肿瘤个体化治疗检测技术指南(精准医疗-DNA检测-试剂盒研发)
肿瘤个体化治疗检测技术指南
（试行）
前言
肿瘤的个体化治疗基因检测已在临床广泛应用，实现肿瘤个体化用药基因检测标准化和规范化，是一项意义重大的紧迫任务。本指南从诊断项目的科学性、医学实验室检测方法的准入、样本采集至检测报告发出的检测流程、实验室质量保证体系四个方面展开了相关论述，使临床医生能够了解所开展检测项目的临床目的、理解检测结果的临床意义及对治疗的作用；医学实验室为患者或临床医护人员提供及时、准确的检验报告，并为其提供与报告相关的咨询服务。检测技术的标准化和实验室准入及质量保证对临床和医学实验室提出了具体的要求，以最大程度的保证检测结果的准确性。
本指南是参考现行相关的法规和标准以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及肿瘤个体化治疗靶点基因的不断发现，本技术规范相关内容也将进行适时调整。
本指南起草单位：中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室、苏州生物医药创新中心，经国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会、中国抗癌协会相关专业委员会、中华医学会检验医学分会、中华医学会肿瘤学分会的专家修订。
本指南起草人：詹启敏、曾益新、王珏、姬云、钱海利、李晓燕、孙石磊
目录
1. 本指南使用范围 (1)
2. 简介 (1)
3. 标准术语和基因突变命名 (1)
3.1标准术语 (1)
3.2 基因突变命名 (2)
3.3 参考序列 (2)
3.4 各类变异 (2)
4. 分析前质量保证 (5)
4.1 样本类型及获取 (5)
4.2 采样质量的评价 (6)
4.3 样本采集中的防污染 (6)
4.4 样本运送和保存 (6)
5.分析中质量保证 (7)
5.1 实验室设计要求 (7)
5.2 检测方法 (7)
5.3 DNA提取方法与质量控制 (13)
5.4 RNA提取方法与质量控制 (14)
5.5 试剂的选择、储存及使用注意事项 (14)
5.6 核酸扩增质量控制 (15)
5.7 设备维护和校准 (15)
5.8 人员培训 (15)
5.9 方法的性能验证 (16)
6. 分析后质量保证 (17)
6.1 检测结果的记录 (17)
6.2 失控结果的记录与分析 (17)
6.3 报告及解释 (17)
6.4 记录保留 (18)
6.5 检测后基因咨询 (18)
6.6 样本（及核酸）保留与处理 (18)
6.7 检测与临床数据收集与分析 (19)
7. 肿瘤个体化医学检测的质量保证 (19)
7.1 标准操作程序 (19)
7.2 质控品 (19)
7.3 室内质量控制 (20)
7.4 室间质量评价 (20)
7.5 PCR污染控制 (21)
附录A：常见的检测项目 (22)
A.1 基因突变检测项目 (22)
A.2 基因表达检测项目 (30)
A.3融合基因检测项目 (33)
A.4 基因甲基化检测项目 (34)
参考文献： (37)
1. 本指南使用范围
本指南由国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会制定，是国家卫生计生委个体化医学检测指南的重要内容，旨在为临床分子检测实验室进行肿瘤个体化用药基因的检测提供指导。本指南的主要适用对象为开展个体化医学分子检测的医疗机构临床分子检测实验室。
2. 简介
肿瘤个体化治疗以疾病靶点基因诊断信息为基础，以循证医学研究结果为依据，为患者提供接受正确治疗方案的依据，已经成为现代医学发展的趋势。临床研究证实，通过检测肿瘤患者生物样本中生物标志物的基因突变、基因SNP分型、基因及其蛋白表达状态来预测药物疗效和评价预后，指导临床个体化治疗，能够提高疗效，减轻不良反应，促进医疗资源的合理利用。
3. 标准术语和基因突变命名
3.1标准术语
1）基因（Gene）:是遗传物质的最小功能单位，是指具有一定生物学意义的一段DNA。
2）突变（Mutation）：是细胞中DNA核苷酸序列发生了稳定的改变。
3）融合基因（Fusion gene）：是指两个基因的全部或一部分的序列相互融合为一个新的基因的过程。融合基因的表达产物为融合蛋白。
4）基因表达（Gene Expression）：是基因中的DNA序列生产出蛋白质的过程。步骤从DNA转录成mRNA开始，一直到对于蛋白质进行翻译后修饰为止。
5）基因扩增（gene amplification）：为一特异蛋白质编码的基因的拷贝数选择性地增加而其他基因并未按比例增加的过程。
6）DNA甲基化（DNA Methylation）：为DNA化学修饰的一种形式，将甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶环的5'碳上。DNA甲基化能在不改变DNA序列的前提下，将DNA甲基化状态遗传至下一代细胞或个体。
7）聚合酶链反应（PCR）：是一种体外扩增特异DNA片段的技术。利用DNA在体外摄氏高温时变性会变成单链，低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
8）质控品：是含量或成分已知的处于与实际样本相同的基质中的特性明确的物质，这种物质通常与其他杂质混在一起，专门用于质量控制目的的样本或溶液。
3.2 基因突变命名
人类基因组突变学会（HGVS）已建立系统的基因突变命名方法。具体基因突变命名方法可查阅网站https://www.360docs.net/doc/b519069749.html,/mutnomen/index.html。HGVS基因突变命名指南根据需求不断更新。本文以2011年8月更新版本为准。
当描述某一序列改变时，其前缀表明其参考序列类型。例如“g.”表示基因组序列，“c.”表示cDNA序列，“m.”表示线粒体DNA序列，“r.”表示RNA 序列，“p.”表示蛋白序列。在数据库中的收录号以及版本号应当在实验记录报告中列出，当两种突变在反式（in trans）中检测到，则用方括号表示。例如，CF突变为杂合性突变（508号苯丙氨酸缺失和1303号天冬酰胺被赖氨酸替代），则在DNA水平规范描述方式为c.[1521_1523delCTT]+[3909C>G]。
3.3 参考序列
