培养基配制及其灭菌消毒

专业：环境科

学

班级：1101 姓名：

学号： 日

期

：

2013.10.25

地点：

农生环组团B247

课程名称：环境微生物学实验 指导老师： 梁璐怡 成绩： 实验名称：真菌形态和结构观察 同组同学：

一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料与仪器 四、实验步骤 五、实验结果（显微镜下微生物微生物形态图） 六、分析讨论 七．思考题

一、实验目的

1.了解微生物培养基的种类及其配制原理。

2.掌握微生物培养基的配制程序。

3.学习和掌握牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基和淀粉琼脂培养基（又称高氏一号培养基）的配制方法。

4.了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其操作方法。

5.掌握微生物常用器皿的包扎方法。

6.掌握无菌水的制备方法。

二、实验原理

1.培养基：

（1）培养基是人工配制的适合于不同微生物生长、繁殖或累积代谢产物的营养物质。对培养基的基本要求是：提供微生物正常生活所需飞各种养料（如碳源、氮源、无机盐类、生长因子等）并保持养料之间的平衡；具有适宜的pH 值；具有合适的渗透压；保持无菌状态。 （2）培养基的主要成分：

告

①水分：水分约占微生物细胞的70%～90%，具有重要的生理功能。配制培养基可以用天然水和蒸馏水。

②碳源：碳源是微生物的重要营养物质，用于合成细胞物质和提供生命活动所需的能量。配制培养基所用的碳源很多，其中主要为葡萄糖，其他还有糖类、蛋白质、脂肪、有机酸、醇类、烃类等。

③氮源：氮源是组成细胞蛋白质的主要成分。除了某些固氮细菌能利用分子态氮外，其他微生物都需要化合态氮作为养料。培养基采用的无机氮有铵盐和硝酸盐；常用的有机氮有蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、豆芽汁、氨基酸等。

④矿物质：许多矿物质或是酶的成分，或是生理调节剂。

⑤生长因子：一些微生物的生长需要外加生长因子，在配制培养基的工程中，一般通过添加蛋白胨、酵母膏、牛肉膏等天然材料及其制品来满足。

（3）选择和设计培养基的原则：

①以工农业生产中废弃物作为培养微生物的原料：蜜糖、乳清、豆制品工业废液、黑废液等。

②工业上甲烷发酵一注意利用废水废渣作原料。在我国农村，以推广利用粪便及禾草为原料发酵生产甲烷为原料。

（4）培养基的种类：

①根据培养基的组成成分，培养基可分为天然培养基、合成培养基。

②根据培养基的物理状态，培养基可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。

③根据实验目的和用途，培养基可分为基础培养基、加富培养基、选择培养基、鉴别培养基。

（5）培养基的凝固剂：

①常用的凝固剂：琼脂、明胶、硅胶。

②凝固剂必须具有以下条件：不被微生物液化、分解和利用；在微生物生长的温度范围内保持固体状态；凝固点的温度对微生物无害；不因消毒灭菌的高温处理而破坏；透明度好、黏着力强；配制方便、价格低廉。

2.培养基的配制：

①牛肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于细菌的培养基，主要成分是牛肉膏、蛋白胨和氯化钠。它们主要提供细菌生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子等。

②高氏一号培养基是一种广泛用于放线菌的合成培养基，以可溶性淀粉作为碳源和能源，硝酸钾作为氮源，磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁作为无机盐。

③马铃薯蔗糖培养基是一种广泛用于霉菌的培养基，在配制过程中，不经pH调节而呈自然状态。

3.灭菌和消毒：

①灭菌：灭菌是指杀死或除去特定环境中的所有微生物（包括芽孢和孢子）的过程。对于不同物品或不同成分和性质的培养基，应当采用不同的灭菌方法。

②消毒：消毒是指杀死或者除去特定环境中可能引起感染或产生其他不良影响的微生物的过程。消毒的效果取决于细菌的种类和数量，以及消毒方法和消毒剂杀菌能力等。

③灭菌和消毒的方法可分为四大类：加热灭菌、过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药剂灭菌和消毒。

三、实验材料与仪器

1.药品和试剂：琼脂，牛肉膏，蛋白胨马铃薯，蔗糖，可溶性淀粉，氯化钠，K2HPO4、KNO3，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH等。

