜使用1*TBST清洗，摇床，7min一次，洗三次。（LST 15min*2+5min*4 荧光二抗 10mlBSA:1ul二抗 1小时）
2、将滤膜放入有二抗的塑封袋中，去除气泡，37℃孵育30-40min。最好是30℃孵育1h。
二抗稀释比1:7500，配10ml。或7.5mlTBS-T（含1%BSA）水中加入10μl二抗，3.5ml中加0.5μl二抗。
注意事项：二抗放4℃保存半个月，可重复利用，二抗无特异性较便宜一般使用3-4次。
九、染色
1、取出二抗回收，膜使用1*TBS-T清洗，摇床，5min一次，洗
三次。LST 15min*2+5min*4
2.荧光显影液 A：B=1
2、将膜放入干净平皿中，注入1~2ml底物染色液，使用1ml枪将液体反复注于膜表面，5-10分钟后可见蛋白条带显蓝色。
3、用三蒸水清洗停止显色反应。
十、拍照留存
试剂配方
一、10*电泳液Tris-base 15.2g
甘氨酸 94g
SDS 5g
DdH2O 500ml
配好后需放置一段时间才可溶解。
1*电泳液 10*电泳液 100ml
DdH2O 900ml
注：不用再加SDS，如果10*电泳液中没加SDS则此时添加
10%SDS10ml，890ml DdH2O.
在配置的时候要定容，所以先加一些水，而且，电泳液好
起泡泡，会有损失并且实体积胀大，所以配置的时候要轻
柔加勺搅拌
二、10*转膜液Tris-base 15.1g
甘氨酸 72g
DdH2O 500ml
配好后需放置一段时间才可溶解。
1*转膜液10*转膜液 100ml
甲醇 200ml
DdH2O 700ml
三、10*TBS Tris-base 12.114g
Nacl 43.9g
浓Hcl 5mL
DdH2O 500ml
室温贮存。
1*TBST 500ml 1*TBS +500ul吐温
第一抗体
第一抗体就是能和非抗体性抗原特异性结合的蛋白。种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。
第二抗体
第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。用抗AIV H5亚型血凝素单克隆抗体为包被抗体,兔抗AIV IgG为第二抗体。
区别
第一抗体就是平常所说的抗体，即能和抗原特异性结合。第二抗体是能和抗体结合的，即抗体的抗体。主要用于检测抗体的存在。一抗是针对抗原的抗体，二抗是针对一抗的抗体。即抗体也可以充当抗原刺激机体产生抗体。也就是说，抗原进入机体刺激机体免疫系统产生免疫应答，由B细胞可以产生与相应抗原发生特异性结合的特殊蛋白质。一抗二抗都是一种可以特异结合别的物质的基团，而且一抗可以至少结合两种其他基团（底物和二抗）。
一抗：可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。二抗：可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。如果一抗自己带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），则不需要二抗。但这样成本很高，因为一种一抗只识别一种底物。所以如今的设计一般是二抗带上可检测标记，再来检测一抗。而一抗识别底物。这样，当一抗结合到底物上，就可以通过二抗检测出来。
A MPK（Adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase）即AMP依赖的蛋白激酶，是生物能量代谢调节的关键分子，是研究糖尿病及其他代谢相关疾病的核心。它表达于各种代
谢相关的器官中，能被机体各种刺激激活，包括细胞压力、运动和很多激素及能影
响细胞代谢的物质。遗传学和药理学研究表明，AMPK是机体保持葡萄糖平衡所必需的。由于分子机制十分复杂，药物分子激活AMP 是一个巨大的挑战，但其激活能改善由II型糖尿病引起的代谢失衡。
AMP蛋白激酶（AMPK），它主要控制细胞新陈代谢：它会决定身体中的脂肪是储存还是燃烧，这主要取决于细胞中总能量。当细胞能量水平较高时，细胞中存在高浓度的能量分子ATP（三磷酸腺苷），因此AMPK会促使细胞进行“合成代谢”，将多余能量作为脂肪储存下来；当ATP水平较低时，AMPK将关闭合成代谢，反而激发分解代谢，让脂肪燃烧为能量。研究人员表示，AMPK能作为治疗2型糖尿病的一种有效手段。当AMPK探测到细胞中ATP浓度较低时，它们会利用各种机制使细胞中的葡萄糖变为ATP。对于啮齿类动物的实验已经表明，AMPK对于降低血糖是有效的。
PPAR分子含α、β、γ三型，分布在各不同组织，它的功能涵盖的范围之广是现今已知的其他生物医药分子所难望其项背，包括糖尿病、肥胖、高血压等代谢症候群，免疫发炎疾病如类风湿性关节炎，皮肤及伤口愈合，以及最近发现的多种癌症的治疗，PPAR分子都参与其中，并且扮演非常重要及突破性的角色。而这些疾病正是二十一世纪人类面临的主要医药卫生问题。引藻是有大量PPAR的，引藻的调脂降糖作用与其含有PPAR配体成分而激活人体内的PPAR有关。PPAR有三种亚型，即PPARA、PPARA/A、PPARA，它们在脂肪细胞分化、脂质代谢、糖代谢、胰岛素敏感性等病理生理过程中起到重要作
