食品检验与分析实验思考题及其复习资料

食品检验与分析实验思考题参考答案

实验一相对密度、折射率及旋光度的测定

一、实验原理

相对密度、折射率与物质的熔点和沸点一样，也是物质的物理特性。通过测定液态食品的这些特性，可以指导生产过程、保证产品质量以及鉴别食品组成、确定食品浓度、判断食品的纯净程度及品质。

测定液体的相对密度方法通常有密度瓶法、相对密度天平法和密度计法，本实验以密度瓶法测相对密度。利用同一密度瓶在一定温度下，分别称取等体积的样品试液与蒸馏水的质量，两者的质量之比，即为该试液的相对密度。

利用阿贝折光仪测得一定温度下糖溶液的折光率，根据折光率与可溶性固形物的关系表格，以及温度校正得到糖溶液的浓度。

二、实验步骤

1.相对密度的测定

取洁净、干燥、准确称量的密度瓶，装满试样后装上温度计（瓶中应无气泡），立即浸入20±0.1℃的恒温水浴锅中，至密度瓶温度计达20℃并保持20－30分钟不变后，取出，用滤纸除去溢出侧管的水，立即盖上侧管罩，擦干后用分析天平称量。

将密度瓶中试样倾出，洗净密度瓶。以煮沸30分钟并冷却至约15℃的蒸馏水注满密度瓶，按上法同样操作即得20℃时水的质量。

2、折射率的测定

2.1、样品溶液的准备

2.2、熟悉仪器

2.3、测定

2.3.1、校正阿贝折光仪

通常用测定蒸馏水折射率的方法进行校正，即在标准温度（20℃）下折光仪应表示出折射率为1.33299或0%可溶性固形物。若温度不在20℃时，折射率也有所不同，教材上附有一定温度下纯水折射率表。

2.3.2、测定样品溶液（1）滴加1~2滴样品试液于下面棱镜上，迅速将两块棱镜闭合，调整反光镜，使光线射进棱镜中。（2）用目观察，转动棱镜旋钮，使视野分成明暗两部分。（3）旋转补偿器旋钮，使视野中除黑白两色外，无其他颜色。（4）转动棱镜旋钮，使明暗分界线在十字线交叉点。（5）通过放大镜在刻度尺上进行读数。

若在20℃时测定，得到的读数即为可溶性固形物的折射率，查折射率与可溶性固形物的关系表，即可得糖浓度。

若测定温度非20℃，而是在室温下时，需记下试验时的温度并读取其折射率，查折射率与可溶性固形物的关系表，先查出可溶性固形物，再查温度校正表按实际测定时的温度进行校正。

若测量浓度为30℃，测得固形物含量为15％，由表中查得30℃时的修正值为0.78，则糖成分的准确读数为15%+0.78%，若测量温度为16℃，测定值为40％－0.30%=39.70%.

三、注意事项

1.仪器严禁油或汗手触及光学零件。

2.避免强烈振动或撞击仪器。

四、思考题

1、在测定液体的相对密度时，为什么要注意控制并在结果中表现出温度条件？

答：相对密度是指在一定温度下，某一物质的质量与同体积同温度下水的质量之比。相对密度随温度的变化而异，故必须控制温度条件。

2、在测定液体的折射率时，为什么要记录测定温度？

答：溶液的折射率随温度的变化而变化。温度升高，折射率减小；温度降低，折射率增大。折光仪上的刻度是在标准温度20℃是刻制的。若温度不是20℃，则应进行校正。故必须记录测定温度

3、在食品工业生产实践中，折光仪多用于测定哪些物质？

答：折光仪可用于测定含糖饮料、糖水罐头、果汁等的糖度及可溶性固形物含量；测定生长果蔬以判断其成熟度；测油脂的组成和品质；测果酱、番茄酱的固形物含量等。

4、影响旋光度的因素有哪些？

答：影响旋光度的因素有：光源的波长，测定温度，光学活性物质的种类、浓度，液层的厚度等。

5、旋光物质的左旋、右旋是如何定义和划分的？

答：分子结构中凡有不对称原子，能把偏振光的偏振面旋转一定角度的物质称光学活性物质。许多食品成分都具有光学活性，其中能将偏振光的偏振面向右旋转的，称为具有“右旋性”；反之，称为具有“左旋性”。

