实验一培养基的配制及灭菌
实验一培养基的配制及
灭菌
Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT
实验一培养基的配制及灭菌培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。培养基的配制，一是要求在营养成分上能满足所培养微生物生长发育的需要，二是培养基在使用前不带菌，三是以灭菌后和保存过程中营养成分不发生变化。培养基的灭菌通常在培养基配制后进行，其目的是杀灭培养基中残存的微生物或活的生物残体，保证培养基在贮存过程中不变质，也防止其他生物对培养的污染。
一、实验目的
1．掌握实验室常用玻璃器皿的清洗、干燥和包扎方法。
2．明确培养基的配制原理。
3．掌握配制培养基的一般方法和步骤。
4．了解湿热和干热灭菌的原理，并掌握有关的操作技术。
二、实验原理
灭菌是指杀灭物体中所有微生物的繁殖体和芽孢的过程。消毒是指用物理、化学或生物的方法杀死病原微生物的过程。灭菌的原理就是使蛋白质和核酸等生物大分子发生变性，从而达到灭菌的作用，实验室中最常用的就是干热灭菌和湿热灭菌。
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌
所需温度高（160～170℃），时间长（1～2h）。但干热灭菌温度不能超过180℃。否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸气有潜热存在。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以提供微生物生长发育所需的物质条件。培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基，培养放线菌常用高氏I号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA），培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA）。根据培养目的不同，可分为固体培养基和液体培养基；此外，还有加富、选择、鉴别等培养基之分。就培养基中的营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。琼脂（Agar）只是固体培养基的支持物，一般不为微生物所利用。它在高温下熔化成液体，而在45℃左右开始凝固成固体。在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。培养基除了满足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度和渗透压。霉菌和酵母菌的pH偏酸；细菌、放线菌的pH为微碱性。所以每次配制培养基时，都要将培养基的pH值调到一定的范围。常用微生物培养基的配方如下：
LB培养基配方（pH ）：
胰蛋白胨（Tryptone） 10.0 g
酵母提取物（Yeast extract） 5.0 g
氯化钠（NaCl） 10.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至，用去离子水定容至1L，在压力下灭菌20min。
牛肉膏蛋白胨培养基配方（pH）：
牛肉膏 3.0 g
胰蛋白胨（Tryptone） 10.0 g
NaCl 5.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000 mL
高氏I号培养基配方（pH ）：
可溶性淀粉 20.0 g
NaCl 0.5 g
KNO3 1.0 g
K2HPO43H2O 0.5 g
MgSO47H2O 0.5 g
FeSO47H2O 0.01g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000 mL
马铃薯培养基配方（自然pH）：
马铃薯（去皮） 200.0 g
葡萄糖（或蔗糖）（Dextrose or glucose） 20.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000 mL
察氏培养基配方（自然pH）：
蔗糖（glucose） 30.0 g
NaNO3 2.0 g
K2HPO4 1.0 g
KCl 0.5 g
MgSO47H2O 0.5 g
FeSO47H2O 0.01 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000 mL
YPD培养基配方（pH ）：
酵母提取物（Yeast extract） 10.0 g
蛋白胨（Peptone） 20.0 g
葡萄糖或蔗糖（Dextrose or glucose） 20.0 g
琼脂粉（Agar） 20.0 g
去离子水 1000mL
在压力下灭菌20min。
三、实验材料
牛肉膏蛋白胨、高氏I号、LB、PDA、YPD、察氏等各种培养基。
四、仪器设备及用具
1. 90mm培养皿、吸管、试管、三角瓶、试管刷、硅胶塞、棉花、牛皮纸或报纸、包扎绳、去污粉、洗涤剂、烧杯、量筒、玻棒、牛角匙、pH试纸（pH～）、记号笔、麻绳、纱布等；
2. 培养基分装器、天平、电磁炉、微波炉、电炉、石棉网、电热鼓风干燥箱、立式高压蒸汽灭菌锅。
五、试剂
无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、马铃薯、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨（Peptone）、胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast extract）、NaCl、琼脂粉、5mol/L NaOH、
1mol/L HCl、KNO3、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO47H2O等。
六、实验步骤
1．洗涤
用试管刷蘸取少量去污粉反复刷洗器皿2～3次；用自来水冲洗 2～3次；用少量去离子水荡洗 1～2次，控干水分。
注意事项：
①不能用有腐蚀作用的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，用水充分洗干净。
②用过的器皿应立即洗涤。
③强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须到在废物缸内。
④洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠。
2．器皿包扎
（1）培养皿：洗净的培养皿烘干后每5套（或根据需要而定）叠在一起，用牢固的纸卷成一筒，或装入特制的不锈钢桶中，然后进行灭菌。
（2）吸管：洗净，烘干后的吸管，在吸口的一头塞入少许脱脂棉花，以防在使用时造成污染。塞入的棉花量要适宜，多余的棉花可用酒精灯火焰烧掉。每支吸管用一条宽约4～5cm的纸条，以30～50℃的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，另一端用剩余的纸条打成一结，以防散开，标上容量，若干支吸管包扎成一束进行灭菌，使用时，从吸管中间拧断纸条，抽出吸管。
（3）试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起过滤作用，避免空气中的微生物进入容器。制作棉塞时，要求棉花紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，松紧适宜。过紧易挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染。棉塞的长度不小于管口直径的2倍，约2/3塞进管口。若干支试管用绳扎在一起，在棉花部分外包裹油纸或牛皮纸，再用绳扎紧。三角瓶加棉塞后单个用报纸包扎。
3．烘干
洗净的仪器控去水分，放在烘箱内烘干，烘箱温度为105～110℃烘1小时左右。此法适用于一般仪器。对于急于干燥的仪器或不适于放入烘箱的较大的仪器可用吹干的办法。通常用少量乙醇、丙酮（或最后再用乙醚）倒入已控去水分的仪器中摇洗，然后用电吹风机吹至完全干燥。不急等用的仪器，可在蒸馏水冲洗后在无尘处倒置处控去水分，然后自然干燥。可用安有木钉的架子或带有透气孔的玻璃柜放置仪器。