用。目前已有多种PPAR配体被开发成药物，例如贝特类（PPARA配体）及噻唑烷二酮类（PPARA配体）分别能有效地治疗血脂异常及2型糖尿病。引藻含有的PPAR配体可以激活人体内PPAR分子，有效清除因病毒感染导致胰岛受损所引起的胰岛抵抗。达到平稳降糖，从根本上消除糖尿病病因。并逐渐改酸性体质为碱性体质，因此对糖尿病患者相当有帮助。此外，引藻中含有次麻油酸，对于稳定
血脂质浓度的功效早已被确认。另外，引藻还可以预防糖尿病病人最严重的动脉硬化所引起的心脏、肾脏、及脑溢血等并发症。
固醇调节元件结合蛋白1（Sterol regulatory element-binding protein 1,SREBP-1）是重要的核转录因子之一,能调控内源性胆固醇、脂肪酸、甘油三酯和磷脂合成所需酶的表达,以维持血脂动态平衡。研究表明,SREBP-1及其靶基因网络的异常可引起胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病、心功能紊乱、血管并发症和肝脂肪变等一系列代谢性疾病。近年高通量组学技术的发展极大扩展了对SREBP-1靶基因及其转录调控模式的了解。文章对SREBP-1蛋白结构、活化过程、DNA结合位点及其调控的靶基因等方面的研究进展进行了综述,并着重介绍了基于组学数据的转录调控网络的构建,这将有助于更好的认识SREBP-1在脂类代谢中的作用,为深入探讨脂质代谢性疾病的治疗提供新线索。
Western超详细实验步骤
Western实验步骤 1。电泳（Electrophoresis) （1）SDS-PAGE凝胶配制 SDS—PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水,Arc—HCL（29：1），10％APS，SDS,TEMED。 一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%—15％的胶，浓缩胶10%的胶。 配胶步骤： 1。清洗玻璃板,装好(注意不要漏即玻璃板要对齐）。 2.按比例配分离胶（8ml-10ml） 3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线,一般凝固时间30分钟—1小时左右）,吸走上层水面 4。按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，(注意别有气泡)，待凝。(如果今日不上样可以放入4°C冰箱） 注意：玻璃板要洗得干净;玻璃板要装好,不要漏;制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡; (2）样品处理 1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS—PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加3。5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上)，充分吹打混匀 2.100℃水浴加热5分钟,以充分变性蛋白。 3.12000r离心5分钟。 （3)上样与电泳 1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右 2。蛋白质样品冷却到室温后,直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker（6ul）(注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。 3。通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟(一般为90-120分钟）。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。(为了避免电泳过头,最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳) 注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。 3.转膜（Transfer） 1。物品准备，甲醇，转膜缓冲液，滤纸，转膜槽，玻璃皿3个，制冰。 2。取下胶板，用专门的板将玻璃板分离(务必不要将胶弄破,动作轻些,从下面和上面分离玻璃板）,切适合大小的胶（不要切掉MAKER）。 3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜，PVDF膜要放入甲醇中浸15秒（一般1—2分钟），胶要切角做标记（不要切到maker),一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序 4。铺膜,PVDF膜铺在胶上，在PVDF膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可（滤纸要大于等PVDF膜，PVDF膜要大于等胶），赶尽气饱。 5。再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中，有PVDF膜这面放在正极侧（即无色透明夹这面），再将夹子放入转膜槽里（电极不要放错，蛋白质带负电的） 6.转膜，槽放入冰中，槽内放冰槽，设定转膜电流为300—400mA,电压120伏，转膜时间为40分钟（30-60分钟)。