实验二全脂乳粉中水分与灰分的测定

一、实验原理

食品中水分的常用测定方法有直接干燥法、减压干燥法和蒸馏法。本实验采用干燥法测全脂乳粉中的水分，方法是利用常压烘箱干燥法将乳粉在98-105℃烘箱内干燥，以其失重来测定乳粉中水分的含量。

将食品经炭化后置500-600℃高温炉内灼烧，食品中的水分及挥发物质以气态放出，有机物质中的碳、氢、氮等元素与有机物质本身的及空气中的氧生成二氧化碳、氮的氧化物及

水分散失，无机物质以硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐等无机盐和金属氧化物的形式残留下来，这些残留物称为灰分。

二、实验步骤

1.水分的测定

取洁净铝制或玻璃制的扁形称量瓶，置于98℃-105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，加热0.5h-1.Oh，取出盖好，置干燥器内冷却O.5h，称量，并重复干燥至恒量。称取3.00g-5.00g 全脂乳粉，放入此称量瓶中，试样厚度约为5mm。加盖，精密称量后，置98℃-100℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2h-4h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。然后再放入98℃-100℃干燥箱中干燥1h左右，取出，放干燥器内冷却0.5h后再称量。至前后两次质量差不超过2mg，即为恒量。

2.灰分的测定

(1)取大小适宜的坩埚用HCL（1：4）煮沸，洗净，置高温电炉中，在550℃±25℃灼烧0.5小时，冷却至200℃以下后，取出，放入干燥器中冷至室温，准确称量，并重复灼烧至恒量。

(2)加入2-3g固体样品或5-10g液体样品后，准确称量。(3)液体样品须先在沸水浴上蒸干。固体或蒸后的样品，先以小火加热使样品充分炭化至无烟，然后置高温电炉中，在550℃±25℃灼烧4小时。冷至200℃以下后取出放入干燥器中冷却30min，在称量前如灼烧残渣有炭粒时，向试样中滴入少许水湿润，使结块松散，蒸出水分再次灼烧直至无炭粒即灰化完全，准确称量。重复灼烧至前后两次称量相差不超过0.5mg恒量。

三、注意事项

1、直接干燥法的设备和操作都比较简单，但是由于直接干燥法不能完全排出食品中的结合水，所以它不可能测定出食品中的真实水分水量。

2、干燥法耗时较长，不适宜胶态、高脂肪、高糖食品及含有较多的高温易氧化、易挥发物质的食品。

3、用这种方法测得的水分质量中包含了所有在100℃下失去的挥发物的质量。

4、含有较多氨基酸、蛋白质及羰基化合物的样品，长时间加热则会发生羰氨反应析出水分而导致误差。

5.样品炭化时要注意热源强度，防止产生大量泡沫溢出坩埚。

6. 把坩埚放入高温炉或从炉中取出时，要在炉口停留片刻，使坩埚预热或冷却，防止因温度剧变而使坩埚破裂。

7、灼烧后的坩埚应冷却到200℃以下再移入干燥器中，否则因热的对流作用，易造成残灰

飞散，且冷却速度慢，冷却后干燥器内形成较大真空，盖子不易打开。

8、从干燥器内取出坩埚时，因内部形成真空，开盖恢复常压时，应注意使空气缓缓流入，以防残灰飞散。

四、思考题

1、在下列情况下，水分测定的结果是偏高还是偏低？

（1）样品粉碎不充分；（2）样品中含有较多挥发性成分；（3）脂肪的氧化；（4）样品的吸湿性较强；（5）发生美拉德反应；（6）样品的表面结了硬皮；（7）装有样品的干燥器未密封好；（8）干燥器中硅胶已受潮失效。

答：（1）（4）（5）（6）（7）（8）偏低；（2）（3）偏高。

2、干燥器有何作用？怎样正确地使用和维护干燥器？

答：干燥器可以吸收水分，干燥物质而防止被干燥的物质与空气进行物质、能量交换引起的误差。

打开干燥器的盖子时，应沿干燥器口轻轻移开，迅速放入需干燥的物质后，并及时推上盖子盖好；盖子应拿在右手中，左手放入或取出被干燥的坩埚或称量瓶；坩埚或称量瓶放入干燥器时，应放在瓷板圆孔内，若比圆孔小，则应放在瓷板上；干燥器要保持干燥洁净，使用前在磨口上涂凡士林，烘干多孔瓷板；干燥器内一般采用硅胶做干燥剂，当其颜色由蓝色减退变为红色时，应及时更换，变色硅胶于135℃下烘干2~3消失后可重新使用。

