细胞悬浮培养研究进展

细胞悬浮培养研究进展

「摘要」：细胞在培养液中呈悬浮状态生长与增殖的培养技术。是一种通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。

「关键词」：植物细胞的悬浮培养愈伤组织动物细胞悬浮培养展望

「引言」：植物培养细胞中含有各种特殊的代谢产物，如生物碱、色素、甾体、萜等药

用成分及香精等, 有的含量很高。因此，利用植物细胞培养技术生产药物已成为当代

生物技术的一个重要领域，特别是培养药用植物细胞直接生产天然药物的研究已成热点。动物细胞培养在生物技术和生物医药研究中已得到了广泛的应用，通常动物细胞培养

为病毒疫苗的生产提供培养基质同时也是多种生物药品生产不可缺少的工具包括单克

隆抗体和基因治疗产品等。

（一）植物细胞悬浮培养

植物细胞能合成许多具有重要价值的次级代谢产物,它们可作为农药、杀虫剂、调味剂及香精等。这些产物传统上是从天然植物中直接提取,但天然植物生长周期较长,而且生长还受地域和环境因素的限制,所以采用直接提取具有较大的局限性。化学合成法已用于多种产品的生产,但是有些物质不能通过化学法合成,或虽能合成,却比较困难。植物细胞培养可大规模生产代谢产物,现已成为生产某些高价值产品的重要途径。一般情况下,培养细胞中的次级代谢物含量明显高于原来植物细胞中的含量,而且这种方法还能避免地域和环境的影响。19 0 2年,Haberlandt在营养液中成功地培育了单个植物细胞,尽管未能使其分裂生长但为植物细胞培养翻开了新的一页。此后,许多科学家在植物细胞培养方面进行了研究,特别是近二十年里,植物细胞培养取得了飞速发展,悬浮培养日益完善,固定化培养逐步显示其优势,膜培养技术也已崭露头角。以下介绍有关植物和动物细胞的悬浮培养情况。

1.悬浮培养特点

植物细胞培养与微生物有许多相似的地方,但两者又存在着明显的不同,如植物细胞对剪切力敏感,培养要求小通气量,还需要C仇和光照等条件。

1.1对剪切力敏感:植物细胞的个体大,细胞壁僵脆且具有大的液泡,这些特性

决定了其对剪切十分敏感。细胞形态和聚集状态改变,或影响细胞代谢,降低产率;或使细胞自溶,胞内化合物释放;也可能导致细胞的活性丧失。研究表明,不同细胞系对剪切力敏感性不同,日葵相对不太敏感,对剪切力。

1.2 结团:多数植物细胞有1 0一100um大,呈球形或柱形。除了少数细胞外,绝大多数植物细胞在悬浮培养时是结成直径至10um,大至几毫米的小团.其主要原因是细胞分化后不能很好地分开,外生长后期分泌的多糖类物质也有助于结团。过大细胞团容易下沉,造成混合困难。

1.3 多泡沫:细胞的结团、高浓度大分子、培养过程中分泌的多糖类等物质,造成培养液的粘度增高,起泡严重。在气流的作用下，许多细胞在气液界面聚集,使其脱离发酵液主体,阻碍了培养液的正常循环流动,造成细胞浓度急剧下降。

1.4 流体学特征:研究显示,植物细胞在高浓度培养时培养液为假塑性流体。吴兆亮等[ s ] 采用颗粒状琼脂一水物系代替植物细胞悬浮培养体系,观察到培养液随细胞浓度的增大从牛顿向非牛顿型的转变。他们还研究了两相培养系统的流体特征,结果表明有机溶剂浓度低于 1 0 % 时,对植物细胞悬浮培养体系流变性仅有很小的影响,而且是促使其体系向牛顿型流体靠近。相对而言,粘度小的有机溶剂对细胞浓度较小的植物细胞悬浮培养体系流变特性影响大些,而粘度大的有机溶剂则相反。这对有机溶剂的选择和反应器的设计都有一定的指导意义.