2.仪器：天平，电磁炉，高压蒸汽灭菌锅，电热烘箱。

3.玻璃器皿：培养皿，带有硅胶塞的无菌试管，带铝盖的试管，移液管，装有玻璃珠的三角瓶，涂布棒，烧杯，量筒，锥形瓶，试管，吸管，玻璃漏斗，玻璃棒、三角玻棒等。

4.其他物品：刻度搪瓷杯，药匙，称量纸，pH精密试纸，纱布，线绳，牛皮纸，报纸，棉花，标签等。

四、实验步骤

1.培养基的配制：

（1）细菌培养基——牛肉膏蛋白胨培养基

①材料用量的计算：

根据配方以及所需配制培养基的数量，称取或量取所需的材料。在本实验中，先将配方中的各种材料配成浓缩液：10%牛肉膏、10%蛋白胨、10%氯化钠、。如果需要配制300mL培养基，则吸取10%牛肉膏15mL，10%蛋白胨30mL，10%氯化钠15mL，称取琼脂6g。

②配制：

将吸取的材料加入有刻度的搪瓷杯，用自来水补足到300mL，并记下刻度。

③调节pH：

按照要求，将pH调至7.2～7.4。用玻璃棒蘸取少量培养液至pH试纸上，与比色卡对照得出pH 值。根据偏差大小，分别滴入浓度为1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH进行调节，并不断用pH试纸检测pH值，直至达到预期的pH值。

④加入琼脂：

在液体培养基中加入称好的琼脂6g，加热至沸腾，期间不断用玻璃棒搅拌，以以防糊底，直至琼脂完全熔化（用玻璃棒挑起培养液时不再有面条状的琼脂可视为琼脂已经完全熔化）。最后补足蒸发损失的水分。

⑤分装培养基：

培养基的分装应当趁热在漏斗架上完成。在带有硅胶塞的无菌试管中，每支分装5mL，共10支，用于制作斜面。带有铝盖的试管各分装15mL，共10支，用于制作平板。

⑥包扎成梱：

以10支为一捆，用防水纸包扎成梱，挂上标签，灭菌备用。

（2）放线菌培养基——淀粉琼脂培养基

①计算称量：

吸取1% KNO330mL；1% K2HPO415 mL；1% MgSO4·7H2O 15 mL；1%NaCl15 mL；1% FeSO4·7H2O

0.3 mL于搪瓷杯中，加水补至300 mL，置于电炉上加热。

②淀粉预处理：

用另一支搪瓷杯称取可溶性淀粉6g，从300 mL水中取出少量加入淀粉中，用玻棒调成糊状，待前一只搪瓷杯内的培养液沸腾后，将淀粉糊洗如培养液中，搅匀。

③调节pH：

从电炉上取下搪瓷杯，按照配制细菌培养基的方法，用HCl或NaOH将pH调至7.2～7.4。

④加入琼脂：

加入琼脂6g，在加热的同时，不断用玻璃棒搅拌，要求将底部的淀粉糊搅起来，以防糊底。加热至琼脂完全熔化。

⑤分装培养基：

趁热分装培养基，培养基的分装应当趁热在漏斗架上完成。在带有硅胶塞的无菌试管中，每支分装5mL，共10支。带有铝盖的试管各分装15mL，共10支

⑥包扎成梱：

以10支为一捆，用防水纸包扎成梱，挂上标签，灭菌备用。

（3）真菌培养基——马铃薯蔗糖琼脂培养基

①马铃薯预处理：

取去皮马铃薯适量，切成小块，放入搪瓷杯中，加水300mL，置于电炉上加热，煮沸10min，用四层纱布过滤至刻度搪瓷杯中，滤液加水补足至300mL。

②熔琼脂和其他成分：

加入蔗糖6g，琼脂6g，在电炉上加热熔化，并用玻棒从底部不断进行搅拌，直至所有组分完全熔解。

③分装培养基：

培养基的分装应当趁热在漏斗架上完成。在带有硅胶塞的无菌试管中，每支分装5mL，共10支，用于制作斜面。带有铝盖的试管各分装15mL，共10支，用于制作平板。

④包扎成梱：

以10支为一捆，用防水纸包扎成梱，挂上标签，灭菌备用。

2.无菌水的制备：

①取装有玻璃珠的100mL三角瓶一只，装入蒸馏水45mL，用牛皮纸包扎。

②取4只带铝盖的试管，向其加入9mL蒸馏水，每组4只包扎成梱。

3.微生物常用器皿的准备：

①试管棉塞的制作：

教师示范做，每个同学要求做一个。棉花塞要求不紧不松，两头光滑，试管棉花塞约长3cm。塞入试管内部约占2/3，头部稍大约占1/3，详见图。

②移液管的包装：

在移液管的上端塞入一小段棉花，它的作用是避免外界及口中杂菌吹入试管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm，棉花段自身长度约为1～1.5cm。塞棉花时，可用接种针，将少许棉花塞入试管口内。棉花要塞得松紧适宜，以吹时能通气而又不使棉花下滑为准。