美国国立生物技术信息中心（NCBI）收录的参考序列编码具有权威性及唯一性。其中前缀“NM_”表示为mRNA序列，“NP_”表示多肽序列，“NG_”表示基因组序列。基因组参考序列应列出完整基因序列，包括5'以及3'非编码区（UTR）。当使用某段编码DNA参考序列描述突变时，应选择合适的转录体，且转录体的起始转录点应当明确，例如选择最常见的转录体，或者是已知的最大转录体，或者具有组织特异性的编辑转录体。当某一参考序列具有多种转录方式时，选择NCBI数据库里注释最全面的版本。
3.4 各类变异
3.4.1 DNA序列变异术语规范
DNA核苷酸用大写字母A（腺嘌呤）、C（胞嘧啶）、G（鸟嘌呤）以及T（胸腺嘧啶）来表示。用正链来表示DNA序列。当DNA序列改变时，以相应核苷酸所在位置及相应字母来描述。“>”符号表示“从某一变化至另一”。在描述突变方式时，数字、字母、箭头、上标以及下标之间不应出现空格。
3.4.2 RNA序列变异术语规范
RNA序列以小写字母a（腺嘌呤）、c（胞嘧啶）、g（鸟嘌呤）、u（尿嘧啶）进行描述。RNA序列改变描述方式与DNA相类似。具体术语可参阅HGVS网站（https://www.360docs.net/doc/b519069749.html,/mutnomen/index.html）。
3.4.3蛋白质序列变异术语规范
蛋白质序列改变通常以单个字母或三个字母（第一个字母大写）来描述。尽管单个字母描述氨基酸明确无误，但是由于三联密码子相对于其编码的氨基酸存在冗余性，具体给出发生突变的三联体密码子可以更清楚地描述氨基酸改变方式。例如，用来描述氨基酸的A（丙氨酸）、C（半胱氨酸）、G（甘氨酸）以及T（苏氨酸）可能会与核苷酸字母A（腺嘌呤）、C（胞嘧啶）、G（鸟嘌呤）以及T（胸腺嘧啶）相混淆。
3.4.4错义突变及无义变异术语规范
由于三联体密码子的简并性，多个位点核苷酸的改变可能不影响最终氨基酸序列。因此，应该分别从DNA水平和氨基酸水平描述突变。从DNA水平对某一突变位点的描述方式包括碱基位点，正常碱基，“>”符号，突变碱基。例如，某一蛋白第551号氨基酸残基由G（甘氨酸）突变为D（天冬氨酸），从DNA 水平描述即c.1652G>A。
在氨基酸水平，由于错义突变的产物以氨基酸残基位点以及表示氨基酸的单字母或三联体密码子来描述。表示方法是野生型的氨基酸、位点、突变氨基酸，三者之间不要有空格。例如，p.Gly551Asp表示该蛋白中551号甘氨酸残基（G）被天冬氨酸残基（D）所代替。无义突变表示方法与之相类似。需要指出的是“X”符号代表终止密码子。例如，p.Gly542X表示542位点的甘氨酸残基被终止密码子所代替。
3.4.5 缺失和插入术语规范
缺失和插入突变分别用前缀“del”和“ins”来表示，并注明突变位点以及碱基。例如，c.441delA表示在该DNA序列中441号位点发生A碱基缺失。
c.241_243delATC表示在该DNA序列中从241号到243号缺失ATC三个碱基。
在蛋白水平，上述突变描述方式为p.Ile24del，表示该蛋白质中第24号的异亮氨酸残基发生缺失。“indels”则表示该段序列缺失的同时有片段插入。例如，
234_239delAATTCGinsTA（或者234_239delinsTA）表示该DNA序列234至239号位点缺失AATTCG六个碱基，同时该段位点被新插入的TA碱基所替代。3.4.6 移码突变术语规范
移码突变用“fs”符号来表示。“fs*#”则用于进一步描述突变类型。例如，p.His62Profs*21表示该蛋白发生移码突变，第62号氨基酸由组氨酸突变为脯氨酸并产生新的阅读框架，终止于第62号密码子下游21号密码子处。该突变也可简要描述为p.His62fs，即该蛋白从第62号密码子发生移码突变。
3.4.7 碱基重复序列
HGVS推荐，核苷酸重复序列基因多态性描述时通常以一个重复序列为单元，后面加上“[重复的次数]”，如CGG[55]。当重复序列的次数在一个范围之内时，需要在小括号“（）”中标注出可能的最少的和最高的重复次数，如某个人HTT基因中发现有12个和15个CAG重复，基因水平的表示如下：c.52CAG[12]+[15]，蛋白水平则表示为：p.Gln18[12]+[15]。HTT基因的重复序列范围则描述为：c.52CAG(27_35) 或p.Gln18(27_35)。
3.4.8 遗传药理学基因型术语规范
最广泛使用的命名法描述遗传药理学基因型不同于其他遗传学基因检测，例如代谢相关基因细胞色素p450家族，人类细胞色素P450（CYP）等位基因命名委员会（http://www.cypalleles.ki.se）推荐用“*”命名，见图1。在该系统中，最常见的等位基因被指定为“* 1”。
图1.细胞色素P4502D6等位基因命名规范
3.4.9 其他
对于更复杂的突变，可参考HGVS（https://www.360docs.net/doc/b519069749.html,/mutnomen）建议的命名规则，解决其他复杂的变异的命名。
4. 分析前质量保证
4.1 样本类型及获取
4.1.1 新鲜组织(包括手术和活检组织)
肿瘤新鲜冷冻材料可提取出最高品质的DNA、RNA。在手术现场取样的情况也比较多，但需要在显微镜下确认肿瘤细胞含量。周围炎症严重的肿瘤、黏液产生过高的肿瘤、病变中心广泛纤维化的肿瘤细胞不能采集，以免产生假阴性结果。切割后取其中一半，并利用另一半切面制作组织标本，然后进行确认。
手术切除的组织样本理想的保存方法是迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80℃冰箱，这一过程应在手术样本离体后30分钟内完成。由于组织样本通常需先进行病理学分析，在分析完成后应尽早将组织样本置于稳定剂中，避免核酸降解。
4.1.2 石蜡包埋组织（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）
10%中性福尔马林固定手术切除样本，按病理学操作规范进行取材。
制作石蜡切片时，切取5片连续切片，其中1片进行HE染色，确认肿瘤细胞的含量。在高灵敏度检测方法中，可考虑使用活检标本。
DNA容易受固定的影响，长时间（1周以上）浸泡在福尔马林中的样本的DNA会被片段化，不能检出突变。活检材料的固定时间一般是24小时，对于穿刺等活检样本，固定时间控制在6~24小时为佳。
4.1.3胸腹水等细胞学样本