4．培养基的配置
（1）牛肉膏蛋白胨培养基
A、称量
按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可按在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。
B、融化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。
将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入己溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。
C、调节pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达。反之，用1mol/LHCL进行调节。对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。
D、过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下可以省去（本实验勿需过滤）。
E、分装
按实验要求，可将配制的培养基分装人试管内或三角烧瓶内（见图3-1）。
a液体分装：分装高度以试管高度的l/4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减
图1-1培养基的分装
A漏斗分装装置；B自动分装装置。
1铁架；2漏斗；3孔胶管；4弹簧夹；5玻璃；6流速调节；7装量调节；8开关
少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。
b固体分装：分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
c半固体分装：试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
在分装过程中，应注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。
F、加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或硅胶塞及试管帽等），棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基，防止由此而引起的污染；另一方面保证有良好的通气性能，使培养在里面的微生物能够从外界源源不断地获得新鲜无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞，外形应象一只蘑菇，大小、松紧都应适当（见图3-2）。加塞时的棉塞的总长度的3/5应在口内，2/5在口外。
图1-2 棉塞的制作
G、包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
（2）高氏I号培养基配制方法
A、称量和溶化：按配方先称取可溶性淀粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分依次逐一溶化。对微量成分FeSO47H2O可先配成高浓度的贮备液按比例换算后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO47H2O配成0.01g/mL，再在1000mL培养基中加1mL的mL的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其溶化过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。
B、调pH、分装、包扎：灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。
（3）LB培养基配制方法
准确称量胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，氯化钠（NaCl） 10g放入一烧杯中，摇动容器直至溶质溶解，加入15～20g琼脂粉，用5 mol/L NaOH调pH至，用去离子水定容至1L，分装，灭菌20min。
（4）马铃薯培养基配制（PDA）
取去皮马铃薯200g，切成小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底。然后用双层纱布过滤，取滤液加糖（酵母菌用葡萄糖，霉菌用蔗糖），加热煮沸后加入琼脂，继续加热融化并补足失水。再按前所述，进行分装、加塞、包扎、灭菌20min。
（5）察氏培养基配制
方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
（6）YPD培养基配制
方法同LB培养基配制。
5. 灭菌
（1）高压蒸气灭菌
A、首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的去离子水，使水面与三角搁架相平为宜。
B、放回内层锅，并装入待灭菌物品（各种玻璃器皿、培养基等）。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果，三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透人棉塞。
C、加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺拴，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
D、通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾5min，以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上徘气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所得压力时，控制热源，维持压力至所需时间。
E、灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
（2）干热灭菌
A、装入待灭菌物品
将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。
B、升温
接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160～170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度。
C、恒温
当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，保温2h。
D、降温
切断电源、自然降温。
E、开箱取物
待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。
6. 无菌捡查
将灭菌培养基放入37℃的温室中培养24～48h，以检查灭菌是否彻底。
注意事项：
由于纸张和棉花在180℃以上时，容易焦化起火，所以干热灭菌的温度切勿超过180℃；
由于油纸在高温下会产生油滴，滴到电热丝上易着火，所以进行干热灭菌的玻璃器皿严禁用油纸包装；
由于温度的急剧下降，会使玻璃器皿破裂，所以烘箱的温度只有下降到60℃以下，才可打开烘箱门；
烘箱内物品不宜放得太多，以免影响空气流通，而使温度计上的温度指示不准，造成上面温度达不到，下面温度过高，影响灭菌效果。
七、思考题
1. 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长
2. 在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么
3. 在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题为什么
4. 培养基配好后为什么必须立即灭菌如何检查灭菌后培养基是否无菌