3、为什么经加热干燥的称量瓶要迅速放到干燥器内？为什么要冷却后再称量？

答:迅速放入干燥器内是为了防止称量瓶内的物质与周围空气进行物质、能量交换而发生质量变化，造成误差。

热的称量瓶可能会吸收空气中的水分等，使测量结果不准确。

4、测定食品中灰分的意义何在？

答：（1）判断食品受污染程度；（2）作为评价食品的质量指标；（3）测定植物性原料的灰分可以反映植物生长的程度和自然条件对其影响，测定动物性原料的灰分可反映动物品种、饲料组分对其的影响。

5、为什么样品在高温灼烧前要先炭化至无烟？

答：炭化处理可防止在灼烧时因温度高，试样中的水分急剧蒸发使试样飞扬，防止糖、蛋白质、淀粉等易发泡膨胀的物质在高温下发泡膨胀而溢出坩埚，不经炭化直接灰化，碳粒易被包住，灰化不完全。

6、样品经长时间灼烧后，灰分中仍有碳粒遗留的主要原因是什么？如何处理?

答：主要原因有:样品没有炭化直接灰化；或灰化温度过高，磷酸盐、硅酸盐类会熔融，将碳粒包藏未被氧化；或灼烧温度没有达到要求。

解决方法：先炭化再灰化；在样品中加入少量热水，搅拌使可溶性盐溶解，使被包住的碳粒暴露，在水浴上蒸发至干，置烘箱内充分干燥，再灼烧至恒重；适当提高灼烧温度。

7、如何判断是否灰化完全?

答：一般灼烧至灰分呈白色或浅灰色，无碳粒存在并达到恒重为止。但有些样品即使灰化完全，残灰颜色也不一定是白色或浅灰色，故反复灼烧至恒重是判断灰化是否完全的最可靠的方法。

实验三果蔬总酸度的测定（直接滴定法）

一、实验原理

食品中总酸度包括未离解的酸的浓度和已离解的酸的浓度，其大小可用标准碱溶液滴定

法来确定。果蔬含酸量以主要的酸含量来表示。

二、实验步骤

1、0.1moL/L标准氢氧化钠溶液的配制

用小烧杯在台称上称取4g分析纯氢氧化钠，加100mL蒸馏水，全部溶解后，倾入另一清洁的试剂瓶中，加蒸馏水稀释至1000mL。用橡皮塞塞住瓶口，充分搅匀。

2、标准氢氧化钠溶液的的标定

将邻苯二甲酸氢钾于120℃烘箱中干燥至恒重，冷却25分钟，准确称取0.3-0.4g于250mL 锥形瓶中,加100mL蒸馏水使之溶解,加入2-3滴酚酞指示剂，用以上配置好的氢氧化钠标准溶液滴定至微红色，记下所用氢氧化钠的毫升数，

并按下式计算此氢氧化钠标准溶液的物质的量浓度（摩尔/升）C=W/（V×0.2042）

式中：V—滴定时所耗氢氧化钠标准溶液的毫升数W—邻苯二甲酸氢钾的克数

0.2042—与1.00mL氢氧化钠标准溶液相当的以克表示的KHC8H4O4的质量。

3、样品总酸度的测定

1）用榨汁机将果蔬榨汁。

2）准确称取混合均匀的样品10.0g（或吸10.0mL样品液），转移到100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。用滤纸过滤，准确吸取滤液20mL，注入100mL锥形瓶中，加入酚酞指示剂3-4滴。用标定的氢氧化钠溶液滴定至浅红色半分钟不退，记下氢氧化钠用量，重复三次，取平均值。