先将报纸裁成宽约5cm的长纸条，再将塞好棉花的移液管尖端放在长纸条的一端，约成45°角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，详见图。准备灭菌。

③培养皿的包装：

可用报纸将几套培养皿包成一包，一般是6套包成一包，包好灭菌后使用。

④锥形瓶的包装：

在锥形瓶的瓶塞外面包一层牛皮纸，灭菌后使用。

五、注意事项

1.培养基配方上标出的pH值是该培养基使用时的pH值。灭菌处理会影响培养基的最终pH值，应注意调整。

2.培养基配好后，应及时包扎成梱，并挂上标签，写明培养基名称、操作者和配制日期，以免搞错。

3.细菌培养基要调节pH值，而真菌培养基不用。

4.由于配制培养基所需的材料较多，称取材料后最好根据配方核对一遍，以免搞错。

5.在配制培养基过程中，各材料按照配方所列次序依次添加。所用容器的大小应为培养基配制量的两倍，以便操作。

6.熔化琼脂时，要控制火力，并不断搅拌，以免琼脂烧焦或外溢。

7.用于分装培养基的容器应当洁净并经灭菌。分装培养基的动作要快，以防培养基凝固。如果分装量难以控制，可用分装好等体积自来水的同规格试管作为参照。切勿让培养基沾污试管，以免招致杂菌

污染。

8.干热灭菌时，电烘箱捏物品摆放的不要太挤，以免妨碍热空气流通。避免物品与电烘箱内壁接触，以防包装纸烤焦起火。

9.采用手提式高压灭菌锅灭菌时，加水不可过少，以防烘干，引起灭菌锅炸裂。物品不宜紧靠锅壁，以免影响蒸汽流通和冷凝水顺壁流入灭菌物品。

10.切勿在高压灭菌锅尚有压力、温度高于100℃的情况下开启排气阀，负责会因压力骤降而造成培养基溢出。

11.湿热加压灭菌期间，需有人看管，时刻注意压力表的读数，通过调节热源维持压力，以防发生事故。

12.使用高压蒸汽灭菌时，应注意以下几点：

①灭菌包不宜过大过紧，灭菌器内物品的放置总量不应超过灭菌器柜室容积的85%。各包之间留有空隙，以便于蒸汽流通、渗入包裹中央，排气时蒸汽迅速排出，保持物品干燥。

②盛装物品的容器应有孔，若无孔，应将容器盖打开。

③布类物品放在金属、搪瓷类物品之上。

④被灭菌物品应待干燥后才能取出备用。

⑤灭菌锅密闭前，应将冷空气充分排空。

⑥随时观察压力及温度情况。

⑦注意安全操作，每次灭菌前，应检查灭菌器是否处于良好的工作状态。

⑧灭菌完毕后减压不要过猛，压力表回归“0”位后才可打开盖或门。

六、思考题

1.配制固体培养基，加入琼脂加热熔化时要注意哪些问题？

①加热器功率不能太高，也不能太低。太高，容易沸腾和把培养基烧焦；太低，培养基容易凝固。

②受热要均匀，可以垫上石棉网，要用玻璃棒不停缓慢搅拌。

③加热完毕后，要在合适的温度（60左右）倒平板，防止凝固。

④熔化琼脂时，要控制火力，并不断搅拌，以免琼脂烧焦或外溢。

2.培养基中加琼脂的作用是什么？

琼脂又叫洋菜，由海藻（主要是石花菜）提取制成，是一种多糖类化合物，主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐。一般不能用作营养物质，但能被极少数细菌分解利用。琼脂是一种可逆性胶体，在实验室常用的浓度下，加热到96℃以上时成为溶胶，降温到42℃以下时成为凝胶。

在固体培养时琼脂是最好的固体剂。加入琼脂所做成的固体培养基有不少优点，如操作简便，对培养物的支持、通气较易解决。便于经常观察研究等。但也有其缺点，如培养物于培养基的接触(即

吸收)面积小，各中养分与激素在琼脂中扩散较慢，并且各自扩散速度不同，使养分的补充慢，成分比例上有变化，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面上，浓度高，抑制组织的代谢活性，加之琼脂不可避免含有杂质，这样就使培养物在固体培养基上的生长速度显著低于在液体培养基中的速度。