5. 你配制的高氏I号培养基有沉淀产生吗说明产生或未产生的原因。
6. 细菌能在高氏I号培养基上生长吗为了分离放线菌，你认为应该采取什么措施
培养基的制备与灭菌
实验八培养基的制备与灭菌 一、目的要求 1.掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。 2.掌握培养基的配置方法。 3.掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、基本原理 正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代 谢类型的多样性．因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序却大致相同．例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。 三、实验材料 1.药品：待配各种培养基的组成成分、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。 2.仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。 3.其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。 四、操作步骤 （一）玻璃器皿的洗涤和包装 1．玻璃器皿的洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。 2．灭菌前玻璃器皿的包装 （1）培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。（2）移液管的包扎：在移
液管的上端塞入一小，勿用脱脂棉)段棉花(它的作用是避免外界及口中杂菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应左右，0.5cm距管口约约身自长度棉花可。塞棉花时．1~1.5cm 用一外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管移液管的包扎图8-1 口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条5cm先将报纸裁成宽约℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管45报纸的一端，约成． 压紧．在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。 （二）液体及固体培养基的配制过程 1．液体培养基配制 1)称量：一般可用0.01g天平称量配制培养基所需的各种药品，先按培养基配方计算出各成分的用量．然后进行准确称量。 2)溶解：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水)，用玻璃棒搅动，加热溶解。 3)定容：待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时，可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。 4)调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH试纸，然后用镊子夹取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至达到所需pH为止。 5)过滤：用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。 2．固体培养基的配制 配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂(1.5~2％)加 入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去水分。（三）培养基的分装 根据不同需要，可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦
实验三：培养基的制备与灭菌
实验三：培养基的制备与灭菌 一、实验目的与要求： （1）熟悉玻璃器皿的洗涤包装和灭菌前的准备工作。 （2）学习微生物培养基和无菌水的制备，了解培养基配方中各成分的作用、制备流程及各环节的操作技术与应用。 （3）学习并掌握培养基的高压蒸气灭菌原理、操作关键技术和灭菌技术。 二、实验原理 培养基的制备原理 培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异。但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。 根据制备培养基对所选用的营养物质的来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基三类。按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。根据培养基使用目的，可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等。 培养基的类型和种类是多种多样的，必须根据不同的微生物和不同的目的进行选择配制，本实验分别配制常用培养细菌、放线菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基等固体培养基。 固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化。琼脂在95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内(25℃-37℃)不会融化而保持固体状态。 高压蒸气灭菌原理 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低(表Ⅴ-2)，二是湿热的穿透力比干热大(表Ⅴ-3)；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。 表Ⅴ-2 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系
培养基的配制与灭菌实验报告
培养基的配制与灭菌实验报告 （文章一）：培养基的制备与灭菌实验报告xx师范大学远程教育学院生物学实验报告报告题目培养基的制备与灭菌姓名刘伟学号专业生物科学批次/层次指导教师学习中心培养基的制备与灭菌 （一）、目的要求 1. 掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。 2. 掌握培养基的配置原则和方法。 3. 掌握高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。 （二）、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基：是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。高压蒸汽灭菌：主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，获得高于100℃的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。 （三）、实验材料 1. 药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。