Western_Blot操作步骤
Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材：组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
western步骤
1、SDS-PAGE电泳 将电泳仪的玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上,加满蒸馏水试漏后，准备灌胶。按说明书配制分离胶及浓缩胶，加入四甲基乙二胺（TEMED）后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到适宜高度后在胶上加水封胶，隔离空气使凝胶速度加快。分离胶凝固后，吸去胶上层的水，将剩余空间灌满浓缩胶后插入梳子。待浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子两侧竖直向上轻轻将其拔出。用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中，加入足量电泳液。按5：1比例向样品加入溴酚蓝，并于沸水中煮5 min，计算100 μg蛋白的溶液体积即为上样量。用微量进样器贴壁吸取样品，缓缓加入加样孔中。恒压100 V，电泳至溴酚蓝刚跑到分离胶最下端即可。 2、转膜 2.1 湿转 在加有转膜液的瓷盘里放入转膜用的夹子、海绵、玻棒、滤纸和硝酸纤维素膜。将夹子打开使黑面向下，在上面垫一张海绵，用玻棒赶走气泡。在海绵垫上滤纸。撬开玻璃板，将浓缩胶轻轻刮去。根据marker显示，在所需分子量上下0.5 cm裁胶。小心剥下胶条置于滤纸上并调整使其与滤纸对齐。将NC膜盖于胶上，并在膜上盖张滤纸。最后盖上另一张海绵垫，将夹子夹起。整个操作在电转液中进行，并不断除去气泡。将夹子放入电转槽中，并在夹子中加满电转液。在电转槽中加入冰水，避免转移时大量产热。恒流1A，电转80 min（电流及转膜时间根据分子量进行调整）。 2.2 半干转 将滤纸及NC膜放入盛有半干转液的表面皿中，使NC膜充分浸透。半干转仪上放滤纸，铺上NC膜，将胶置于膜上并赶气泡，最后盖上滤纸，将夹子夹起，装好仪器，调电流及转膜时间，转膜。转膜电流=[NC膜（2×8cm）个数×0.04]A;转膜时间=（分子量+3）min（转膜时间根据转膜情况可上下调整）。
westernblot步骤
Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Poly tron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradf ord比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。 4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参 考如下步骤进行操作。
western详细步骤
Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液 (P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。 (2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X 或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 (3) 上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准(P0066)。 电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A/P0014B)。 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压
Western基本步骤
Western基本步骤 Westen blot 一、配胶 （一）安装胶架 （二）配胶 1、分离胶：10%（10ML） O 4 ml DdH 2 30%Acr 3.3ml Tris-Hcl(8.8) 2.5ml 10%SDS 0.1ml 10%过硫酸铵AP 0.1ml TEMED O.OO4ML 2、积层胶: 4ml O 2.7 ml DdH 2 30%Acr 0.67ml Tris-Hcl(6.8) 0.5ml 10%SDS 0.04ml 10%过硫酸铵AP 0.04ml TEMED O.OO4ML 注意事项：1、TEMED催化AP产生自由基，加速Acr凝胶聚合，一般于4度存放。 不宜多加，否则胶易变硬脆裂。 2、TEMED易燃、腐蚀性、神经毒性，要注意防护。易挥发，使用后立 即盖紧瓶盖，佩戴PE手套。
