Protein A亲和层析柱亲和层析纯化人IgG1类嵌合抗体
技术方法名称:
Protein A sepharose 4 fast flow亲和层析柱纯化人IgG1类嵌合抗体
基本原理：
葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A）在pH值中性或碱性条件下与多种哺乳类动物IgG分子的Fc段特异结合，而在酸性条件下可以解离，可用于纯化人和小鼠IgG及其亚类（IgG3除外）。sepharose 4 fast flow是高度交联的4%的agarose衍生物，具有很好的动力学，在固相亲合吸附中有很好的层析质量，其刚性使其可理想地用于生产规模。Protein A sepharose 4 fast flow是protein A 与固相基质sepharose 4 fast flow的结合，是高特异、高稳定性凝胶，当凝胶装填柱床后，能够特异性捕获目的抗体。
用途及受限因素：
1、Protein A sepharose 4 fast flow的IgG高载量和允许样品通过的高流速，
使其成为实验室和生产规模制备抗体的理想凝胶。
2、Protein A sepharose 4 fast flow在纯化过程中会有少量集团脱落，如需
去除用离子交换Q Sepharose HP或凝胶过滤superdex 200。
3、在不同IgG亚类之内，甚至在相同亚类之内，都存在着天然的多样性，因此
对于每个待纯化的单抗都必须首先优化选择结合和洗脱系统。
4、层析几批样品之后，尤其流速明显减慢之后，需重装柱子。
实验材料：
1.1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱
生产厂商：pharmacia公司2.有抗体分泌的细胞上清
（本实验室构建的嵌合抗体为人IgG1类嵌合抗体，宿主细胞CHO）
3.柱体平衡液：0.1M PB缓冲液（PH7.0）
4.抗体洗脱液：0.1mol/L柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液（PH3.0）
5.1mol/L Tris碱溶液（不调PH）
6.透析液：0.01M PBS （PH
7.4）
7.20%乙醇
8.0.45μm滤器
9.真空泵
（本操作流程操作程序以1ml凝胶为例）
实验设计：
1．样品处理：
●取一定体积的有抗体分泌的细胞培养上清。
（根据1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱能有效结合约14mg 的抗体，结合待纯化上清中抗体含量，计算出最大纯化上清的体积）
●将细胞上清4℃离心10000rpm×20min，去除细胞碎片。
●细胞上清经0.45μm滤膜抽滤脱气，除去未沉降的蛋白等一些杂质，留样1ml，记录样品体积。
● 用10mM的NaOH调节上清的pH值至7.0左右。
2．平衡柱子：
以0.1M的PB（PH7.0）缓冲液平衡1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱，流速1ml/min，体积>20ml ，充分去除乙醇和杂质，平衡至OD280<0.01。3．上样：
将上述处理过的样品液以1ml/min流速上样，样品温度应保持与柱床温度一致，否则容易产生气泡，影响柱效。收集流穿液，混匀后取样1ml，记下流穿液体积。4．洗涤：
以0.1M的PB（PH7.0）缓冲液洗涤上样后的1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow 亲和层析柱，流速2ml/min，体积>50ml ，洗涤至OD280<0.01，保留液体待测。5．洗脱：
以0.1M的柠檬酸（PH3.0）缓冲液洗脱上样后的1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱，流速1ml/min,体积不限，分管收集，同时用1M Tris调其PH 至7.0左右，洗脱至OD280<0.01，保留液体待测。
6．纯化后抗体处理：
●用分光光度计测OD280，初步计算产量。
●将该样品置于透析袋中，在PBS（PH7.4）中透析，换液2—3次，6-8h/次。
●将样品用无菌的0.2μM的滤器过滤纯化的抗体，然后分装于1.5ml无菌塑料管中，–20℃储存备用。
7．再生:
再以0.1M的柠檬酸（PH3.0）缓冲液再生洗脱后的Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱，流速1ml/min，体积3-5ml。
8．保存：
以含20%乙醇的PBS（PH7.4）平衡再生后的洗脱后的Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱，流速1ml/min，体积30-50ml。关闭柱子，整体浸泡在含20%乙醇的PBS（PH7.4）中，4℃保存。
注意事项：
1．本实验全过程应尽量在4℃下操作。
2．细胞上清必须高速离心并过滤，防止污染柱料。
3．防止柱子流干、冻冰。
4．上样液置于4℃下上样，上样一段时间后流速将下降，应尽量排除柱内气体。5．洗脱时，换洗脱缓冲液应注意排除凝胶表面前步残留液体体积，防止影响洗脱效果。
6．流穿液和每步洗柱液应保留，待实验完毕后统一处理。
结果观查及分析的原则
采用分光光度计测OD280，按1mg=1.35OD280计算抗体量。同时结合夹心ELISA 检测上样前与上样后嵌合抗体含量的变化，以计算上样结合量，得出纯化效率。
实验成功或失败的关键因素
pH值在中性或碱性条件下，ProteinA和人源抗体Fc段能够特异性结合，而在酸性条件下可以解离，因此洗涤液和洗脱液的pH值是纯化成败关键。
蛋白纯化离子交换层析
蛋白纯化离子交换层析 离子交换层析技术是以离子交换剂为固定相，常见的离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过共价键结合某种电荷基团，形成带电基质，带异性电荷的平衡离子能够通过静电力作用结合在电荷基质上，而平衡离子能够与样品流动相中的离子基团发生可逆交换而吸附在交换剂上，不同带电荷蛋白间结合吸附固定相的能力不同。离子交换技术就是根据蛋白质样品间带电性质的差别而进行分离的一种层析方法。 常见的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换树脂和离子交换葡聚糖凝胶。根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的性质不同，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，在阳离子交换剂中，带正电荷的平衡离子能够和流动相中带正电荷的离子基团进行交换。