2.植物细胞悬浮培养的应用研究

2．1药用植物细胞悬浮培养的研究概况

2.1.1 药用植物细胞悬浮培养的优点与应用现状

植物细胞悬浮培养是在完全人工控制的条件下进行，具有以下优点：不受地区、季节、土壤及有害生物的影响，可以周年生产且生产周期较短；通过改变培养条件和选择优良培养体系得到超过整株植物产量的代谢产物，例如通过新疆紫草的细胞培养获得了比原植株含量高6倍的紫草素，甘草悬浮

培养细胞中所含的甘草酸铵含量高于其他材料；可利用基因工程或创新的合成路线，对有效成分的合成进行遗传操作，提高所需次生代谢产物含量；也可进行生物反应器细胞培养大规模生产有效的次生代谢产物[1-4]。目前用于细胞培养的药用植物有200多种，可产生500多种有效成分，如培养人参细

胞生产保健药物人参皂甙、紫草植物生产疗伤药物紫草宁、黄连细胞生产抗菌药物小蘖碱、长春花细胞生产阿吗

碱、紫松果菊细胞生产免疫活性多糖、红豆杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇等。从细胞培养中得到的药用成分有：喜树碱、茛菪碱、小蘖碱、奎宁、地高辛、天仙子胺、胆固醇、利血平、山萆、芥皂疳元、胰岛素等；实现规模化生产的有：中国科学院植物研究所的紫草培养、华中理工大学的红豆杉培养和中国药科大学的人参培养[2]。

2.2 植物细胞悬浮培养的特点及实现规模化生产的限制因素

植物细胞的特点是易于成团聚集，培养前期，年幼的细胞，速分裂形成的新细胞不能及时分开，细胞便积聚在一起；对数生长后期，由于多糖物质及蛋白质的分泌，细胞易相互粘附。聚集的细胞团不利于植物细胞培养，因为在植物细胞悬浮培养时，即使搅拌充分和营养物浓度足够高，氧及营养物也因外围细胞及多糖、蛋白质的阻碍难以扩散至内部细胞。其次，植物细胞生长较缓慢，培养过程较长，长时间保持无菌有一定难度。值得注意的是，液泡占据了植物细胞的大部分体积，使得细胞对渗透压及物理压力变化很敏感，同时对培养中的搅拌因素也非常敏感。如果搅拌方法不适当，常可破坏这种具大液泡的细胞，释放出细胞内积累的有毒物质和胞内某些水解酶类，从而伤害其他培养细胞。因此，药用植物细胞培养只有少数种实现规模生产，原因有二：一是增殖率不高，产物不稳定；二是缺乏适合植物细胞大规模培养的生物反应器[3]。今后研究重点应放在大规模培养技术的研究上，特别是研制出适合植物细胞生长特点的植物细胞反应器。

3药用植物细胞悬浮培养过程

植物细胞规模化培养包括愈伤组织诱导、愈伤组织继代培养和细胞悬浮大量培养。

3.1 药用植物愈伤组织诱导

植物细胞悬浮培养是指将离体的细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，细胞多来源于愈伤组织，因此，获得生长速度快、疏松型愈伤组织是植物细胞悬浮培养的基础。

3.1.1 外植体

外植体的选择对植物愈伤组织的获得有很大影响。一般用于诱导愈伤组

织的外植体以幼嫩的组织或器官及种子萌发的无菌苗为好[5]。不同植物可选择的外植体差异较大，禾本科的幼穗、成熟胚、成熟种子、花药、胚轴、胚根、芽尖等均可作为外植体诱导愈伤；草坪草以幼穗为外植体往往可获得较成熟种子更高的愈伤诱导率，但材料受季节限制不易获得，通常用成熟种子诱导愈伤组织；节和真叶是黄芩诱导愈伤组织的较好外植体[6]。木本及花卉则往往以叶片、茎尖、芽尖、花药等为外植体[7]，但南方红豆杉茎段的愈伤组织诱导率则高于叶片[8]；虎杖以叶柄为外植体更容易诱导出疏松的愈伤组织[9]；杜仲上胚轴和子叶更容易诱导疏松的愈伤组织[10]。选择合适的外植体才能获得生长快、疏松型的愈伤组织，为进行细胞悬浮培养生产打好基础。

3.1.2 植物生长调节剂不同的生长调节剂种类和浓度配比对愈伤组织诱导有明显的影响。诱导愈伤组织一般使用基本培养基附加2,4-D和6-BA两种植物生长调节剂组合。2,4-D对于愈伤组织的诱导与改良起很大的作用，能防止愈伤组织褐变[4]。

3.2 继代培养

3.2.1 愈伤组织继代培养愈伤组织的挑选是建立良好悬浮体系的关键。宜挑选质地疏松、易分散、不分泌粘液、颜色淡黄的愈伤颗粒进行继代培养。继代培养时注意保持愈伤组织的极性，即愈伤组织原有的上下面，以利于愈伤组织继代后尽快适应新环境和恢复生长。