用胸腹水中的肿瘤细胞用于基因检测时，必须确认肿瘤细胞，穿刺获得胸腹水样本提交给细胞病理检查之后，剩余液体冷藏/冷冻保存，也可在含有细胞成分的离心沉淀中加入含有蛋白质变性剂的缓冲液（AL缓冲液，Qiagen公司）等室温保存。由于细胞学样本的肿瘤细胞含量较低，因此必须使用高灵敏度检测方法。
4.1.4 血浆样本
循环DNA(circulating free DNA，cfDNA)是存在于血浆中的游离DNA，肿瘤来源的DNA占血浆游离DNA的比例在不同肿瘤及病例中相差悬殊（0.01~93%），从而限制了外周血在肿瘤分子检测时的应用。目前已有多篇文献证实可利用从血浆游离DNA检出突变，但需要使用ARMS法等灵敏度非常高的检测方法。
采集外周血提取血浆游离DNA进行检测，取样时应使用一次性密闭EDTA 抗凝真空采血管，采集6~10ml全血，冷藏运输，6小时内分离血浆，提取游离DNA，保存到-80℃冰箱中，并避免反复冻融。如外周血需长时间运输，建议用商品化的游离DNA样本保存管，在常温条件下，cfDNA在全血中可稳定保存7天。
4.2 采样质量的评价
肿瘤细胞是否存在，是开展肿瘤个体化治疗基因检测的重要前提。如果要确认肿瘤细胞存在，与病理诊断医生密切合作是非常必要的。
采样评价内容包括：细胞组成、肿瘤细胞的数量，是否按照要求进行处理与运输。评价方法包括肉眼观察、显微镜下观察和浓度分析等。
肿瘤组织切片等应经病理医师审阅，取一张切片HE染色后显微镜下观察，确保肿瘤细胞存在，并记录肿瘤组织含量，标注肿瘤细胞密集区域。
4.3 样本采集中的防污染
样本采集最好采用一次性材料，不用处理便可直接使用；
制备不同患者病理切片样本时，需更换新刀片，并清除操作器皿上先前样本的残留；
采集中要特别注意防止污染，防止混入操作者的毛发、表皮细胞、痰液等；
如使用玻璃器皿，必须经高压灭菌，以使可能存在的DNase失活；
如提取RNA样品，必须采用RNase抑制剂措施和无RNase材料。
4.4 样本运送和保存
原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》要求进行。
实验室应建立详细的样本运送标准操作规程（SOP），对临床医生提供样本采集手册，要求物流人员填写相关运送记录表，确保运送过程中样本的安全性和过程的可控性。
需要转送的样本：用于RNA检测的样本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。
经过适当稳定化处理的样本可在常温下运送，如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血样本及用于RNA扩增检测的经稳定化处理的样本。
5.分析中质量保证
5.1 实验室设计要求
原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》要求进行。在符合国家卫生计生委要求的个体化医学检测实验室和通过审核验收的临床基因扩增检验实验室完成。
5.2 检测方法
5.2.1 Sanger测序法
5.2.1.1技术原理
Sanger测序法即双脱氧链终止法（Chain Termination Method），利用一种DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs
的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
5.2.1.2技术特点
该方法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准。
主要优点：测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。
局限性：灵敏度不高，突变等位基因需要超过20%才能检出。对样本中肿瘤细胞的含量和比例要求较高，一般要求肿瘤细胞含量不低于50%，如果肿瘤细胞比例低于50%，则假阴性出现的概率会显著增加；不适用于活检或细胞学样本。
5.2.2焦磷酸测序法（Pyrosequencing）
5.2.2.1技术原理
焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。当测序引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等4种不同酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合时释放的焦磷酸基团（PPi）与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列和定量分析序列变化的目的。
5.2.2.2技术特点
焦磷酸测序技术是一种新型的酶联级联测序技术，其重复性和精确性可与Sanger测序相媲美，而测序速度则大大提高，非常适合对已知的短序列进行重测序分析。
主要优点：检测灵敏度为10%，相对Sanger测序法高，对体细胞突变和甲基化等可实现定量检测；分型准确可靠，通量较高，实验设计灵活，可发现新的突变或遗传变异。
局限性：测序长度较短，不能对长片段进行分析。检测灵敏度中等，难以检出低于10%的突变。不适用于活检或细胞学样本。
5.2.3新一代测序（next generation sequencing，NGS）
5.2.3.1技术原理
NGS又称大规模平行测序（MPS），包含多种可以一次性产生大量数字化基因序列的测序技术，是继Sanger测序的革命性进步，采用平行测序的理念，能够同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序，实现了大规模、高通量测序的目标。不同厂家的产品测序原理不同，主要分为边合成边测序（Sequencing by synthesis，SBS）、基于“DNA簇”和“可逆性末端终结（Reversible Terminator）大规模平行测序、4色荧光标记寡核苷酸的连续连接反应测序和半导体芯片测序。
5.2.3.2技术特点
高通量测序技术不仅可以进行大规模基因组测序，还可用于基因表达分析、非编码小分子RNA的鉴定、转录因子靶基因的筛选和DNA甲基化等相关研究。
主要优点：高通量测序技术有三大优点是传统Sanger测序法所不具备的。第一，它利用芯片进行测序，可以在数百万个点上同时阅读测序。第二，高通量测序技术有定量功能，样品中DNA被测序的次数反映了样品中这种DNA的丰度。
第三、利用传统Sanger测序法完成的人类基因组计划总计耗资27亿美元，而现在利用高通量测序技术进行人类基因组测序，测序成本只需1千美金。