2. 仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。 3. 其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。 （四）、操作步骤（一）玻璃器皿的洗涤和包装1．玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。2．灭菌前玻璃器皿的包装（1）培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。（2）移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作用是避免外界及口中杂菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花自身长度约1~ 1.5cm。塞棉花时．可用一外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管压紧．在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。（二）液体及固体培养基的配制过程1．液体培养基配制（1）称量（假定配制1000ml 培养基）按培养基配方比例依次准确地称取
培养基的配制
培养基: 培养基，是指供给微生物、植物或动物（或组织）生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质。一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）、维生素和水等几大类物质。培养基既是提供细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境。培养基种类很多，根据配制原料的来源可分为自然培养基、合成培养基、半合成培养基；根据物理状态可分为固体培养基、液体培养基、半固体培养基；根据培养功能可分为基础培养基、选择培养基、加富培养基、鉴别培养基等；根据使用范围可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基、真菌培养基等。培养基配成后一般需测试并调节pH，还须进行灭菌，通常有高温灭菌和过滤灭菌。培养基由于富含营养物质，易被污染或变质。配好后不宜久置，最好现配现用。 培养基的配制： 一、配制用水 培养基的大部分是水，所以水的质量直接影响培养基的质量。按Waymouth标准，水的电阻应为200万欧姆，一般实验室里以玻璃蒸馏器制备的 双蒸水或三蒸水可以符合使用条件。 二、培养基 培养基有天然、人工两种。一般实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基，以双蒸或三蒸水配制。NaHCO3（或HCl）调pH至7.2-7.4，
若pH值超过7.6或远低于6.8，则大多数细胞不能生长。RPMI-1640不耐高压灭菌，使用前需经灭菌0.22μm孔径滤膜滤过处理。 三、血清 培养中常使用小牛血清（或胎牛血清）。血清亦不能高压灭菌，无菌的小牛血清需在56℃水浴30分钟灭活补体，置4℃冰箱存放待用。配制时含量视培养细胞种类、时间而定，一般用10—15%。由于血清成分复杂、条件不易控制，可选用无血清培养基。 四、抗菌素 为防止培养时期细菌的污染，可在培养基中添加适当抗菌素，一般用量与组织细胞培养相同：卡那霉素100单位/毫升，或双抗--青霉素100单位/毫升，链霉素100微克/毫升。 五、植物血凝素（PHA） 非增殖期的细胞不能制备染色体，如人外周血淋巴细胞，但在离体培养过程中，在PHA的作用下，可被刺激转化为淋巴母细胞而进入有丝分裂。 经实验测定其分裂高峰分别于培养后44-48小时和68-72小时。 PHA有粘多糖，蛋白质两种重要成分。粘多糖促使有丝分裂，蛋白质起凝集作用。PHA激活的细胞数随其浓度而增加，直至全部免疫活性细胞均 被激活为止，但PHA浓度过高会引起凝集，一般采用4%浓度为好。
培养基的配置和灭菌
培养基的制备与灭菌 一、目的要求 1.掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。 2.掌握培养基的配置原则和方法。 3.掌握高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。 二、基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基：是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。 高压蒸汽灭菌：主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，获得高于100℃的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。 三、实验材料 1.药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。 2.仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。 3.其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。 四、操作步骤 （一）玻璃器皿的洗涤和包装 1．玻璃器皿的洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。 2．灭菌前玻璃器皿的包装 （1）培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。 （2）移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作用是避免外界及口中杂菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花自身长度约1~1.5cm。塞棉花时．可用一外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。 先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管压紧．在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。 （二）液体及固体培养基的配制过程1．液体培养基配制 （1）称量（假定配制1000ml培养基） 按培养基配方比例依次准确地称取3.0g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0gNaCl放入烧杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。 （2）溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量（如约700ml），用玻棒搅匀，然后，在石棉网上
实验一 培养基的制备与灭菌
实验一培养基的制备与灭菌 一、实验目的 1. 了解配制培养基的一般方法和步骤;掌握牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯葡萄糖(蔗糖)培养基的制备方法。 2. 了解灭菌的原理，掌握高压蒸气灭菌的操作方法。 二、实验器材 1. 药品:牛肉膏;蛋白胨;氯化钠;葡萄糖(蔗糖);琼脂;1N NaOH;1N HCl等。 2. 仪器及其他:试管;锥形瓶;量杯;玻璃棒;漏斗;纱布;棉花;报纸;天平或台秤;马铃薯;电炉;铝锅;灭菌锅等。 三、实验方法 (一)配制培养基的基本过程: (1)称量:按照培养基配方，称取各种原料放于锅中; (2)溶解:锅中加入所需水量(自来水)，加热溶解。要不断搅拌，以免糊底烧焦，最后加水补足失去的水分; (3)调pH值:按配方要求调节; (4)过滤:用过滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求，此步可以省去。 (5)分装:按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分装量:斜面培养基装入的培养基约为试管高度的l/5,1/4，灭菌后制成斜 面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。 (6)加棉塞:试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。