3）空白试验，同时取30-40mL蒸馏水做空白试验。

三、注意事项

1、若滤液有颜色，可在滴之前加入同体积的蒸馏水稀释，或用其它指示剂

2、若滤液颜色很深，滴定误差会很大，应使用电位滴定法测定

四、思考题

1、标准溶液滴定食品总酸，为何要用酚酞作指示剂？

答：食品中的酸为多种有机弱酸的混合物，用强碱滴定测其含量时，滴定突跃不明显，其滴定终点偏碱，一般在pH8.2左右，故可使用酚酞作终点指示剂。

2、实验若以mol/L表示食品总酸浓度，应如何计算？

答：X=c*(v1-v2)*K*F*1000/（m样品*M可电离酸mol质量）

3、对于颜色较深的样品，测定总酸度时终点不易观察，如何处理？

答：可加水稀释；用活性炭脱色；或在快接近滴定终点时，取2~3mL液体，加入20mL水稀释，再滴定观察；若还不行，宜采用电位滴定法。

4、食品总酸的测定时，应注意哪些问题？

答：应注意的问题有：（1）样品浸渍、稀释用的蒸馏水不能含有二氧化碳，因为二氧化碳溶

于水成为酸性的碳酸形式，会影响滴定终点时酚酞颜色变化，无二氧化碳蒸馏水在使用前煮沸15分钟冷却备用，样品中的二氧化碳在滴定前也应除去；（2）样品浸渍、稀释之水应根据样品中总酸的含量来慎重选择，为使误差不超过允许范围，一般要求滴定是消耗0.1mol/LNaOH溶液不得少于5mL，最好10~15mL。

实验四脂肪的测定（碱性乙醚法）

一、实验原理

本法又称罗斯－哥特里氏法（Rose-GottLieb）准确度高，适用范围广，是乳与乳制品脂类定量的国际标准法。本法利用氨－乙醇溶液破坏乳的胶体性状及脂肪球膜，使非脂成分溶解于氨－乙醇溶液中，而脂肪游离出来，再用乙醚-石油醚提取出脂肪，蒸馏去除溶剂后，残留物即为乳脂肪。

二、实验步骤

精密称取约1g奶粉样品，用10mL60℃水，分数次溶解于100mL具塞量筒中或罗斯－哥特里抽提瓶中，加入氨水1.25mL（若样品呈酸性，加入氨水2mL）充分混匀，置60℃水浴中加热5min，再振摇2min，加入乙醇10mL，充分混匀，于冷水中冷却后，加入25mL 乙醚，塞好，振摇半分钟，小心打开塞子，放出气体。再加25mL石油醚（沸程30－60℃），再振摇0.5min，静置半小时。

待上层液澄清时，读取醚层体积，放出一定体积醚层（量筒用移液管吸出一定量醚层）于一已恒重的烧瓶中。蒸馏回收乙醚和石油醚，挥干残余醚后，放入100－105℃烘箱中干燥1.5h，取出放干燥器内冷却至室温后，称重，重复操作至恒重。

三、注意事项

1、加氨水后，要充分混匀，否则会影响下一步醚对脂肪的提取。

2、加入乙醇的作用是沉淀蛋白质以防止乳化，并溶解醇溶性物质，使其留在水中，避免进入醚层，影响结果。

3、对已结块的乳粉，用本法测定肪，其结果果往往偏低。

四、思考题

1、在此实验中加入石油醚的用途。

答：石油醚可降低乙醚极性，使乙醚与水不混溶，只抽提出脂肪。质

2、碱性乙醚提取法和索氏提取法测定脂肪各有何优缺点？

答：碱性乙醚提取法是乳及乳制品脂类定量的国际标准方法，测定结果准确，但不能用于已结块的乳粉，有较多的限制性；而索氏提取法对大多数样品结果比较可靠，但费时长，溶剂用量大，需要专门的索氏抽提器，且不适合结合态脂肪。

实验五还原糖的测定（蓝－爱农法）

一、实验原理

将等量的碱性酒石酸铜甲液、乙液混合时，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀立即与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。此络合物与还原糖共热时，二价铜即被还原为一价的氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与亚铁氰化钾反应，生成可溶性化合物，达到终点时，稍微过量的还原糖将蓝色的次用亚甲基蓝还原为无色，溶液呈淡黄色时为滴定终点。根据还原糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液相当于还原糖的质量，以及测定样品液所消耗的体积，计算还原糖含量。