它最主要的作用是使液体培养基凝固，有一些实验会采用滤纸、玻璃球、玻璃棉、石英沙、蛭石、明胶、硅胶、丙烯酰胺、泡沫塑料，甚至南瓜、马铃薯等来代琼脂，然而直到目前为此，比琼脂更方便和更好的支持物仍未发现。琼脂本身并不提供任何营养，它是一种高分子的碳水化合物，从红藻等海藻中提取，仅溶解于热水，成为溶胶，冷后(42℃以下)即凝固为固体状成凝胶。通常所说的“煮”培养基，就是使琼脂溶解于热水(96℃以上)中。琼脂以颜色浅，透明度好，洁净的为上品。

琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工厂方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关,长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解,而丧失凝固能力存放时间过久, 琼脂变褐,也会逐渐失去凝固能力。

3.干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的原理有何不同，各适用于哪些场合和物品？

灭菌

方法

原理适用场合和物品

干热灭菌法

干热灭菌法（即空气灭菌法）是利用电热烘箱作为干热

灭菌器的灭菌方法。在干热灭菌中，温度升至160～170℃，

维持1.5～2h，利用高温空气使微生物细胞内的蛋白质凝固

变性，从而达到灭菌的目的。

玻璃器皿、金属用具等耐高温

的的物品以及不允许湿热气体

穿透的油脂（如油性软膏机制、

注射用油等）和耐高温的粉末化

学药品都可用此法灭菌，此法不

适合橡胶、塑料及大部分药品的

灭菌。

高压蒸汽灭菌

高压蒸汽灭菌法是利用高压灭菌器是，使水的沸点随压

力加大而升高，以高温蒸汽来杀死微生物的灭菌方法。

高压蒸汽灭菌是一种可以信赖的灭菌方法，它能杀死一

起微生物。其杀菌原理是：①变性作用。受高温和高压影

响，蛋白质和酶发生不可逆的变性而致死微生物。②凝固

作用。蛋白质的凝固温度与含水量有关，水分越多，凝固

温度越低。对少水分或无水分的物品，需要提高温度才能

使其凝固。③穿透作用。湿热穿透能力强，在水蒸气与被

灭菌的物品相接触后，可释放大量汽化潜热，迅提高灭菌

物品的温度，从而提高灭菌效率。

主要用于耐高温、高压及

含水分、不怕潮湿的物品。

间歇间歇灭菌法又称分段灭菌法。间歇灭菌法是将待灭菌的适用于不耐热培养基的灭菌。

灭菌法培养基放在100℃下蒸煮30～60min，以杀死其中所以微生物的营养细胞，然后在室温或20～30℃下保温过夜，如此连续重复3次，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。

4.如何检查培养基灭菌是否彻底？

方法一：把灭菌后的培养基按灭菌锅内的不同位置，每处抽取数管(瓶)，标上记号，置25℃～30℃培养一周左右进行检查。如果培养基没有什么变化，说明灭菌效果良好；如果某一位置的培养基出现了杂菌菌落，可能是摆放的太紧，导致蒸汽不畅，或锅的结构不合理等原因所致，应根据上述情况进行改进；如果大部分或全部菌种瓶都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，应提高压力或延长灭菌时间。经过几次检验都证明能彻底灭菌后，以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。

方法二：将已经灭完菌的菌棒放到25－28℃的恒温环境中避光培养3天后，拿出来检查看袋内有没有杂菌滋生的痕迹。看菌袋内有没有变色、出现斑点等情况的发生，如果有就证明灭菌不彻底。

方法三：抽取少量培养基做无菌试验，按照卫生消毒规范或药典上的方法操作（简单地说取少量灭菌好的物体分别进行有氧、厌氧、真菌培养，7天后培养液不浑浊并且镜检无菌），灭菌彻底则可以通过无菌试验。

5.为什么湿热灭菌比干热灭菌优越？

①湿热灭菌因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率。

②湿热中细菌菌体蛋白较易凝固变性。

③由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；

④适宜于自动化操作，降低了操作人员的劳动强度。

⑤湿热的穿透力比干热大。

⑥湿热的蒸汽有潜热效应。蒸汽具有潜热，能迅速提高灭菌物品的温度，加强灭菌效果。而干热是相对湿度在20%以下的高热，由空气导热，速度较慢，必须提高温度和适当延长消毒时间，才能达到灭菌目的。

⑦湿热利用空气和水蒸汽的作用，导热快，穿透力强，能透入菌体，使菌体胞膜膨胀破裂，原浆流出，受热凝固变性。

⑧湿热条件下，含有一定的水分，菌体蛋白质容易凝固，灭菌效果好。

⑨干热灭菌条件下，需要温度达到160～170℃，维持1.5～2h，才能使菌体蛋白质起不可逆变性而死亡。而湿热灭菌条件下，只需较低温度就可使菌体死亡，一般温度在100℃下维持30～60min就可达到完全灭菌。