制作棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可以用折叠卷塞法制作棉塞(见图)。 棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，以瓶、管不下落为准。 棉塞的2/3应在管内，上端露出1/3，便于提拔。如制作时不慎沾上培养基则不可再用。 (7)包扎:加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用笔注明培养基名称、组别、日期。 (8)灭菌:将上述培养基于121.3?湿热灭菌30min。 (9)摆斜面:灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2。 (10)无菌检查:将灭菌的培养基放入37?温箱中培养24,48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。 (二)灭菌方法采用高压蒸气灭菌法灭菌，步骤如下: (1)打开锅盖，内层锅装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 (2)加适量水。 (3)加盖，旋紧螺栓，勿使漏气。
培养基配方及配制方法
培养基配方 1 斜面菌种保存培养基 1.1PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基） 称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸0.5h，纱布过滤，滤液补足1000ml，再加15g葡萄糖和15-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 1.2麦芽汁琼脂培养基 麦芽汁的制备：干麦芽首先进行粉碎（不能太粗，也不必太细。太粗影响糖化效率，过细影响过滤速度），按麦芽重量的3~4倍加水，搅拌均匀后，37℃左右浸泡1小时，然后缓缓加温至55~63℃（在升温过程中应不断搅拌使温度均匀），保温4~6小时（用0.02摩尔/升碘液测定为黄色至无色时），糖化结束。在糖化过程中，应每小时搅拌一次。取过滤后的清液，加1.8%琼脂，分装试管，每试管约5-10ml （视试管大小而定），121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 2 基菌落总数检测 2.1平板计数琼脂培养基 将胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g 加入蒸馏水1000ml中，煮沸溶解后，调pH，然后在121℃下灭菌15min，取出，稍微冷却后，带热倒入培养皿中。 3志贺氏菌检测
3.1 GN增菌液 成分：胰蛋白胨：20g，葡萄糖：1g，甘露醇：2g，柠檬酸钠：5g，去氧胆酸钠0.5g，磷酸二氢钾4g，磷酸氢二钾1.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。pH7.0 制法：将上述物品加入蒸馏水中，加热溶解煮沸，调pH为7.0，分装，在115℃高压灭菌15min。 3.2 HE琼脂 成分：胨：12g，牛肉膏3g，乳糖12g，蔗糖12g，水杨素2g，胆碱20g，氯化钠5g，琼脂18~20g，蒸馏水1000ml0，0.4%溴麝香草酚蓝溶液16ml，Andrade指示剂20ml.，甲液20ml，乙液20ml。pH7.5 制法：将上述前七种成分加入400ml蒸馏水中作为基础液，将琼脂加入到600ml蒸馏水中加热溶解，加入甲液乙液到基础液中，调pH，再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷却至50~55℃，倾注浇平板。注1：此培养基不能高温灭菌。 注2：甲液的配置： 硫代硫酸钠：34g，柠檬酸铁钠：4g，蒸馏水：100ml。 注3：乙液的配置： 去氧胆酸钠：10g，蒸馏水：100ml。 注4：Andrade指示剂的配置： 酸性复红：0.5g，1mol/l的氢氧化钠溶液：16ml，蒸馏水：100ml。将酸性复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液，数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1~2ml。
培养基配制、分装和灭菌
一、实验目的 1了解并掌握培养基的配制、分装方法； 2掌握各种实验室灭菌方法及技术。 二、实验原理 培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。 琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。 任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。 三、实验材料 1、器皿及材料 天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。 2、药品试剂 蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。 3、流程 称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。 四、实验步骤 1 培养基的制备 1.1 称量药品 根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 1.2 溶解 用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。 1.3 调节pH 根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。 1.4 溶化琼脂 固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。 1.5 过滤分装 分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。
培养基配方及配制方法
培养基配方1 斜面菌种保存培养基 培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基） 称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸，纱布过滤，滤液补足1000ml，再加15g葡萄糖和15-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 麦芽汁琼脂培养基 麦芽汁的制备：干麦芽首先进行粉碎（不能太粗，也不必太细。太粗影响糖化效率，过细影响过滤速度），按麦芽重量的3~4倍加水，搅拌均匀后，37℃左右浸泡1小时，然后缓缓加温至55~63℃（在升温过程中应不断搅拌使温度均匀），保温4~6小时（用摩尔/升碘液测定为黄色至无色时），糖化结束。在糖化过程中，应每小时搅拌一次。取过滤后的清液，加%琼脂，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 2 基菌落总数检测 平板计数琼脂培养基 将?胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g 加入蒸馏水1000ml中，煮沸溶解后，调pH，然后在121℃下灭菌15min，取出，稍微冷却后，带热倒入培养皿中。
3志贺氏菌检测 GN增菌液 成分：胰蛋白胨：20g，葡萄糖：1g，甘露醇：2g，柠檬酸钠：5g，去氧胆酸钠0.5g，磷酸二氢钾4g，磷酸氢二钾1.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。 制法：将上述物品加入蒸馏水中，加热溶解煮沸，调pH为，分装，在115℃高压灭菌15min。 HE琼脂 成分：胨：12g，牛肉膏3g，乳糖12g，蔗糖12g，水杨素2g，胆碱20g，氯化钠5g，琼脂18~20g，蒸馏水1000ml0，%溴麝香草酚蓝溶液16ml，Andrade指示剂20ml.，甲液20ml，乙液20ml。 制法：将上述前七种成分加入400ml蒸馏水中作为基础液，将琼脂加入到600ml蒸馏水中加热溶解，加入甲液乙液到基础液中，调pH，再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷却至50~55℃，倾注浇平板。注1：此培养基不能高温灭菌。 注2：甲液的配置： 硫代硫酸钠：34g，柠檬酸铁钠：4g，蒸馏水：100ml。 注3：乙液的配置： 去氧胆酸钠：10g，蒸馏水：100ml。 注4：Andrade指示剂的配置： 酸性复红：0.5g，1mol/l的氢氧化钠溶液：16ml，蒸馏水：100ml。将酸性复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液，数小时后如复红褪