例如DEAE纤维素阳离子交换剂，当纤维素交换剂分子上结合阳离子基团二乙氨乙基（DEAE）时，形成阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，可与带负电荷的蛋白质进行结合，交换阴离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型、弱酸型三类阳离子交换剂，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型只能在较小的pH范围内完全解离，如结合羧甲基的离子交换剂在pH小于6时就失去了交换能力。 强酸型阳离子交换剂一般结合的基团有：磺酸甲基、磺酸乙基；中等酸型阳离子交换剂有：磷酸基团和亚磷酸基团；弱酸型离子交换剂有：酚羟基和羧基类； 在阴离子交换剂中，带负电荷的平衡离子能与流动相中带负电的离子基团进行交换，例如阴离子交换剂CM纤维素，当纤维素交换剂分子上结合羧甲基（CM）时，形成带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），可与带正电荷蛋白质结合，交换阳离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，可分为强碱型、中等碱型、弱碱型阴离子交换剂。一般结合季胺基团基质的交换剂为强碱型离子交换剂，结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或者弱碱型离子交换剂。 蛋白质是两性电解质，当溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，蛋白质的静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，羧基电离，蛋白质带负电荷，蛋白质能够被阴离子交换剂所吸附，相反，当溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷，被阳离子交换剂所吸附，溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质带电荷越多，与交换剂的结合程度也越强，反之则越弱。 当溶液的pH值发生改变时，蛋白质与交换剂的吸附作用也发生变化，因此可以通过改变洗脱液的pH值来改变蛋白对交换剂的吸附能力，从而把不同的蛋白质逐个分离，当pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱，当pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低蛋白质对阴离子交换剂的吸附。 另外，无机盐离子（如NaCl）对交换剂也具有交换吸附的能力，当洗脱液中的离子强度增加时，无机盐离子和蛋白质竞争吸附交换剂。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。 因此，洗脱阴离子交换剂结合的蛋白时，则降低pH值，增加盐离子浓度；洗脱阳离子交换剂结合蛋白时，则升高溶液pH值，增加盐离子浓度，能够洗脱交换剂上的结合蛋白。
蛋白纯化层析柱
蛋白纯化层析 从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术（gel filtration，GF），离子交换层析技术（ion exchange，IEX），羟基磷灰石层析（hydroxyapatite，HAP）和疏水作用层析（hydrophobic interaction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法（high-performance liquid chromatography，HPLC）。 对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。GE Healthcare（原Amersham Biosciences）的技术顾问Andrew Mitchell 解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步： 捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白； 区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白； 修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。 这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。第一步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和高流量（flow rate）的填料。bead大小比较大，范围比较宽（比较于bead大小平均值）的“fast flow”填料比较理想，
这种填料也有利于防止目标蛋白被水解——因为速度比较快。 第二步则对分辨率要求更高，需要更好的从混合物中分离需要的成份。通常bead的大小与分辨率成反比，因此在这一部中比较小的bead 比较合适。吸附性的技术，比如离子交换IEX和疏水作用HI通常被用在纯化的这前两个步骤，而凝胶过滤则会留到了最后的修饰那一步，用于小体积，高浓度的样品。另外要注意，进行凝胶过滤层析时，样品的体积应该保持在柱床体积的1%到4%。 选择柱料的时候有两个因素要考虑到，针对目的蛋白的选择性和有效性——这些可以由洗脱峰的宽度来说明。其中选择性主要是指填料与目的蛋白相互作用以及结合的能力，IEX和HI层析方法就是指目标分子与筛分介质之间的相互作用，而GF的选择性依赖于填料的分馏范围（fractionation range）。 柱料的有效性则是指层析介质洗脱样品得到显著层析峰的能力，Mitchell表示，“如果你的峰值不集中，比较宽，那么即使是选择性很好，分辨率仍然会被消弱”。bead越大，洗脱峰就越不集中，柱子的有效性就越低。纯化洗脱相近的蛋白需要高效性，高选择性和高效性的结合就会得到高分辨率。 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 凝胶过滤法（gel filtration）也称为排阻层析（exclusion chromatography）、凝胶层析（gel chromatography）或分子筛层析（molecular sieve chromatofraphy），它是在1960年后发展出来的技术。
GST亲和层析介质使用说明书
GST亲和层析介质使用说明书 一、简介 GST亲和层析介质（GST Agarose）是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。 本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，具有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方便，批次重复性好，易于放大，是研发与生产的理想选择。 二、性能参数 三、适用范围 分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。 四、操作说明 1. 缓冲液配制 缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，调节pH值至8.0。 缓冲液B（洗脱缓冲液）：10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，调节pH值至8.0。因Glutathione易氧化，需现用现配。 （注：各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45 μm滤膜过滤备用)。 2. 样品预处理：