二、实验步骤

1、试剂的配制：

1）碱性酒石酸铜甲液

称取分析纯CuSO4·5H2O 15g及0.05g次甲基蓝，加煮沸过的H2O，定容至1000mL。2）碱性酒石酸铜乙液

称取分析纯酒石酸钾钠50g和分析纯Na0H75g，再加入4g亚铁氰化钾，加煮沸过的H2O ，完全溶解后，定容至1000mL，贮存于橡胶塞玻璃瓶中。

2、碱性酒石酸铜的标定：

准确称取96℃±2 ℃烘干至恒重的无水葡萄糖1.0000g，加水溶解后加入5mL盐酸，并以水稀释至1000mL。此溶液每毫升相当于1.0mg葡萄糖。

准确吸取碱性酒石酸铜甲、乙各5 mL于150mL锥形瓶混合，加10mL蒸馏水，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加约加9mL标准葡萄糖溶液，摇匀，电炉上加热至沸（要求控制在2min内沸腾），趁沸继续以每2s1滴的速度滴加标准葡萄糖溶液，直至蓝色刚好褪去，显示淡黄色即为终点，记录标准葡萄糖滴定mL数。

同时平行操作三份，后滴定的葡萄糖标准溶液的体积应控制在0.5-1.0mL以内，否则，增加预加量，重新滴定。

3、还原糖的测定：

1）试样的的制备

称取3.0g左右的蜂蜜样品，准确至0.0001g（称取的量以每100mL样液中含还原糖量125-300mg为宜），置50mL烧杯中，加热水溶解，定容至1000mL，摇匀，装入50mL滴定管中备用。

2）样品溶液预滴定

准确吸取碱性酒石酸铜甲、乙各5 mL，置于150mL锥形瓶混合，加水10mL蒸馏水，加入玻璃珠2粒，摇匀，电炉上加热至沸，趁热以先快后慢的速度，从滴定管中滴加试样溶

液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每2s1滴的速度迅速滴加，直至蓝色刚好褪去，记录样品溶液消耗体积。当样品中还原糖浓度过高时应适当稀释，再进行测定，使每次滴定消耗样液的体积控制在与标定酒石酸铜溶液时消耗的标准还原糖体积相近，约在10mL左右，记录消耗的总体积，作为正式滴定时参考。

2）样品溶液预滴定

准确吸取碱性酒石酸铜甲、乙各5 mL，置于150mL锥形瓶混合，加水10mL蒸馏水，加入玻璃珠2粒，摇匀，电炉上加热至沸，趁热以先快后慢的速度，从滴定管中滴加试样溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每2s1滴的速度迅速滴加，直至蓝色刚好褪去，记录样品溶液消耗体积。当样品中还原糖浓度过高时应适当稀释，再进行测定，使每次滴定消耗样液的体积控制在与标定酒石酸铜溶液时消耗的标准还原糖体积相近，约在10mL左右，记录消耗的总体积，作为正式滴定时参考。

三、注意事项

1、还原糖与碱性酒石酸铜溶液的反应不符合等摩尔关系，不能用化学方程式计算。

2、加热温度应使溶液在2分钟内沸腾,若煮沸时间延长,则耗糖量增加。整个滴定过程要在沸腾溶液中进行，以便驱除溶液中的空气。

3、碱性酒石酸铜溶液要用标准还原糖加以标定。

4、甲、乙液应分别存放，临用时以等量混合。

5、本法是与定量的酒石酸铜作用，铜离子是定量的基础，故样品处理时，不能用铜盐作蛋白质沉淀剂。

6、滴定速度应尽量控制2s1滴，滴定速度快，耗糖多；滴定慢，耗糖少。滴定时间应在1分钟内，滴定时间延长，耗糖少。因此预加糖液的量应使继续滴定时耗糖量在0.5-1.0mL以内。

四、思考题

1、根据直接法测定还原糖的步骤，正确完成实验的操作要点是什么

答：必须预滴定，测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近，通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，过高或过低应进行调整；整个滴定工作须控制在3min内完成，其中2min内加热至沸腾，然后以2s1滴的速度滴定至终点；标准溶液的标定、样品溶液预测及滴定的操作条件应保持一致；每一次滴定，被测溶液的使用量、锥形瓶规格、加热电炉功率、滴定速度、预加入大致体积、终点的确定方法等都尽量一致，并将滴定所需体积的绝大部分先加入碱性酒石酸铜溶液中共沸，使其充分反应，仅留1ml左右进行滴定，并判断终点，以减少滴定操作带来的误差，提高测定精度；另外，滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能将锥形瓶从热源上取下滴定，以防止空气进入反应液中。

2、为什么要进行预备滴定？

答：原因是本法对样品中还原糖浓度有一定要求（0.1%左右），测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近，通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，过大过小应加以调整；另外，通过预测可知道样液大概消耗量，以便在正式滴定时，预先加入比实际用量少1mL左右的样液，只留1mL左右在续滴定时加入，以保证在规定的时间内完成续滴定工作，提高测定的准确度。

3、为什么滴定过程中要保持沸腾?