培养基的配制和灭菌
培养基的配制和灭菌 姓名 摘要：培养基是人工配制的供给细菌或其他微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。培养基须经灭菌后方可使用。培养基一般采用高压蒸汽灭菌法灭菌。此次实验我们配制LB（Luria Broth）培养基和麦康凯（MacConkey）培养基并进行高压蒸汽灭菌，目的是掌握LB培养基和麦康凯培养基的配制方法，了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围，并且熟悉培养基的灭菌方法。通过此次实验，我们成功地进行了LB培养基和麦康凯培养基的配制，熟悉了培养基的灭菌方法，达到了预期目的。 关键词：LB培养基麦康凯培养基高压蒸汽灭菌 培养基是人工配制的供给细菌或其他微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。培养基必须具备下列条件：碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子、水分和合适的pH。培养基种类较多，按其营养物来源不同，可分为天然培养基和合成培养基；按其物理状态分为液体、固体、半固体三种类型。在一定的条件下，培养繁殖得到的微生物群体叫做培养物。培养物分为纯培养物和混合培养物。只有一种微生物的培养物叫做纯培养物，含有多种微生物的培养物叫做混合培养物。通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果，自然环境中极少存在纯培养物，纯培养物通常是由人工方法获得的。获得纯培养的关键一是所有的相关物品必须无菌，二是分离出单个的微生物细胞并将其培养成一个群体。因此，无菌技术是保证微生物学研究正常进行的关键。 在分离、转接和培养纯培养时，防止其被其他微生物污染的技术称为无菌技术。无菌技术包括灭菌和无菌操作。灭菌是杀死包括芽孢在内的所有微生物。灭菌的目的是让用于分离、培养微生物的器具和基质事先不含任何微生物。微生物培养的常用器具（例如试管、三角瓶、培养皿等）和培养基都需要灭菌。无菌操作要在火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行，并且接种工具（接种环、接种针等）需要灼烧灭菌。 培养基一般采用高压蒸汽灭菌法灭菌。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。高温使蛋白质、核酸等重要生物大分子发生变性、破坏，以及破坏细胞膜上的类脂成分，导致微生物死亡。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。 1.材料和方法 1.1材料和试剂 实验试剂：蛋白胨、酵母粉、NaCl、NaOH、琼脂、麦康凯培养基、去离子水 实验器材：2个300mL三角瓶、2个100mL三角瓶、1个500mL三角瓶、量筒、电子天平、称量纸、称量匙、500mL烧杯或搪瓷缸、试管、pH试纸、电炉、高压蒸汽灭菌锅 1.2方法 1.2.1 LB培养基的配制方法 ①清洗三角瓶。需要清洗2个300mL三角瓶和2个100mL三角瓶。三角瓶用自来水洗净， 然后蒸馏水冲洗2遍，最后沥干。
培养基的制备与灭菌
培养基的制备与灭菌 实验八培养基的制备与灭菌 一、目的要求 1.掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。 2.掌握培养基的配置方法。 3.掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方
法。 二、基本原理 正确掌握培养基的配制方法是从事微 生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代 谢类型的多样性．因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序却大致相同．例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本 环节大致相同。 三、实验材料 1.药品：待配各种培养基的组成成分、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。 2.仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。 试纸、记号笔、其他物品：药匙、称量纸、pH3.
棉花等。四、操作步骤（一）玻璃器皿 的洗涤和包装 1．玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、用量筒等浸入含有洗涤剂的水中．培养皿、试管、移液管然后用自来水及蒸馏水冲净。毛刷刷洗，再用自来水及蒸馏水先用含有洗涤剂的水浸泡，洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备冲洗。用。．灭菌前玻璃器皿的包装2培养皿由一盖一底组成一培养皿的包扎：1（）或者将套，可用报纸将几套培养 皿包成一包，加盖几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。移液管2）（ 的包扎：在移液管的上端塞入一小勿花(棉段移液管的包扎8-1 图 用脱脂棉)，它的作用是避免外界及口中杂 菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花 自身长度约1~1.5cm。塞棉花时．可用一 外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不
培养基的配制及灭菌实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除培养基的配制及灭菌实验报告 篇一：培养基的制备与灭菌实验报告(详细) 一、实验题目：培养基的制备与灭菌 二、实验目的： 1、明确培养基的配置原则，掌握配置方法。 2、了解灭菌的原理，学习掌握灭菌器的使用方法。 三、实验器材： 1、药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水、琼脂。 2、仪器：三角瓶、培养皿、试管、线绳、棉花、烧杯、报纸、移液管、试管架、铁针、量筒。 四、实验原理： 1、培养基的制备 包括一下几种成分： （1）水分：主要成分。 （2）n源：包括无机氮和有机氮。 （3）c源：主要是含碳有机物、碳氢化合物等。 （4）无机盐：如nacl、Kh2po4等。
微量元素：cu、K、mg、s、p、Zn。 有些还需要添加“生长因子”，通常是维生素类、某些 氨基酸或核酸等。 2、培养基配置的原则 根据不同的培养对象及培养目的，选用不同的培养基，但有机物总量不得超过15%，盐类一般不超过1%。 培养基有以下分类： 按成分：天然培养基、合成培养基、半合成培养基 按状态：固体培养基、半固体培养基、液体培养基 按用途：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基 培养基配好后应立即灭菌，防止营养物质中的微生物富集。 3、灭菌： 用理化手段杀灭一切微生物的营养体，包括芽孢和孢子，在实验中应对所有仪器、操作场所、药品及培养基灭菌或消毒。 （1）高压蒸汽灭菌：将物品放入封闭的加压灭菌器， 加热使灭菌锅套间的水沸腾产生蒸汽，将冷空气排尽，压力上升，使水沸点变高，导致菌体蛋白质变性，一般0.1mpa、121℃、15~30min可以彻底灭菌，本次实验灭菌20min。若 是含糖培养基，110℃、30min。
培养基的制备与灭菌.