按每克湿重菌体/2~5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体；600w功率，每循环超声3s，冷却3s，循环99×3次,破碎菌体；4℃、15000rpm离心15m，收集上清液，或用0.45μm滤膜过滤。 3. 装柱： 聚苯乙烯层析柱 1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。 2) 打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。 3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡（如对实验结果要求不严，也可不放入上垫片，以提高流速）。 4) 在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所述 玻璃层析柱 1) 将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上；向柱中加入蒸馏水，排开柱子中的空气，在蒸馏水排尽以前，关闭柱子出口，在柱内保留5~8cm高度的蒸馏水。 2) 先将介质混匀，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。 3) 从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。 4) 在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中滤网，清洗或更换后重新装柱。 4. 过柱： 1) 用10倍介质体积缓冲液A过柱，平衡介质；
重组蛋白和多肽的分离纯化
重组蛋白和多肽的分离纯化 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化 不需要细胞破碎表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间 没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生长 没有大的影响，通常可获得高的表 达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解 具有不确定的N末端 在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的初期，要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质，还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素，来避免蛋白质失去活性。蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（ΔG f→u）来衡量，ΔG f→u越大蛋白质就越稳定。根据报导蛋白质的ΔG f→u在5—20kcal/molX围之间，单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化，因此ΔG f→u相对比较小，这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点，所以必须克服蛋
Protocol蛋白质纯化步骤
Protocol 蛋白质纯化方法（镍柱） 柱前操作 1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min; 2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质； 3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体； 4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？ 5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）； 6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱； 平衡柱子（柱体积：V） 7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）； 8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？ 9. 3V BB; 柱层析 10.上样； 11. 10V Washing Buffer（WB）； 12. 6V Elute Buffer（EB); 13.分管收集，每管1~2ml. 各种缓冲液配方 1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.9 1000ml NaCl: 58.44×4=233.76g Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g 2. 8×CB: 400mM NiSO4 1000ml NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g 3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g 4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g 5. 6M 尿素 1000ml 尿素：60.06×6=360.36g
亲和层析基本知识亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一