局限性：检测灵敏度和测序深度相关，一般来说，NGS在肿瘤体细胞突变检测时，检测灵敏度为10%；已知的与肿瘤相关驱动基因数量有限，疾病表型和基因型的关系还有赖于生物信息的解读，目前NGS应用于肿瘤细胞突变检测的标准化和质量控制尚未形成共识。
5.2.4扩增阻滞突变系统（ARMS）-PCR法
5.2.4.1技术原理
扩增阻碍突变系统（amplification refractory mutation system, ARMS）是PCR 技术应用的发展，也称等位基因特性PCR（allele-specific PCR,AS-PCR）等，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5`端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3`端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3`端则导致PCR不能延伸。
5.2.4.2技术特点
ARMS-PCR是目前实验室常用的基因突变检测方法。
主要优点：ARMS-PCR法检测灵敏度高，可检测肿瘤细胞中突变比例为1%甚至更低的突变基因。
局限性：只能检测已知的突变类型，不能发现一些新的、未知的突变；如果检测的突变位点或类型较多，则随着引物数目增加出现非特异性结合的概率也相应增加；当检测位点较多时，对DNA样本量的需求增加。
5.2.5 高分辨率熔解曲线（HRM）法
5.2.5.1技术原理
高分辨率熔解曲线（high-resolution melting，HRM）是一种基于PCR新型技术，用于检测基因变异包括未知的基因变异、单核苷酸多态性以及基因甲基化。HRM是基于在加热过程中双链变性为单链的原则。DNA双链体的熔解温度差异反应了基因的变异。双链DNA片段在其特定的温度熔解，熔解的温度由片段的CG含量、序列组成、长度以及一个和多个杂合碱基决定。用DNA嵌合的染料可以看到任何双链片段的熔解峰图，在有荧光嵌合染料的情况下PCR扩增片段，
扩增后的产物通过一个快速的可控的加热处理开始熔解。荧光水平在升温的过程中实时监测，染料随着双链DNA的熔解，荧光信号逐渐减少。
5.2.5.2技术特点
由于HRM分析不受碱基突变位点和种类的限制，可用于突变扫描、基因分型、序列匹配、DNA甲基化等方面的研究。
主要优点：检测灵敏度1%，特异性高，重复性好；封闭体系，减少污染的可能性；扩增和检测同时进行，无需PCR后进行处理。
局限性：通过熔解曲线的图不能判断某一特异性的变异体，下游分析中检测需要有测序等补充。
5.2.6 数字PCR（Digital PCR）
5.2.
6.1技术原理
数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，对起始样品绝对定量。通过将一个样本分成几万到几百万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA 模板) ，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。数字PCR技术不断发展，Bio-Rad、LIFE Technologies、Fluidigm及RainDance等厂家相继推出技术较为成熟的数字PCR产品。
5.2.
6.2技术特点
数字PCR目前的应用包括：稀有等位基因检测、基因表达绝对定量、核酸标准品绝对定量、二代测序文库绝对定量等。
主要优点：灵敏度可达0.001~0.0001%，高特异性，可检测复杂背景下的靶标序列；可高度耐受PCR反应抑制剂；不必依赖对照品或标准品，可对目标拷贝数直接进行精确的鉴定，分析微小的浓度差异；实验数据分析便捷，每个微滴的检测结果以阴性、阳性判读，数据分析自动化；可统计突变率，通过统计分析可得出靶点的突变率。
局限性：数字PCR仪通量较低，目前通常能检测的信号为FAM和HEX。一般单个反应2重反应效果最佳；数字PCR优点是灵敏度高，但是对于DNA浓度大的样本处理就没有优势，而且核酸浓度高时，每个微滴里面包含的拷贝数不
符合泊松分布；数字PCR虽然不依赖标准曲线，但是每次反应之间存在差异，短期内不能代替qPCR，也不能代替其他金标准而作为首选方法。QX200等数字PCR仪目前仅用于科研用途，数字PCR走向临床检验还需要一段时间。
5.2.7荧光原位杂交（FISH）
5.2.7.1技术原理
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是通过荧光标记的DNA 探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术。它的基本原理是：如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。5.2.7.2技术特点
FISH主要可对基因缺失、基因融合、基因扩增进行检测。
主要优点：可多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确；灵敏、特异性好，可同时分析分裂期和间期的多个细胞，并进行定量；可以检测隐匿或微小的染色体畸变及复杂核型。
局限性：FISH检测对操作和判读技术要求较高，诊断医师必须经过严格的FISH操作和结果判读培训，只有经FISH操作经验丰富的医师判定的结果才具有可靠性；目前FISH检测的成本昂贵、通量低。
5.2.8免疫组化（IHC）
5.2.8.1技术原理
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）分析利用抗体和抗原之间的结合的高度特异性，借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位和强度显示出来，以其达到对组织或细胞中的相应抗原进行定性、定位或定量的研究。
5.2.8.2技术特点
IHC作为筛查工具优于FISH，具有经济快捷的优点，尤其适用于大量样本的检测分析。影响IHC结果的因素主要包括抗体的选择、检测前组织的固定，观察者解释方面的差别等。
5.2.9 荧光定量逆转录PCR(Q-RT-PCR)
5.2.9.1技术原理
逆转录PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
5.2.9.2技术特点