答：原因是（1）可以加快还原糖与铜离子的反应速度；（2）次甲基蓝变色反应是可逆的，空气进入，还原型次甲基蓝又被氧化为氧化型；（3）氧化亚铜极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加耗氧量，影响结果的准确性。

4、滴定至终点，蓝色消失，溶液呈淡黄色，过后又重新变为蓝紫色的原因是什么？

答：滴定到终点，次甲基蓝被还原糖还原为还原态，蓝色消失，溶液呈氧化亚铜可溶性络合物淡黄色，遇氧气后次甲基蓝被氧化为氧化态，氧化亚铜可溶性络合物中铜氧化2价铜离子溶液变为蓝紫色。

5、根据实验结果及实际操作中的问题进行分析讨论。

答：（1）整个滴定操作在3min内完成，且滴定过程要在沸腾溶液中进行，以便驱除溶液中的空气。

（2）费林试剂要用标准还原糖加以标定。

（3）在滴定时不能随意摇动锥形瓶，防止空气进入使氧化亚铜被氧化，导致实验结果不准确。

（4）样品溶液须进行预测，了解样品溶液浓度，以便在精确滴定时在规定时间内完成，提高准确度。

（5）在实验过程中应使用同一规格的锥形瓶，使体系尽量保持一致，减小误差。

6、若要测定蔗糖、糊精、淀粉含量，应如何进行测定？

答：先用适当试剂将蔗糖、糊精、淀粉水解成还原糖，再用本法滴定水解后的还原糖量，以还原糖量表示蔗糖、糊精、淀粉的含量。

实验七蛋白质的测定（微量凯氏定氮法）

一、实验原理

蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其他含氮物质，所以此蛋白质称粗蛋白。

二、实验步骤

1、试样处理：称取0.200g－2.000g试样，移入干燥的100mL或500mL定氮瓶中，加入O.2g 硫酸铜，6g硫酸钾及20mL硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45o角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，

再继续加热0.5h－1h。取下放冷，小心加20mL水。放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。

试剂空白试验：取与样品消化相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸按以上方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。

2、测定：按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

测定前定氮装置如下法洗涤2-3次:从样品进入口加水适量(约占反应管1/3体积)通入蒸汽煮沸,产生的蒸汽冲洗冷凝管,数分钟后关闭夹子a，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b由橡皮管排出，如此数次，即可使用。

3、向接收瓶内加入20mL硼酸溶液(20g/L)及2-3滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，准确吸取10mL试样处理液，由小漏斗流入反应室，并以10mL水洗涤小漏斗使流入反应室内，棒状玻塞塞紧。将10mL氢氧化钠溶液(400g/L)倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。

夹紧螺旋夹b，开始蒸馏。蒸馏10min后，移动接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液(0.05moL/L)滴定至灰色或蓝紫色为终点。

同时准确吸取10mL试剂空白消化液，按步骤3操作。

三、注意事项

1.所用试剂溶液应用无氨蒸馏水水配制。

2.消化时不要强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失。

3、消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。

4、样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时，应用小火加热，并不停地摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意热源强度。

5、当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2-3mL后再继续加热消化。

6、一般消化至透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。

7、在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断气，否则将会发生倒吸。加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用水封措施，以免氨由此逸出损失。

四、思考题

1、蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液？加入量对测定结果有何影响？

答：加入氢氧化钠溶液使样品溶液呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，通过滴定法测定放出的氨气量来计算蛋白质的含量。

加入的氢氧化钠必须足量，否则不能使氨全部释放而影响测定结果。

2、在蒸汽发生瓶水中甲基红指示剂数滴即数毫升硫酸的目的是什么？若在蒸馏过程中才发现蒸汽瓶中的水变为黄色，能否马上补加硫酸？

答：加入两者的目的是保持水溶液的酸性，避免水中的氨被蒸出而影响测定结果。

不能。

3、实验操作过程中，影响测定准确性的因素有哪些？

答：（1）消化时，若样品含糖高或含脂肪多，应控制加热温度，以便大量泡沫喷出造成样品损失；（2）消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附着在瓶壁上的炭粒冲下，使样品彻底消化；（3）硼酸的吸收温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。