一、亲和层析基本知识 亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专 一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一 种生物大分子纯化方法，也叫做生物亲和或生物特 异性亲和色谱。这种特异可逆结合的物质很多，如 抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等，他们间的 这种特异亲和能力又叫亲和力。 亲和色谱中，一对互相识别的分子互称对方为 配体，如激素可认为是受体的配体，受体也可以认 为是激素的配体。 其他组分不产生这种专一性的结合，而直接流出色谱柱。然后，便可以利用洗脱剂将吸附在柱中的生物大分子洗脱下来。 亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。 二、固相载体的选择 对于一个成功的亲和色谱分离来说，一个重要的因素就是选择合适的固体载体。一个理想的载体，首先它必须尽可能少地同被分离的物质进行相互作用，以避免非特异的吸附作用。因此，优先选用的是中性聚合物，例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。其次，载体必须具有良好的通透性，即使在亲和剂键合在它的表面之后也必须保持这种特性。连接亲和剂的先决条件是有足够量的某些化学基团存在，这些基团在不影响载体的结构，也不影响被连接的亲和剂的条件下被活化或衍生。载体在结合亲和剂后，必须在机械性能和化学性质上具有稳定性，而且在改变pH、离子强度、温度以及变性剂的条件下也应该稳定。载体必须有大的孔网结构，允许大分子物质自由出入。再者，载体的组成大小也应均匀。高孔度对于大分子物质的分离是个重要的条件，它的主要作用是提供欲分离的物质与配体间的接触机会。配体大多结合在载体的孔内部，孔太小，生物大分子进不去，即使配体偶联率很高，结合生物大分子的量也不会太大。这不是我们所希望的。一般常用的载体有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。 三、配体的选择 亲和层析的固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子
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镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书 一、简介 金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。 镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。 二、性能参数： 特点基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便 基质6%的交联琼脂糖凝胶 配体 Ni2+ 配体密度20-40μmol /ml 吸附载量15mg蛋白/ml 介质颗粒大小45-165μm 最大流速600cm/h pH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11 保存温度+4-8℃ 保存液体20%乙醇 三、适用范围 分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。四、应用实例 实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白 实验步骤： 1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml； 2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min； 3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为 1ml/min；
蛋白纯化层析柱
蛋白纯化层析柱 2011-06-15 15:19:14 易生物仪器浏览次数:1164 网友评论 0 条 从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是... 关键词:蛋白离子交换分离分子物质树脂从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术(gel filtration，GF)，离子交换层析技术(ion exchange，IEX)，羟基磷灰石层析(hydroxyapatite，HAP)和疏水作用层析(hydrophobic interaction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法(high-performance liquid chromatography，HPLC)。 对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。GE Healthcare(原Amersham Biosciences)的技术顾问Andrew Mitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步: 捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白; 区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白; 修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。 这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。
亲和层析柱使用说明
亲和层析柱使用说明货号 名称规格说明DS0101 亲和层析柱1ml 含1个空管柱，上下盖和2个筛板（亲水性，孔径50um） DS0103 亲和层析柱3ml DS0106 亲和层析柱6ml DS0110 亲和层析柱10ml DS0130 亲和层析柱30ml DS0150 亲和层析柱50ml 一、产品说明 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。它是利用生物分子间 存在很多特异性的相互作用（如抗原和抗体、酶 和底物或抑制剂、激素和受体等），通过将具有 亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质 上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另 一个分子进行分离纯化。 提供的亲和层析柱工具可应用于如下方面： ①纯化重组蛋白；②纯化抗原和抗体；③纯化多 肽；④纯化DNA；⑤糖蛋白的纯化；⑥纯化磷酸 化蛋白和肽；⑦DNA 结合蛋白的纯化；⑧去除内毒素，等。 亲和层析柱空柱管的材质为医疗级的聚丙烯，这种工程材料通过大量的应用证明具有清洁无毒，不与生物分子结合和低溶解度的优点。 亲和层析柱空柱所用的筛板是选用纯净的UHWM-PE（超高分子量聚乙烯）为原料，经独特的工艺加工而成，具有亲水性。筛板在装填时安置在填料基质的上下端，以阻挡昂贵的基质渗出。亲水性筛板采用了领先的亲水性UHWM-PE 生产技术，该筛板能保证使用重力法时的流速为1-2ml/分钟或1-2滴/秒。同时，该筛板和其它同类产品相比，不会由于亲水性基团的引入而对蛋白质产生吸附。另外，该亲水性筛板在使用过程中不易形成气泡，气泡会使流速降低，液体通过基质不均匀。