3、每加完一样晃匀，TEMED最后加。 （三）灌胶 1、分离胶1ml枪吹打均匀，避免气泡，尽快灌入固定好的玻璃板中。 O，压平分离胶界面。待胶凝后可见分割折线。 2、分离胶上灌满ddH 2 O，分隔线先清楚后不清楚，待胶凝后又可见。 可用乙醇代替ddH 2 O，用滤纸吸干。 3、分离胶凝后，倒去顶部ddH 2 4、积层胶1ml枪吹打均匀，灌入玻璃板中至顶部。 5、插入梳子，注意梳子底部应无气泡。略倾斜插入梳子可避免出现气泡 6、20-30分钟后胶凝。 二、电泳 （一）准备 1、装上电泳装置，倒入1*电泳液。先倒内槽（新）没过短玻璃板，如内槽不漏液再加外槽，没过钢丝电极即可，内外槽不能相通。 2、拔出梳子（用力均匀缓慢拔出），用10vl枪点样。 （二）上样和电泳 1、10vl枪点样。（1.0胶最大上样量30vl，0.75胶最大上样量25vl） 2、样尽量点在中间孔位，空孔位用残样或5*buffer填补，避免边缘效应，使电流在胶板中均匀分布。 3、maker 3-3.5 vl。Maker一般-20℃保存，尽快上样尽快放入冰箱。 4、盖上电泳槽，接通电源。积层胶电压80V，分离胶160V。电
Western Blot 详细实验步骤
Western Blot protocol 1，制样：将获得的细胞用PBS洗涤，300gx4℃x5min,弃去上清。加SDS loading buffer 搅拌转移到1.5ml离心管。放到干浴锅100℃煮10min，放入冰上5min，最后存入-20℃冰箱待用。 2，将样品取出待用，可100℃煮2min，待上样。 3，配胶：浓缩胶5%，分离胶8%，10%或12%（分子大用低浓度，分子小用高浓度Caspase3 35kD，12%浓度(活性形式17kD)；DAPK1/p-DAPK1 160KD 18%浓度）：ddH2O，30%Acrylamide, 1.0M/1.5MTris-HCL, 10%SDS, 10% AP, TEMED按比例加。 1）夹好板子，用ddH2O捡漏，5min。 2)按照顺序加入试剂配胶配分离胶（50ml管子），混匀。 3）加胶7ml，大致与夹子的门平齐。随后轻轻加3ml乙醇液封页面。静置 30min。 4）将乙醇倒掉，用ddH2O清洗3遍。 5）制备浓缩胶，加入3ml左右只玻璃板界面，插入梳子。 6）静置30min后拔掉梳子。取下玻璃板用ddH2O 冲洗边缘。 7）若不立即使用可用保鲜膜将其包好放在4℃冰箱。（TEMED在灌胶前加入）4，上样： 1）固定好玻片，加入running buffer 没过底板，盖上盖子。 2）浓缩胶75-80V 30min左右，分离胶100V-120V 1h左右。 5，转膜： 1）取出玻璃板，用切胶器轻轻撬动取掉小玻片，切去浓缩胶（将分离胶放入放
入ddH2O水中浸泡5min，重复三次）再放入trans buffer中放置10min。2）剪一块与胶一样大的PVDF膜放在甲醇中浸泡，使其带正电。 3）将PVDF，海绵垫，滤纸放入trans buffer浸泡几分钟。 4）在黑色面板依次放入海绵垫，至少3层滤纸，胶，转移膜，注意不能有气泡，再放滤纸，海绵垫形成夹心结构。(大分子用0.4 um PVDF 膜，小分子用0.25um PVDF膜)。 5）关上夹子将其转入放在冰上的电泳槽，黑对黑，白对红，加trans buffer关上盖子。200mA 1-2h或恒压100V 1-2h（大分子250mA 3小时左右）。 6，免疫反应： 1）取出膜，与胶接触的为正面，正面朝上，放入牛奶或5%TBST牛血清中摇床2h封闭，或放入4℃冰箱过夜。 2)倒掉封闭液，分别剪下有内参蛋白和待测蛋白的膜，分别加内参抗体TBST：抗体=10000:1 5ml左右，待测抗体TBST：抗体=1000:1 5ml左右（最好分开孵育当A蛋白和B蛋白分子量差别5KDa以上（10KDa左右更保险），可将膜分割开（分别标记不同的抗体），这样就不需要stripping膜重新标记，且一次就能得到想要的结果。有人会将两种抗体混在一起标记整张膜，这样操作的前提是非常熟悉这两种抗体的杂带位置，且各自的杂带都不会干扰目的蛋白才可以如此操作；并且这样的抗体下次使用有了局限性，因此不太推荐) 在摇床上孵育1-2h，较难杂的4℃孵育过夜或者更久。 3）回收一抗。用TBST在摇床洗膜4次，每次10-15min左右。(再用TBS洗一次10min)。 4)孵二抗浓度1:1000，1h。
Western基本步骤
Westen blot 一、配胶 （一）安装胶架 （二）配胶 1、分离胶：10%（10ML） O 4 ml DdH 2 30%Acr 3.3ml Tris-Hcl(8.8) 2.5ml 10%SDS 0.1ml 10%过硫酸铵AP 0.1ml TEMED O.OO4ML 2、积层胶: 4ml O 2.7 ml DdH 2 30%Acr 0.67ml Tris-Hcl(6.8) 0.5ml 10%SDS 0.04ml 10%过硫酸铵AP 0.04ml TEMED O.OO4ML 注意事项：1、TEMED催化AP产生自由基，加速Acr凝胶聚合，一般于4度存放。 不宜多加，否则胶易变硬脆裂。 2、TEMED易燃、腐蚀性、神经毒性，要注意防护。易挥发，使用后立 即盖紧瓶盖，佩戴PE手套。 3、每加完一样晃匀，TEMED最后加。 （三）灌胶 1、分离胶1ml枪吹打均匀，避免气泡，尽快灌入固定好的玻璃板中。 O，压平分离胶界面。待胶凝后可见分割折线。 2、分离胶上灌满ddH 2 可用乙醇代替ddH O，分隔线先清楚后不清楚，待胶凝后又可见。 2 O，用滤纸吸干。 3、分离胶凝后，倒去顶部ddH 2 4、积层胶1ml枪吹打均匀，灌入玻璃板中至顶部。 5、插入梳子，注意梳子底部应无气泡。 略倾斜插入梳子可避免出现气泡 6、20-30分钟后胶凝。 二、电泳 （一）准备 1、装上电泳装置，倒入1*电泳液。先倒内槽（新）没过短玻璃板，如内槽不漏液再加外槽，没过钢丝电极即可，内外槽不能相通。 2、拔出梳子（用力均匀缓慢拔出），用10vl枪点样。 （二）上样和电泳 1、10vl枪点样。（1.0胶最大上样量30vl，0.75胶最大上样量25vl）