荧光定量PCR是检测拷贝数变化的一种快速且经济的技术方法，该方法技术可用于RNA表达水平检测该技术主要优点是检测快速、通量高、灵敏度好，主要不足是对肿瘤组织提取RNA的质量要求较高，在检测基因表达量时判读标准尚未统一。FISH、IHC和Q-RT-PCR三种方法在检测ALK基因重排时的优缺点分析见表1 。
表1：FISH、IHC和Q-RT-PCR检测ALK基因重排的优缺点比较
5.2.3 检测方法选择策略
实验室应优选国际和国内“金标准”的检测方法，同类方法中优先选择结果稳定性、重复性好、特异性高的技术，同时也应考虑样本量，检测项目的多少等，综合选择合适的方法。
由于肿瘤组织的异质性，检测的组织样本中混有大量正常组织、石蜡样本提取的DNA质量和数量有限，就检测灵敏度而言，目前ARMS-PCR>焦磷酸测序>Sanger测序。
在检测肿瘤基因突变时，不能一味追求检测方法的灵敏度，灵敏度高的检测方法对整个实验过程中的质控要求更为严格，需防止因污染而产生假阳性。
在肿瘤靶基因表达检测时，由于肿瘤样本的不可再生性，需谨慎选择使用的方法，如选用荧光定量PCR要求提取的总RNA量达1μg以上，如果肿瘤组织过小，提取的RNA量可能达不到检测要求，此时应考虑选用对样本量要求低的检测方法。
5.2.4 检测项目
本指南根据检测靶分子（DNA或RNA）类型及基因表达调控机制类型的不同，将肿瘤个体化治疗检测项目分为基因突变、基因表达、融合基因、基因甲基化检测四个类型。所述检测项目均为目前在肿瘤临床诊疗中，经过严格的循证医学实验，且具有明确的临床应用价值，详见附录1。实验室在开展肿瘤个体化检测项目时，应评估所开展的检测项目的科学性，并遵循实验室的质量管理相关规定。
5.3 DNA提取方法与质量控制
DNA提取之前的病理质量控制非常重要，它决定了最终检测结果的可靠性。样本进行检测前均先行常规病理检查和诊断（HE染色），必须经有经验的病理医师确定肿瘤细胞的百分比(肿瘤细胞／整张切片所有细胞，必要时应采取富集肿瘤细胞的方法，如手工刮取或显微切割法。选取以肿瘤细胞为主的、没有明显的坏死、黏液和炎性改变的组织进行检测。
肿瘤细胞比例尚无统一标准，理想情况下，石蜡样本中肿瘤细胞的比例不应低于50%，新鲜样本不低于25%，对于ARMS等敏感性较高的方法，肿瘤细胞的含量和比例可以低一些。具体视所采用的DNA提取方法和突变检测方法的敏感度等而定。
对于新鲜和冻存的手术组织样本，可采用常规的商品化DNA提取试剂盒。对于活检样本，推荐使用能提取石蜡包埋组织微量DNA的试剂盒。对于商品化核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。纯化的靶核酸的完整性可使用凝胶电泳将样本的核酸提取物与核酸标准品比较测定。
核酸提取的产率：可在A260读数测定，DNA可溶于TE溶液中，建议浓度控制在50~100ng/ul，总量20~40 μg或以上。
核酸纯度：可通过提取物A260/A280比率判定，DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。
5.4 RNA提取方法与质量控制
RNA提取常比较困难，尤其是保存年限较长的肿瘤组织，RNA降解非常严重。造成RNA降解的原因有两个方面：RNA核糖残基的2’和3’位置带有羟基，易被水解；生物体内和外部环境中存在大量RNA酶，并且RNA酶不易失活，高温后仍然能够正确折叠恢复活性。因此从样本的储存、RNA的提取及保存，都需要格外小心，防范RNase对RNA的降解作用。
RNA提取的经典方法是胍盐提取结合酚-氯仿抽提，石蜡样本或活检样本可使用商品化RNA提取试剂盒纯化。细胞或组织的彻底匀浆是RNA提取过程中关键的步骤，它能够防止RNA的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。
核酸提取的产率：RNA可溶于无RNase的纯水中，建议浓度控制在100ng/ul 以上，总量达30μg以上。
纯化后的RNA应测定OD260/OD280比值，RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存），进行琼脂糖凝胶电泳观察有无DNA污染和RNA的完整程度。
5.5 试剂的选择、储存及使用注意事项
临床检测试剂必须为CFDA批准的试剂，或具有严格标准操作规程（SOP）的自配试剂（LDT）。
所采用的测定方法特异性好，灵敏度、准确度、精密度符合国家卫生计生委临床检验中心、IFCC、WHO等推荐的方法性能。所用标准品或标准参考物符合国家卫生计生委临床检验中心推荐的标准和要求。
5.6 核酸扩增质量控制
临床PCR检测方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、准确性，尽量降低假阳性、假阴性和非特异性扩增。临床样本扩增时，经常出现假阳性和假阴性，导致检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。
在核酸提取中，应至少带有1份已知弱阳性质控样本。其最后的检测结果，应是核酸提取和扩增检测有效性的综合反映。同时，还应至少带一份已知阴性质控样本，扩增测定的结果可以判断核酸提取过程中是否发生污染。
如靶核酸为DNA，为判断DNA扩增的有效性，可使用1份已制备好的弱阳性靶DNA样本，直接与靶核酸同时扩增检测。如靶核酸为RNA，则除了可用上述弱阳性cDNA判断DNA扩增有效性外，还可用已制备好的弱阳性RNA质控来判断反转录的有效性。另外，须设立阴性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到核酸污染。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品扩增结果进行判定。
5.7 设备维护和校准
实验室仪器的保养与维护是实验室实验技术员的重要组成部分，仪器的保养与维护关系到仪器的适用率、数据的准确率。
仪器设备安装及技术性能验收需由项目负责人、仪器设备使用人、实验室技术人员共同完成，验收内容按采购合同中技术需求部分以服务协议书的要求逐项进行，并且建立仪器设备档案。
仪器设备应定期开展校准计量，未经计量检定、计量检定不合格或未验收的对测试有重要影响的仪器设备不得投入使用。
实验室日常工作中，应重视仪器设备的清洁及维护，做到日维护、周维护、月维护，并及时记录。
5.8 人员培训