二、产品应用 1，抗体纯化 纯化抗体一般用Protein A作为纯化的配体，也可以用Protein G或Protein L或异源性抗体作为配体。 2，小分子物质提取（以提取黄曲霉毒素M1为例） 试样通过免疫亲和柱时,黄曲霉毒素M1被提取。亲和柱内含有的黄曲霉毒素M1特异性单克隆抗体交联在固体支持物上,当样品通过亲和柱时,抗体选择性的与黄曲霉毒素M1(抗原)键合，形成抗体一抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂质,然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素M1,收集洗脱液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉毒素M1含量。 3，重组蛋白纯化 近年来，随着生物技术，特别是基因工程技术的迅猛发展，重组蛋白表达和纯化越来越容易。常用的重组蛋白表达策略是把蛋白与亲和标签融合表达，利用亲和标签一步纯化出目标蛋白。此方法无需了解蛋白质的生化特性或生理活性，就可通过带标签的重组融合蛋白选择性地与层析基质上的配体结合，从而得以纯化任何蛋白质。此方法与常规的层析方法不同之处在于，无需针对不同的蛋白质开发特定的配体和方法。采用保护蛋白质结构和功能完整性的温和条件，可一步亲和层析从粗提物中纯化出重组蛋白，纯度可达90％以上。 亲和标签已成为后基因组学时代纯化重组蛋白常用手段。亲和标签系统一般具有以下特征：(a)一步的吸附纯化；(b)对三级结构和生物活性影响小；(c)可方便且专一的去除以产生天然蛋白质；(d)在纯化过程中重组蛋白的分析简便准确；(e)适用于大量的不同蛋白质。但是没有哪个标签是完美的，只能根据实际需要去自己筛选，下表是分的标签以及纯化的方案。
重组蛋白纯化基本策略
捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC 分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率（使用Supedex）样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）样品稀释RPC高分辨率需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险提示：1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。6、只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC 方法用于精制阶段。注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。 蛋白质的蛋白质特性与分离纯化技术的选择 摘要：蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯的方法。 关键词：蛋白质分离纯化 前言： 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。
Ni柱亲和层析纯化poly-his变性重组蛋白的标准操作规程
Ni柱亲和层析纯化poly-his变性重组蛋白的标准操作规程（编号：066）1、目的及适用范围 利用Ni2+鳌合层析纯化体外表达的带有His标签的包涵体重组蛋白。 2、主要仪器 超声破碎仪、冷冻离心机、Ni柱、垂直混匀仪 3、主要试剂 3.1 裂解Buffer：50mM Tris，5mM EDTA，0.8%NaCl，pH8.5 3.2 变性剂：6M盐酸胍，2mM EDTA， 50mM Tris，10mM DTT，pH8.5 3.3 Buffer B：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH8.0 3.4 Buffer C：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH6.3 3.5 Buffer D：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH5.9 3.6 Buffer E：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH 4.5 4、相关的预处理 Ni柱的预处理： 4.1用5个柱体积的无菌水冲洗柱子； 4.2用5个柱体积的0.1M NiSO4冲洗柱子，使柱子挂Ni； 4.3用5个柱体积的无菌水冲洗柱子，除去多余的Ni； 4.4用5个柱体积的酸性Buffer冲洗柱子（使柱子变得疏松）； 4.5用5个柱体积的Buffer B平衡柱子。 5、操作步骤 5.1蛋白的纯化 5.1.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白； 5.1.2 4500rpm，离心10-15min，收集菌体； 5.1.3用裂解buffer重悬菌体，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体； 5.1.4 将菌体用裂解buffer重悬，超声破碎菌体； 5.1.5 4℃，12000rpm离心15min，弃上清； 5.1.6 将沉淀用PBST洗涤，4℃，12000rpm离心10min，重复1次； 135
(推荐)蛋白纯化-Ni亲和层析柱法
Ni亲和层析柱法纯化带组氨酸标签的重组蛋白 纯化设备： 纯化仪：?KTA purifier(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) Ni亲和层析柱：HisTrap TM HP-5 mL (GE Healthcare, , Uppsala, Sweden) 试剂： 所有上柱的试剂均需经0.2 μM孔径过滤器过滤并超声波震荡除气处理方可使用。 Binding Buffer：20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM 咪唑 Elution Buffer：20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7.4, 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑 Stripping Buffer: 20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7.4, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA 20%乙醇：200 mL无水乙醇，加蒸馏水定容至1L 0.1M NiSO4: 称取2.6284g NiSO4·6H2O，加蒸馏水溶解，定容至100 mL 操作步骤： 1 样品前处理 取诱导后菌液50 mL，4℃、5000 rpmin离心10 min收集菌体，以25 mL Binding Buffer 重悬菌体，冰浴下超声波破碎至澄清，4℃、12000 rpmin离心25 min，取上清，经0.2 μM 孔径过滤器过滤后待用。 