(完整word版)Western操作步骤
Western-Blot 操作流程及个人心得体会（二） from 生物问问我的生物博客 Western操作步骤 （一）蛋白样品制备 (1）单层贴壁细胞总蛋白的提取: 1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0。01M pH7.2～7。3)。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液.将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3。按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合） 4. 每瓶细胞加400 μl 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5。裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1。5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行） 6。于4℃下12000rpm 离心5min。(提前开离心机预冷) 7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。 （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液,按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的.本人是先用预冷的PBS（一般数毫升)加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强) （2）组织中总蛋白的提取:
Western_Blot操作步骤
Western Blot操作步骤 一、Western blot 实验步骤概述二、Western blot具体实验步骤 三、Western blot 实验注意事项四、Western blot关于内参抗体 一、Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材：组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、Western具体实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。 (2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样
Western Blot 实验步骤及注意事项
Western Blot 实验步骤及注意事项 western blot的实验步骤及注意事项一、实验步骤 1.缓冲液配制 (1) Transfor Buffer: 2.9g Glycine, 5.8gTris, 0.37g SDS（可不加）, 200ml Methanol（临用前加）,ddH2O to 1L (2)10×TBS: 1 M Tris・HCl（pH 7.5）100 mL, 88 g NaCl, ddH2O to 1L (3)TBST: 1×TBS中加入1/1000的Tween (4)封闭液：脱脂奶粉5%(w/v),用TBST配制 2. SDS-PAGE 电泳电压：积层胶电泳电压80V左右，分离胶电泳电压110V~120V 3.免疫印迹 (1) SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳结束后，将胶放至转移缓冲液中浸泡15m in，切6张Whatman 3mm滤纸和1张PVDF膜，与凝胶大小相符合。将PVDF膜事先用甲醇浸泡，再用 转移缓冲液浸泡。 (2) 将凝胶及PVDF膜以“三明治”状(即3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸)逐层 铺于转印仪上，凝胶一面连接阴极，100 V转移40 min（根据转移蛋白的分子量确定转移 时间）。 (3) 将膜放入小盒中，加入5 mL封闭液，摇床上温育1 h。 (4) 以1/1000的比例，加入5 μL第一抗体，4 ℃温育过夜。 (5) TBST溶液洗膜10 min，轻倒，重复3次。 (6)加入 5 mL TBST溶液，以1/2000的比例，加入2.5 μL第二抗体，温育1 h。 (7) TBST溶液洗膜5min，轻倒，重复3次。 (8)加入2 mL显色底物温育3 min，将薄膜封入保鲜袋中，压平，尽可能不留空气， 滤纸吸干显色底物。放入夹板中。 (9)配制显影液和定影液。暗室操作：将X光片放入夹板中，曝光5 s（根据荧光强度确定），然后放入显影液中，至出现明显的条带取出，水洗后放入定影液中，定影一段时间，取出用水冲洗干净。 二、注意事项 1. 在Western实验中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，能否有人解释一下二者在 使用中的区别？ 选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲 范围），TBS在PH7.0以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。但我们常常要根据我们实 验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；