检测人员应该有相关的教育背景、相应的工作经验，接受过专业培训。培训主要有内部和外部培训，内部培训包括所使用的试剂方法原理、仪器设备操作维护及校准、质量控制等，外部培训包括国家卫生计生委临床检验中心和国家卫生计生委个体化医学检测培训基地等机构组织开展的各种技术培训。
5.9 方法的性能验证
方法学引进初期需对检测系统测定项目各参数的实验或评估性验证，包括精密度、准确度、线性范围、临床可报告范围、特异性、检测下限、抗干扰能力等。
所有项目的方法验证应形成详细的资料备存，资料需详细描述方法验证的目的、过程、检测结果、分析判断及验证结论。验证的结果及结论须经实验室负责人签字后才能用于临床检测。根据项目的特性，一些方法验证指标不需进行或未进行时，需在报告中书面解释原因。推荐用打印的文稿并在专用文件夹保存。
具体的性能验证方法，如使用的是经CFDA批准的试剂，可参照试剂盒说明书上相应的性能指标部分进行验证，看是否能在其实验室内复现说明书所显示的上述性能指标。如为自制试剂或自建方法，则参考LDT技术指南进行性能评价，建立上述性能指标。以下方法可供参考。
【准确度】
1）参加国家卫生计生委临检中心组织的室间质评，从室间质评统计结果评价实验室检测结果的偏倚或符合情况，从而评价和验证实验室检测结果的准确性。2）方法比较实验：当引进新方法与原有方法进行比较时，最少样本数为20例，用两种方法同时测定同样的样品。如结果有不符合时，应采用第三种方法或试剂进行确认。
3）检测已知值的标准物质，对于样本来源存在问题的检测方法，可以对已知值的样本稀释成不同浓度再检测，以评估其准确度。
【灵敏度】
1）分析灵敏度：就是确定检测方法的检测下限：将一份已知定值的标准品，用野生型的基因组稀释突变型基因组，设定不同的突变含量，一直稀释到检测下限以下为止，平行检测3管，3管全部检出且其线性∣r∣≥0.98的最低稀释浓度即为该方法的检测下限。（可根据实际情况在最低稀释浓度附近进行10倍以下的稀释）
2）临床灵敏度：主要是验证方法的假阴性率。从三甲医院或专业权威检测机构收集20~50例样本，进行检测分析，其灵敏度应满足临床检测要求，灵敏度=[TB/(TB+FN)]×100（TB=true positive、FN=false negative）；有CFDA批文的检
项目名称基于肿瘤精准医疗理念的卵巢癌治疗新策略
项目名称：基于肿瘤精准医疗理念的卵巢癌治疗新策略 完成人：程文俊，姜旖，万一聪，周树林，张林，袁琳，罗成燕，徐祎，马小玲 完成单位：江苏省人民医院 项目简介： 卵巢癌的死亡率居妇科恶性肿瘤的首位，5年生存率约40%左右，严重威胁女性生命及健康。精准医疗衍生自个性化医疗，是指以个人基因组信息为基础，结合蛋白质组学、基因组学等信息，针对患者分子生物病理学特征，来为其制定个体化诊断和治疗策略，进行精准诊断，精准处理，以期大幅提高患者的生存率，降低治疗的副作用。因此，结合目前最新的研究成果，本课题组多年来围绕卵巢癌相关研究热点领域，在基础研究和临床治疗方面提出新的卵巢癌诊治管理的新模式，将能够对肿瘤进行更加科学的系统评估、治疗，降低患者的并发症，提高患者的生存率。 卵巢癌精准治疗关键技术：（1）在规范建立的“卵巢癌生物组织样本资源库”和“随访数据库”的基础上，首先从Gene Expression Omnibus数据库下载肿瘤样品和非肿瘤样品的表达谱，使用R软件筛选差异表达的基因（DEG），并采用cluster Profiler进行功能分析。用Cytoscape 软件，分子复合物检测插件和数据库STRING对DEG进行分析，以构建蛋白质-蛋白质相互作用网络。然后利用“limma”软件包来筛选EOC和正常卵巢组织样品之间的差异表达基因（DEG），同时使用Cluster profiler进行功能和途径富集分析，利用搜索工具检索相互作用基因数据库来评估蛋白质间相互作用（PPI）信息和插件分子复合物检测，以筛选PPI网络中的核心模块。我们确定相关的DEG，通过强大的数据库分析得到与卵巢癌发生等相关的重要潜在基因和致病途径，有望为卵巢癌临床靶向治疗开辟新的方向。（2）建立CA125、HE4血清学联合筛查，并通过ROMA模型进行风险评估。对存在高度风险患者进行初次影像学评估或腹腔镜手术检查评估（PIV），判断肿瘤的分期。探讨BRCA基因突变状态与卵巢高级别浆液性癌患者的CT影像学指标之间的关系，并找出会影响BRCA突变型患者的肿瘤细胞减灭术的结局和生存率的CT指标，为术前评估手术风险，指导手术范围等提供影像学理论依据，建立基因-影像组学，最终为达到满意的肿瘤细胞减灭术奠定基础。（3）对于无法施行满意的卵巢癌肿瘤细胞减灭术，则需进行腹腔镜直视下组织活检或超声引导下肿瘤组织穿刺
肿瘤精准医疗探索
我国肿瘤精准治疗的现状和思考 精准医疗的概念来源于个体化医疗，Mirnezami等认为，精准医疗是通过基因组学、蛋白质组学等组学技术和医学前沿技术，对疾病进行精细分类及精确诊断，从而对疾病和特定患者进行个性化精准治疗的新型医学概念与医疗模式。 国较早提出如何构建精准医疗体系的夏锋和韦邦福认为，精准医疗模式以患者最大获益和社会医疗投入的高效配置为宗旨，结合现代流行病学、预防医学、临床诊断学、治疗学、分子医学、医学信息学技术、卫生经济学和医学社会学等，使传统的医疗模式走向整合化，为每个人提供量体裁衣般的疾病预防、筛查、诊断、治疗和康复计划，以最小资源投入获取最大健康保障，从而提高整体人群的健康水平。 2015年，国部分专家对精准医疗的定义达成共识：“精准医疗是集合现代科技手段与传统医学方法，科学认知人体机能和疾病本质，以最有效、最安全、最经济的医疗服务获取个体和社会健康效益最大化的新型医学畴[3]”。 综合以上观点我们认为，精准医疗是一种利用基因组学、蛋白组学等组学技术和医学前沿技术，力图从疾病的预防、检测、诊断、治疗及预后转归等层面，对疾病进行精细分类及精确诊断，进而针对患者个体特征制定并实施医疗