3.2.2 细胞悬浮培养及其继代挑选生长力旺盛、表面有颗粒突起、疏松易碎的愈伤组织，并用镊子尽量夹碎后转入液体培养基，液体培养基在摇床（100～120 r/min）上连续振荡培养使细胞分散，得到细胞悬浮液。悬浮培养细胞的生长曲线为S型，元宝草细胞生长分为延滞期(0～4 d)，对数生长期(4～10 d)和静止期(10～18 d)，元宝草在一个培养周期内细胞鲜质量可增加5倍左右[14]。对数生长期后，由于培养基中的营养物质减少，细胞代谢积累了大量有害物质，使细胞生长环境发生变化，导致细胞生长速度减慢。因此，继代培养应选择在对数生长末期或静止期初进行。悬浮细胞培养周期一般为14～20 d[5]。黄山药悬浮培养20 d左右生长量达到最大[15]。保持新鲜培养基适当的比例也是必要的，继代过程中如接种量大，若养分不足，致使细胞死亡数增多[16]。

3.3植物细胞悬浮培养

在悬浮培养初期，愈伤组织从固体培养转移到液体培养过程中，易出现褐化现象，提高培养基中2,4-D浓度，可起到抑制褐化的作用[6,17]。控制植物细胞培养过程中溶氧浓度对于细胞的生长也具有十分重要的意义，提高摇瓶转速并在一定范围内提高溶氧浓度能加速细胞生长[18]。氧促进某些次生代谢产物的产生。

（二）动物细胞悬浮培养

动物细胞培养在生物技术和生物医药研究中已得到了广泛的应用，通常动物细胞培养为病毒疫苗的生产提供培养基质同时也是多种生物药品生产不可缺少的工具。包括单克隆抗体和基因治疗产品等，另外为了研究体内的生物化学途径病毒产物病理学机制及细胞内或细胞间反应等。动物细胞培养在大量的生物检测体系中也得到了应用。动物细胞与植物细胞和微生物细胞不同动物细胞没有细胞壁因此在培养时对剪切力很敏感要求也更为严格，传统的动物细胞采用方瓶和转瓶来培养这方面的技术已经成熟，但是该方法存在细胞密度低病毒产率低生产成本高劳动强度大等缺点，不能满足现代生物制苗的要求诞生于２０世纪６０年代的悬浮培养技术可以进行大规模细胞培养能够获得大量的病毒产物和高质量的疫苗产品在国外疫苗生产中普遍应用，该技术是从转瓶的贴壁培养发展来的是在生物反应器中人工条件下高密度大规模培养动物细胞用于生物制品生产的技术，根据细胞是否贴壁分为无载体的悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体悬浮培养前者已在内蒙古生药厂口蹄疫生产中广泛使用，悬浮培养技术最大优势是通过更为精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。

4细胞悬浮培养的前景

动物细胞悬浮培养技术取得了许多进展但是在细胞的大规模生产中还是存在一些尚待解决的问题：①商品化的微载体虽然很多，但至今没有哪一种微载体适用于培养各种类型的细胞，微载体类型的选择也受诸多因素的制约。②悬浮细胞培养目前大多还是一种单层的培养方式,而在体内组织细胞的生长发育过程是在一定的三维立体的内环境条件下进行的,细胞之间的相互信号传递对于调节细胞的增殖等有着重要的影响.常规的体外单层培养方法不能提供组织正常生长发育所需三维环境条件通常的后果是细胞发生转化现象导致培养的细胞不仅失去了正常的形态而且失去了其生化与功能性质.③由于

细胞对搅拌系统所引起的剪切力的敏感性细胞达到高密度后的营养供给代谢产物的堆积及传代和扩大培养等诸多因素的影响,限制了细胞扩增的效率. 植物培养细胞中含有各种特殊的代谢产物，如生物碱、色素、甾体、萜等药用成分及香精等, 有的含量很高[2]。因此，利用植物细胞培养技术生产药物已成为当代生物技术的一个重要领域，特别是培养药用植物细胞直接生产天然药物的研究已成热点。目前，我国已建立三七、三分三、人参、西洋参、三尖杉、紫草、洋地黄、长春花、丹参、红豆杉、毛地黄、黄连及雷公藤等十几种药用植物的液体培养系统，有效成分达到或超过原植株。总之，植物细胞大规模培养生产新药具有广阔的前景。随着对这一技术的深入研究，必将总结出一套通用的植物细胞工厂化生产药物的技术线路，以保护野生资源匮乏的药用植物，并开发更多有效成分珍贵、临床价值高的新药，如金线莲、冬虫夏草等，更好地造福于人类。

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