western的操作步骤
W e s t e r n B l o t操作全过程一，收蛋白 a 如果要收集死细胞 1.取冰,将4°C离心机提前降温。 2.将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍,用适量的 胰酶消化,用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来,收集到离心管,室温离心1000rpm,5min。 3.弃上清,将离心管倒扣在滤纸上,尽量吸尽残留上清。 4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。 1×Cell Lysis Buffer： PMSF=100：1,1×Cell Lysis Buffer,PMSF-20°C保存。PMSF常温易降解,拿出时间不得超过30min,必须放置冰上。 5.冰上裂解15min,将裂解液转移至EP管离心,4° C,12000rpm,15min。 6.小心将上清转移至另一EP管,记下吸取的量。如：100μL。 7.将收集好的蛋白保存与—20°C。可长期保存 b 如果不收集死细胞 1．弃上清,孔板PBS洗1-2遍,吸尽PBS。在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。同上 2．冰上裂解15min,用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。不同的孔不能用同一个刮子,刮前用水冲洗,擦干。 3．将裂解液转移至EP管离心,4°C,12000rpm,15min。 4．小心将上清转移至另一EP管,记下吸取的量。
5．将收集好的蛋白保存与—20°C。可长期保存 二，测蛋白浓度 BCA法或者按照自己的试剂盒说明操作 1.需96孔板,测蛋白浓度的A液,B液,标准蛋白,要测的样品蛋白。 2.按要测的样品蛋白的数量来配AB液,每孔需AB混合液80μl A： B=50：1 。例：有5个样品,加上5个标准蛋白和空白对照。共有11个孔。则A液取11×80=880μl,B液取880÷50=17.6两液混匀,加入96孔板,每孔80μl。然后加入标准蛋白及样品蛋白4μl。 标准蛋白先配好浓度125,250,500,1000,2000 3.将孔板放入37°C温箱孵育30min。 4.用酶标仪测蛋白浓度。 5.记下蛋白浓度,根据要上样的μg量算出μl量。例：蛋白浓度为 1000,需上样15μg。则需上样15÷1000= 上样量不超过20μl。三，配胶 1.将薄板和厚板用洁净的布擦干净,对齐,夹好。板必须擦干净,下 端对齐,否则容易漏胶。 2.配分离胶,根据要跑的蛋白分子量,配相应浓度的胶。 3.快速将分离胶加入薄厚板之间,不能太满,留出浓缩胶的部分。 浓缩胶高度大约1CM 4.在分离胶上灌水,要缓慢,为了让胶凝的更好。 5.30分钟左右,分离胶凝了,将水倒掉,滤纸吸干,找好梳子。制浓缩 胶。
westernblot实验步骤
westernblot实验步骤 Western blot实验是一种常用的免疫学检测方法，适用于分析特定蛋白质的存在量、大小和结构等。下面将介绍Western blot实验的主要步骤，以及注意事项。 1. SDS-PAGE凝胶电泳 Western blot实验首先需要进行SDS-PAGE凝胶电泳。SDS-PAGE （Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种分离蛋白质的方法，可以根据蛋白质的大小将其分离离子定位在凝胶中相应的位置。在SDS-PAGE中，蛋白质会被特定化学物质SDS （十二烷基硫酸钠）包裹，其带负电荷的端口相互排斥，并使蛋白质在电场中沿着凝胶运行，根据大小排序在不同位置。 2.转移蛋白质到膜上 SDS-PAGE电泳完毕后，需要将蛋白质迁移到聚丙烯腈或硝酸纤维素膜上。转移可以采用湿式或半干燥式方法，膜的种类和转移缓冲液的浓度、pH值等因素都会影响转移效果。
3.蛋白质与抗体结合 膜上的蛋白质需要与浓度足够的抗体进行结合，使其出现颜色。抗体可以是多克隆或单克隆抗体，通常由动物免疫学制备而成。在结合抗体之前，膜需要被阻断，以避免非特异性的背景信号。 4.识别蛋白质 识别特定蛋白质需要使用标记有酶、荧光体或放射同位素等的二抗或底物。蛋白质与特定抗体形成复合物后，可以使用二抗结合在蛋白质与一抗之间。底物是标记于蛋白质特定抗体上的酶，在底物的作用下，可生成可见信号，如液态手套（ECL）。 注意事项： 1.蛋白质的提取和纯化，提取方式会影响到实验结果，选择适当的提取方法是十分重要的。 2.涉及到蛋白质电泳和转移过程，准确控制电泳时间和电压，转移条件、时间以及温度都会影响转移效果和转移后的后续步骤。