2 Ni柱前处理 上样前，使用10倍柱体积的Binding Buffer以5 mL/min的流速平衡镍柱。 3 上样 经离心、过滤处理后的样品以1 mL/min的流速通过衡流泵加载到平衡后的Ni柱上，收集穿透液，可反复上样以提高样品的挂柱效率。 4 平衡上样后的Ni柱 将已结合目的蛋白的Ni柱回接到?KTA pur ifier上，用10倍柱体积的Binding Buffer 以5 mL/min的流速再次平衡镍柱以去除未结合上的蛋白。 5 梯度洗脱 以梯度的Elution Buffer/Binding Buffer混合液洗脱Ni柱(梯度的界定因蛋白而不同，可经预实验确定)，流速为5 mL/min，并监测OD280值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液
亲和层析技术
亲和层析技术 （一）原理 亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。 此法具有高效、快速、简便等优点。 （二）载体的基本要求和选择 理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。 可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。 琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。 琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。 （三）试剂与配制 1．Sepharose 4B 2．CNBr（剧毒）
蛋白质的纯化方法
蛋白质的纯化方法 蛋白质在外加电场作用下，带电的蛋白质颗的纯粒在电场中移动的速度(v)取决于化电场强度E，所带的净电荷q，蛋方白质的分子量、分子形状以及与介质法的摩擦系数f。几种常用的电泳纸电泳醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE 可分为圆盘电泳和垂直平板电泳) 琼脂糖凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦IEF 双向电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法电影聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE是利用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳蛋法，聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙稀酰白质胺和交联剂甲叉双丙稀酰胺交联而成的的多孔网状凝胶。纯不连续PAGE有分离胶、浓缩胶和样品化胶。方法 PAGE分辨率很高。电泳过程 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS(十二烷基磺酸钠)是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽蛋链中的氨基酸残基按大约1 比例白结合。质每一个蛋白质分子都因为结合了许多的的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质纯化分子原有的电荷则可以忽略。该法主方要利用了蛋白质分子量大小不同而分法离蛋白质。用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。等电聚焦将两性电解质eg:pH3-9，pH5-7同蛋白质样品一起加入到已经灌好的蛋凝胶中，在电场下，两性电解质首白质先达到它的等电点而平衡，蛋白质的样品根据它自身的等电点分别向两纯化极移动，最后也达到平衡。方等电聚焦:这种按等电点的大小，生物法分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为称等电聚焦。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。蛋白质双向电泳银染结果考马斯亮染色为蓝色连续电泳几种常用的层析法吸附层析分配层析离子交换层析凝胶过滤层析亲和层析柱层析离子交换层析法此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。蛋离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素白质如羧甲基纤维素CM纤维素)等，阴离子交的换纤维素如二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纯纤维素)等。化带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强，而方带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。法用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。离子交换层析法蛋白质的纯化方法凝胶过滤法此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或蛋聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的白内部是多孔的网状结构。质的 Sephadex G10-G200葡聚糖凝胶纯
亲和层析
固相萃取柱空柱 逗点生物提供的固相萃取柱空柱是制作固相萃取柱的基础工具，柱体选用高纯度医疗级的聚丙烯制成，筛板选用纯净的超高分子量聚乙烯加工而成，有广泛的溶剂兼容性。 30ml和50ml空柱管可以制备Flash柱。 我们提供用于制备固相萃取柱的筛板和空萃取柱，为科研研究服务，也为生产厂家提供配套。 点击了解详细规格 固相萃取柱空柱分类 固相萃取柱空柱，包括针筒型小柱、串联柱和离心柱等。 针筒型小柱串联柱离心柱 固相萃取柱空柱构成 装柱套件一般由柱体和筛板两部分构成，特殊应用时还需要盖子和推杆。 固相萃取柱空柱装柱步骤 1、装下筛板 用装柱工具把筛板顶入柱体，再用装柱工具把筛板推到柱体底部。 2、加装填料 柱体垂直，将长颈漏斗置入柱体中，在漏斗中加入所需填料，轻轻提起漏斗，轻敲使填料上表面平齐。 注意：① 长颈漏斗的颈要有足够的长度，最好能基本接近下筛板；② 漏斗提起时应避免填料粘在柱体内壁上。 3、装上筛板 保持柱体垂直，用装柱工具把筛板顶入柱体，再用装柱工具把筛板推到填料上表面。 注意：当填料上表面和上筛板之间还有空隙时，垂直状态轻敲柱体，再次用装柱工具把筛板推到适当位置。 产品选购指南 点击查看大图