实训六 培养基的制备与灭菌 一、实训目标 知道培养基的用途，能根据不同微生物和不同培养目的选择培养基类型。学会常用培养基的配制、分装、无菌操作方法。了解高压蒸汽灭菌和干热灭菌的基本原理及应用范围，学会高压蒸汽灭菌和干热灭菌的操作步骤与方法。 二、实训材料用具 1．材料与药品：马铃薯、蔗糖（葡萄糖）、琼脂、可溶性淀粉、牛肉膏、蛋白胨、1 mol/L NaOH 、 1 mol/L HCl 、K2HPO4、KNO3、MgSO4?7 H2O 、FeSO4?7 H2O 等。 2．仪器与用具：灭菌室、超净工作台或接种箱、恒温箱、烘箱或红外线干燥箱、紫外线灭菌灯、电炉、铝锅、天平、烧杯、量筒、培养皿、高压灭菌锅、pH 试纸(5.5～9.0)、试管、三角瓶、铁丝试管筐、试管架、漏斗及漏斗架、玻璃棒、纱布、棉花、牛皮纸、绳、记号笔等。 三、实训步骤与要求 （一）配制培养基 1.配方 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA ）主要用于植物病原菌物的分离和培养，有时也用于植物病原细菌；牛肉膏蛋白胨培养基（NA ）主要用于细菌的分离和培养。 2.配制流程 （1）称量原料 按配方比例准确称量各种原料，马铃薯称重前需洗净去皮。 （2）溶化原料 制备PDA 培养基的马铃薯要切成小块，加水煮沸约0.5 h 后，用纱布滤去马铃薯残渣，在马铃薯滤液中加入琼脂，继续加热使琼脂完全溶化。注意溶化琼脂过程中要控制火力的大小并不断搅拌，以免溢出或烧焦；待琼脂完全溶化后应补充加热过程中蒸发的水分，以保持溶液的浓度。牛肉膏蛋白胨培养基先将琼脂加水煮至溶化后，再将其他原料溶于水中。 （3）调节pH PDA 培养基略带酸性，培养菌物一般不需调节pH 。培养细菌一般需调节pH 至 7.2～7.4，可用l mol ／L NaOH 或 1 mol ／L HCl 溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH 或HCI 溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。
常用培养基的配制
常用培养基的配制 （一）营养琼脂培养基 【用途】供细菌总数测定、保存菌种、细菌纯化、一般细菌培养、血琼脂培养基基础之用。 【成分】牛肉膏 3g NaCl 5g 蛋白胨 10g 琼脂 20g 【pH值】7.2±0.2 【制法】上述成分称取38g加蒸馏水1000ml，经121.3℃ 30min高压灭菌备用。 （二）蛋白胨水培养基 【用途】供细菌培养、吲哚试验之用。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 【pH值】7.6 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，过滤，分装于试管，每管2～3ml，经121.3℃20min高压灭菌备用。 （三）半固体培养基 【用途】供观察细菌动力、菌种保存、H抗原位相变异试验等。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 琼脂 2.5～3g 【pH值】7.6 【制法】上述成分加入1000ml蒸馏水中，加热溶解，分装于试管，每管3～4ml，经121.3℃ 20min高压灭菌备用。 （四）营养肉汤培养基 【用途】供一般细菌培养、转种、复苏、增菌等，也可用于消毒效果的测定。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 牛肉粉（牛肉浸汁） 3g 【pH值】7.2±0.2 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，分装小试管，每管2～3ml，经121.3℃ 20min 高压灭菌备用。 （五）葡萄糖蛋白胨水培养基 【用途】供甲基红试验及V-P试验之用。 【成分】蛋白胨5g 葡萄糖5g K2HPO4 (K2HPO4·3H2O) 5g (0.65g) 【pH值】7.0～7.2 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，过滤，分装试管，每管2～3ml，经112.6 ℃ 20min高压灭菌备用。 （六）伊红美蓝培养基（EMB培养基）
实验一 MS培养基配制和灭菌
实验一MS培养基配制和灭菌 一．目的和要求： 1. 学会MS培养基的制作方法; 2. 掌握高压灭菌的方法和基本操作。 二、仪器与试剂 1. 仪器：灭菌锅、解剖刀、枪状镊子、烧杯（500ml）、培养皿、移液管等 2. 试剂：MS的Macro-e、Micro-e、有机母液、Fe盐、肌醇蔗糖，琼脂粉，1N NaoH 和1N HCl 三、方法步骤 （一）配方设计: 以MS为基本培养基（mg/L） （二）配制培养基 (1)溶化琼脂：量取300ml左右蒸馏水，加入4.8g琼脂粉，加热溶解直至完全融化。 (2) 各种母液的吸取：Macro-e 50ml Micro-e 1ml 有机成分1ml Fe盐5ml 肌醇10ml 加在一起，倒入烧杯（1L) （3）加入糖:称取30g 蔗糖，溶于溶有琼脂的300ml 蒸馏水中。
（4）根据实验设计，量取生长调节剂:加在一起，倒入烧杯。 （5）定容:加蒸馏水（用量杯）。 （6）调节pH至，用pH试纸进行测定，用1molHcl或1Mol NaoH调节。 （7）分装:30～40 ml/瓶6，培养基勿碰三角瓶口。 （8）用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。 （三）灭菌：用高压蒸汽消毒器灭菌，其压力为～,温度为120～126℃，保持15~20 min。 具体操作步骤： 1. 加水； 2. 把包扎好的培养基装入高压锅； 3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀； 4. 加热； 5. 排除冷空气； 6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到1Kg位置时，开始计算灭菌时间，一般在1Kg 压力(121℃)下灭菌15~20 分钟即可，但要注意保持稳定压力。 7. 灭菌时间达到20 分钟后，停止加热，待压力自动降到0磅时，打开放气阀，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。 四.作业 1. 总结配制培养基的注意事项。 2. 制作培养基前为何要提前配制母液
细胞培养基及其配制方法
D M E M(A)细胞培养基（粉末型）成分
DMEM(H) 细胞培养基（粉末型）成分 DMEM(L) 细胞培养基（粉末型）成分