Westernblot基本操作步骤
W e s t e r n b l o t基本操作 步骤 IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】
W e s t e r n b l o t基本操作步骤一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含 1mMPMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液 12000rpm离心10min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于westernblot的蛋白样品取一定量加4×loadingbuffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA 工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS到20μl。 各孔加入100μlBCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Westernblot基本操作步骤 1、溶液配制： ①RunnigBuffer(1×)：SDSRunnigBuffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②TransferBuffer(1×):TransferBuffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ 水至1L； ③TBST缓冲液 1MTris·HCl（）：60.5gTris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至，加MiliQ水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1MTris·HCl100ml+80gNaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+（%，v/v），加MiliQ水至1L。
Westernblot实验步骤及注意事项
Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml 移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。 3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参 考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文
Western操作步骤
Western-Blot 操作流程及注意事项 Western操作步骤 （一）蛋白样品制备 （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2~7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3. 按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合） 4. 每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行） 6. 于4℃下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷） 7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。 （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强） （2）组织中总蛋白的提取： 1. 将少量组织块置于1~2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。 3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： 1. 将培养液倒至15ml 离心管中，于2500rpm 离心5min。 2. 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后PBS 重复洗涤一次。 3. 用枪吸干上清后，加100 μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 4. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （二）蛋白含量的测定 （1）制作标准曲线 1. 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 2. 取18 个1.5ml 离心管，3 个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。