亲和层析柱空柱 点击查看原图 产品/服务：其它实验耗材 品牌：biocomma 型号：1ml,3ml,6ml,10ml，30ml,50ml 规格：1ml,3ml,6ml,10ml，30ml,50ml 单价： 最小起订量： 供货总量： 发货期限：自买家付款之日起 3 天内发货
有效期至： 2011-06-28 最后更新： 2010-09-19 浏览次数： 129 产品详细说明 亲和层析柱解决方案 亲和层析柱用筛板 逗点生物提供的亲和层析柱用筛板是选用纯净的超高分子量聚乙烯为原料，经独特的工艺加工而成。 高分子聚乙烯能耐受酸碱和一般的有机溶剂，对大部分的生物分子不会产生吸附，是固相萃取柱、亲和层析柱筛板最常使用的材料。 亲和层析柱空柱 亲和层析柱空柱管由医疗级的聚丙烯制成，这种工程材料通过大量的应用证明具有清洁无毒，不与生物分子结合和低溶解度的优点。 亲和层析柱空柱管容量为3ml 、6ml 、10ml 、30ml 、50ml 。 亲和层析柱空柱 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。 如抗原和抗体，蛋白质A 与-些抗体，重组蛋白质和一些金属离子之间，均具有专一的亲和力，在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可相互解离。 当把可结合的一对分子的一方(称配体)结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载体，双方即结合为一整体。然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。 亲和层析柱空柱概述 逗点生物提供的亲和层析柱空柱是专门为实验室小批量纯化抗体、重组蛋白或其它分子而设计，方便进一步进行科学研究。 亲和层析柱空柱所用的柱子为聚丙烯塑料，这种工程材料通过大量的应用证明具有清洁无毒，不与生物分子结合和低溶解度的优点。 亲和层析柱空柱所用的筛板是选用纯净的UHWMPE 为原料，经独特的工艺加工而成，具有亲水性。筛板在装填时安置在填料基质的上下端，以阻挡昂贵的基质渗出。 亲水性筛板采用了逗点生物领先的亲水性UHWMPE 生产技术，该筛板能保证使用重力法时的流速为1-2ml/分钟或1-2滴/秒。同时，该筛板和其它供应商相比，不会由于亲水性基团的引入而对蛋白质产生吸附。另外，该亲水性筛板在使用过程中不易形成气泡，气泡会使流速降低， 液体通过基质不均匀。 亲和层析柱空柱可配套针筒注射器、装柱推杆和联接管，方便柱子的装填并和蠕动泵等设备配套使用。 亲和层析柱空柱用于抗体纯化 金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A,SPA)能与人及多种哺乳动物血清IgG 分子中的Fc 片段结合，结合的亲和性次序依次是猪、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛。 SPA 除与IgG 结合外，还能与血清中少量的IgM 和IgA 结合，SPA 菌对各类免疫球蛋白的吸附率：IgG 为90%～98%，IgM 为2%～30%，IgA 为1.5%～20%。 纯化抗体一般用Protein A 作为纯化的配体，也可以用Protein G,Protein L 或异源性抗体作为配体。 点击查看大图
亲和层析预装柱和填料选择指南
18-1121-86Edition AG Affinity CHROMATOGRAPHY columns AND media Product profile
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Affinity Chromatography (AC) Affinity Chromatography separates proteins on the basis of a reversible interaction between a protein (or group of proteins)and a specific ligand attached to a chromatographic matrix. Affinity Chromatography can be used whenever a suitable ligand is available. The target protein(s) is specifically and reversibly bound by a complementary binding substance (ligand). The sample is applied under conditions that favour specific binding to the ligand. Unbound material is washed away, and the bound target protein is recovered by changing conditions to those favouring desorption.Desorption is performed specifically, using a competitive ligand,or non specifically, by changing the pH, ionic strength or polarity.Proteins are concentrated during binding and collected in a purified, concentrated form. The key stages in a separation are shown in Figure 1. Affinity Chromatography may also be used to remove specific contaminants, for example Benzamidine Sepharose FF (high sub)removes serine proteases such as trypsin, thrombin and factor Xa,and Blue Sepharose HP removes albumin. Media selection Parameters such as scale of purification and commercial availability of affinity matrices should be considered when selecting affinity media. HiTrap affinity columns are ideal for method optimization or small scale purification of target proteins using well established protocols. Affinity