双蒸水。（2）在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基，轻轻搅拌，不要加热。 （3）水洗包装袋的内部，转移全部的痕量干粉到容器内。 （4）加NaHCO3到培养基中。 （5）用双蒸水稀释到想要的体积，搅拌溶解。注意不要过分搅拌。 （6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值，由于pH值在过滤时会上升到，因而调节pH值使它比最终想要的pH值低到。培养基在过滤前要保持密封。 配制培养基要注意以下问题： ●认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。 ●配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。 ●配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。 ●所用器皿应严格消毒。 ●配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。
●液体培养基主要是为了科研工作的方便而设计的培养基，它是一种灭菌后保证无菌的溶液，必要时可制成无内毒素等的溶液，可节省科研人员的工作量。 DMEM各种成分都有什么作用 一般的基础培养基包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。 （1）无机盐：对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。 （2）氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)都是细胞用以合成蛋白质的必需氨基酸，不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外，还需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，对细胞的培养特别重要，能促进各种氨基酸进入细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中最好单独配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培养液中。 （3）维生素：是维持细胞生长的一种生物活性物质，在细胞中大多形成
[整理]1实验一培养基的制备和灭菌
实验一培养基的制备和灭菌 一、实验目的 (一)熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。 (二)掌握培养基和无菌水的制备方法。 (三)掌握高压蒸汽灭菌技术。 二、基本原理 培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质用人工方法配制而成的基质。其中含有水分、碳水化合物、含氮化合物、无机盐及各种必要的维生素。培养基可以为微生物的生长提供能源、组成菌体细胞的原料以及调节代谢活动。由于不同微生物营养类型不同，对营养物质的要求也各不相同，因此，需要配制不同种类的培养基。一般培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用淀粉培养基，培养霉菌常用马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基（或麦芽糖、蛋白胨培养基）。培养基除了要满足微生物生长所要求的各种营养物质外，还应保证微生物所需要的其他生活条件，如适宜的酸碱度，渗透压等，因此，根据不同种类微生物的要求，应将培养基调节到一定的pH范围，如，细菌培养基中性偏碱、放线菌培养基偏碱、霉菌、酵母菌培养基偏酸。 根据研究的不同，可以将培养基制成固体、半固体和液体三种形式，固体培养基的成分与液体相同，仅在液体培养基中加入凝固剂作支持物，通常加入 0.5~2.0 %的琼脂，半固体加入0.3~0.5 %琼脂作支持物，有时也可用明胶或硅胶作为凝固剂。 培养基的种类很多，它们的配方及配制方法虽各有差异，但一般培养基的配制程序却大致相同。例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内冷空气从排气阀中
实验一 培养基的制备和灭菌
实验一 培养基的制备和灭菌 培养基的制备 一、 实验目的 1. 了解配制培养基的原理和熟悉常用培养基的名称。 2. 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步 骤。 二、 实验原理 培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配置而成的一种混和营养基质，用以培养或分离各种微生物。因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素）和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 微生物的生长繁殖除需一定的营养物质以外，还要求适当的pH范围。不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基是中性或偏碱性的。所以配制培养基时，都要根据不同微生物对象用稀酸或稀碱将培养基的pH调到合适的范围。 但配制pH低的琼脂培养基时，如预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固，因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混 合，或在中性pH条件下灭菌后，在调整pH。 此外，由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，此外，已配制好的培养基必须立即灭菌，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基的酸碱度而带来的不利影响。 以牛肉膏蛋白胨培养为例，牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛 和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基，由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。 牛肉膏蛋白胨培养配方： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 15－20g 水 1000ml －7.4