决策和处理方法，以期实现个体和社会健康效益最大化的新型医学概念与医疗模式。 我国之所以也要发展精准医疗，从广义上来说，这个政策最终会减少政府的医疗费用支出，使有限的资金发挥更大的作用，使得资金也能够被“精准”使用。而且，精准医疗所涉及的医疗技术均居当前最先进水平，我国应当紧跟世界科学技术的潮流。从狭义上来说，精准医疗从个人层面实现个体化医疗，对提高国民健康水平有重大意义。 一、在肿瘤方面的发展方向 肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。据最新统计，全球每年肿瘤新发病例1 400万，死亡820万，全球患肿瘤病例超过2 500万[4]。近20年来，我国癌症发病率和死亡率一直呈上升趋势。2011年，我国新发癌症病例约337.2万，因癌症死亡约221.3万。全国每分钟就有6.4人被确诊为癌症，每天有9 216人成为癌症患者，每7～8人中就有1人死于癌症[5]。当前严峻的现状，促使医疗专家尽快突破传统模式，寻找新的肿瘤治疗方式。因此，精准医疗的理念提出后，肿瘤科学就成为精准医疗最重要的研究领域之一，精准肿瘤医疗的概念也应运而生。 在精准肿瘤医疗模式中，对肿瘤的精准诊断是精准治疗的重要保证。与以往通过特殊染色、光学或电子显微镜、免疫组化等方式对肿瘤进行分类、分型和分期不同的是，精准医疗时代下是利用各种基因测序方法对肿瘤进行诊断。在对肿瘤进行精准诊断的基础上，可以通过以下技术对肿瘤患者进行较好的治疗。
肿瘤个体化治疗基因检测流程
肿瘤个体化治疗基因检测流程 1、目的： 保证所有肿瘤组织准确检测，符合技术要求。 2、范围： 所有技术人员及质检人员均适用。 3、职责： 3.1技术主管负责本规程的执行和监督。 3.2所有技术人员必须严格按照本规程的要求进行操作。 4、主要内容： 4.1病理常规操作 4.1.1病理样本的接收 4.1.1.1首先核对病理申请单与标本上的红色号码是否一致。 4.1.1.2核查病理申请单上写明的送检标本及数目是否与实际送检标本一致。 4.1.1.3观察送检标本的大小及固定液比例是否合适。(1)穿刺活检及纤支镜所取的小标本，4％中性甲醛(10％中性福尔马林)固定组织的量应在6～10倍。(2)对于较大的手术切除标本，应及时切开固定；核对后将病理申请单和标本编上病理标本号。 4.1.1.4将病人姓名、性别、年龄、病历号、科别、临床诊断、部位、标本来源、标本例数等逐项录入电脑存储。 4.1.1.5作为病理资料不仅要做好计算机录入工作，还须进行文字登记，以便病理档案长期保存。
4.1.2组织固定 临床医师切取标本后，应尽快将标本置于盛有足够量固定液的容器内，尽量避免可能出现固定不及时或不充分导致标本干涸或腐败，无法进行切片制作。添加的量应6～10倍于标本体积. 4.1.3取材及其后期处理 4.1.3.1病理科病理医生取材 4.1.3.2核对标本及其标志与申请单是否一致。 4.1.3.3按照病理取材规范选取病变及正常组织。 4.1.3.4对送检标本进行大体描述。 4.1.3.5取材后的标本保存至少两周。 4.1.3.6放入自动脱水机进行水洗－脱水－透明－浸蜡前处理。 4.1.4包埋 4.1.4.1先将熔化的石蜡倾入模具，再用加热的镊子夹取已经浸蜡的组织块，注意：特定的制定面或最下面向下埋入熔蜡。 4.1.4.2注意标本的编号和标本要对准，防止污染。 4.1.4.3为下一步切片准备，提供介质。 4.1.5切片 4.1. 5.1刀片锋利，组织块预冷。 4.1. 5.2切5-10um的连续组织切片，置于玻片上。 4.1. 5.3捞片，烘干。 4.1.6HE染色 苏木素－伊红染色。
肿瘤的精准医疗：概念、技术和展望
肿瘤的精准医疗：概念、技术和展望 杭渤1,2，束永前3，刘平3，魏光伟4，金健1，郝文山5，王培俊2，李斌1,2，毛建华1 摘要精准医疗是指与患者分子生物病理学特征相匹配的个体化诊断和治疗策略。肿瘤为一复杂和多样性疾病，在分子遗传上具有很大异质性，即使相同病理类型的癌症患者，对抗癌药物反应迥异，因此肿瘤学科成为精准医疗的最重要领域之一。组学大数据时代的来临和生物技术的迅速发展奠定了精准医疗的可行性。本文介绍精准和个体化医疗的概念、基础和意义，简述近年来在此领域的最新进展，以及对实施精准医疗的方法和技术进行分析和归纳，首次将其分为间接方法（生物标志物检测及诊断）和直接方法（病人源性细胞和组织在抗癌药物直接筛选的应用），最后扼要阐述精准医疗的前景和面临的挑战。 关键词：精准医疗个体化医疗分子组学生物标志物检测病人源性细胞和组织 Precision cancer medicine: Concept, technology and perspectives HANG Bo1,2, SHU Yongqian3, LIU Ping3, WEI Guangwei4, JIN Jian1, HAO Wenshan5, WANG Peijun2, LI Bin1,2, MAO Jianhua1 Abstract Precision medicine is defined as an approach to personalized diagnosis and treatment, based on the omics information of patients. Human cancer is a complex and intrinsically heterogeneous disease in which patients may exhibit similar symptoms, and appear to have the same pathological disease, for entirely different genetic reasons. Such heterogeneity results in dramatic variations in response to currently available anti- cancer drugs. Therefore, oncology is one of the best fields for the practice of precision medicine. The availability of omics- based big data, along with rapid development of biotechnology, paves a way for precision medicine. This article describes the concept, foundation and significance of precision medicine, and reviews the recent progresses in methodology development and their clinical application. Then, various current available biotechniques in precision medicine are evaluated and