media can be prepared by coupling a ligand to a selected gel matrix. HiTrap NHS-activated HP is designed specifically to facilitate this process and is supplied with a recommended coupling procedure for coupling primary amines. For separations of glycoproteins and polysaccharides, media screening may be required to select the correct specificity. Figure 1. Typical affinity separation. Immunoglobulins While protein A and protein G affinity media are similar in many respects, their specificities for IgG differ. Protein G affinity media are the better choice for general purpose capture of antibodies since they bind IgG from a broader range of eukaryotic species and bind more subclasses of IgG. Species-specific examples include stronger binding of polyclonal IgG from cow, sheep and horse to protein G. Polyclonal rat IgG, human IgG 3 and mouse IgG 1 are bound by protein G but not by protein A. Generally,protein G has greater affinity for IgG and minimal binding of albumin resulting in cleaner preparations and greater yield.Conversely, protein A may be the better choice for isolating certain subclasses of IgG or for removing cross-species IgG contaminants from horse or foetal calf serum, for example.Purification of human and mouse IgM is possible by the use of HiTrap IgM Purification HP 1 ml column. The thiophilic adsorption media with 2-mercaptopyridine coupled to Sepharose HP is designed for one-step purification protocol resulting in 80–95%pure IgM. Purification of IgY from egg yolk is easily performed using HiTrap IgY Purification HP 5 ml column. The purity is over 70% in one-step using this special designed medium. Fusion proteins Expression of fusion proteins is needed when larger quantities of target protein are required for further characterization. We offer products to facilitate every step in this process, from choosing the correct expression system through to selecting the most suitable purification solution for GST and His-tagged proteins. Purification of a glutathione S-transferase fusion protein is simple, using mild elution conditions that minimize the risk of damage to the functionality of the target protein. The GST-tag is easily detected and can be removed in one-step if required.For routine purification of larger quantities of GST-tagged proteins, GSTrap FF, prepacked HiTrap 1 ml and 5 ml columns with Glutathione Sepharose 4 FF and HisTrap or HiTrap Chelating HP , for His-tagged proteins, provide the ideal solution.The columns are compatible with ?KTAdesign chromatography systems to ensure reproducible results under optimized conditions. Optimization parameters 1.Select correct specificity for target protein. 2.Follow manufacturer’s recommendations for binding and elution conditions. 3.Select optimum flow rate for sample application to achieve efficient binding. 4.Select optimum flow rate for elution to maximize recovery. 5.Select maximum flow rate for column regeneration to minimize run times. adsorption of sample and flow through of wash away unbound elute bound