classified into indirect (biomarker-based detection and prediction) and direct (patient-derived cells and tissues for direct anti-cancer drug screening) categories. Finally, perspectives of precision medicine as well as its facing challenge are briefly discussed. Key words: precision medicine personalized medicine omics biomarker detection patient-derived cells and tissue 2011年，美国国家科学院在“迈向精准医疗：构建生物医学研究知识网络和新的疾病分类体系”报告中，对“精准医疗（precision medicine）”的概念和措施做了系统的论述[1]。报告探讨了一种新的疾病命名的可能性和方法，该方法基于导致疾病的潜在的分子诱因和其他因素，而不是依靠传统的病人症状和体征。报告建议通过评估患者标本中的组学（omics）信息，建立新的数据网络，以促进生物医学研究及其与临床研究相整合。美国总统奥巴马在2015年1月20日的国情咨文中正式将“精准医疗计划”作为美国新的国家研究项目发布，致力于治愈癌症和糖尿病等疾病，让每个人获得个性化的信息和医疗，从而“引领一个医学新时代”。此举措很快得到了美国政府研究机构和医学界的热烈响应[2, 3]，当然也包括来自医学界和社会的争议。 1 精准医疗与个体化医疗1.1 定义 什么是精准医疗（又称精确医学），其与通常所讲的个体化医疗（personalized medicine）又是什么关系？精准医疗就是与患者分子生物病理学特征，如基因组信息，相匹配的个体化诊断和治疗策略。个体化医疗利用诊断性工具去检测特定的生物标志物，尤其是遗传性标志物，然后结合患者的病史和其他情况，协助决定哪一种预防或治疗干预措施最适用于特定的患者。通俗地讲，个体化医疗就是考虑患者本身的个体差异，药物治疗因人而异，为理想化的治疗。而精准医疗着眼于一组病患或人群（图1），相对于个性化医疗针对个体病患的情况更为宽泛，更可行。两者有共同的内涵。也有医疗和研究机构将这两个概念放在一起，如杜克大学的“精准和个体化医疗中心”。 图1精准医疗的核心Fig. 1 Heart of precision medicine
肿瘤个性化用药基因检测
一、背景介绍 医学发展到今天，人类已经征服了许多疾病，但是如何攻克癌症依然是人类面临的巨大挑战。近年来癌症的发病率一直呈上升趋势，据世界卫生组织报告预测，到2025年，全球将有3亿人患癌症，并有2亿人因此而死亡；在我国癌症已列居各类死亡之首，年均癌症新发病例约为200万人。在治疗上尽管不断有新的药物和治疗手段诞生，但取得的效果不尽人意，癌症的死亡率同50年前相比没有显著降低，与此同时，心脏病，脑血管病和传染病的死亡率却降低了2/3。 由于肿瘤是在体内各种因素的作用下由一系列基因连续突变导致细胞生长失去控制所致，因而每个肿瘤患者，即使同一种肿瘤，其致病因素和体内突变的基因都是不一样的，每一个患者的肿瘤都有自己独特的生物特征，这就是肿瘤的异质性。忽略了肿瘤的异质性，采用“一药一病”的疗法是肿瘤治疗没有达到理想效果的主要原因。肿瘤的异质性要求必须对每个患者“区别对待”，这就是肿瘤的个性化治疗。 而基因是人类遗产信息的化学载体，决定着我们与前辈的相似和不同。研究结果表明，人类绝大部分的疾病与基因相关。人与人之间的基因99.9%相同，但正是因为那剩余的0.1%的差异，造成了人与人之间健康的差别。基因检测正是利用遗传学、分子生物学等技术进行检测分析，来发现遗传物质异常的过程。通过基因检测，我们可以了解自己的基因型，通过比对自身基因型和大规模医学试验的结果，从而评估自身是否出现某种类型的健康问题（易感风险）；另外可以对肿瘤病人个性化治疗的用药提出指导。 随着人类基因组计划的完成，开展通过基因测序的个性化医学检测技术是临床个性化医学的大势所趋，成为解决一些疑难疾病如遗传性疾病以及肿瘤的重要工具。通过基因检测分析评估可能罹患的疾病和预测不同病人的药物效应，并指导临床医生为可能患者提出建议或在临床治疗药物选择时针对患者独特的遗传变异特征选择治疗方式、药物和剂量，即使治疗同一种疾病，或者同一患者的不同阶段，医生也可能根据病人的遗传背景来选择最合适、最具有针对性的治疗方式、药物和剂量，避免严重的毒副反应和医疗资源的浪费！ 二、方法 目前基因检测的方法不胜枚举，基本的步骤是样本的获取（包括血液、唾液、
精准医疗给了肿瘤患者一个生命奇迹
精准医疗：从此癌症不再是绝症，还肿瘤患者一个生命奇迹 “一些癌症晚期转移的患者，我没有办法治愈他们，但也许我可以将他们的生存周期从6－9个月延长到2－3年，也许这2－3年里面就有新的药物、新的方法被研发出来，能够拯救他们的生命了呢。” ——Dr. Nader Javadi（内德·贾瓦迪） 为所有肿瘤患者带来生存的希望，这就是“精准癌症医学” 先驱Dr Javadi的Hope Health Center中“希望”的意义。癌症 作为危害人类生命健康的头号杀手，其带来的致命威胁是不容 小觑的！据世界卫生组织(WHO)发表的《全球癌症报告2014》 显示，2012年全世界共新增癌症病例1400万例并有820万人死 亡，其中，中国新增307万癌症患者并造成约220万人死亡。世 界上每年有数百上千万人死于癌症，而当前全球癌症患者和死 亡病例还在令人不安地持续增加，更是使得抗癌之路愈显漫长 而崎岖。 在中国，平均每分钟有6人被确诊为癌症，而其中有6成是完全可以预防和避免的！那么在癌症患者逐年上升的情况下，我们该如何更早的知道自身是否存在患癌风险，如何在癌症早期就发现并将其扼杀在摇篮里?也许，癌症基因检测精准医疗可以帮到我们。 精准医疗：如何逆转生命，创造奇迹？ 2015年年初，美国总统奥巴马在国情咨文演讲中正式启动了精准医疗计划，该计划将在基因组层面加快对疾病的认识，并将最新最好的技术、知识和治疗方法提供给临床医生，使医生能够准确了解患者病因。如果说2014年是移动医疗的春天，那2015年便是精准医疗的春天。 虽然精准医疗这个概念早在2011年就已被美国国家研究委员提出过，但今年，在奥巴马的推动下，更是引发全球关注。精准医疗又称为个性化医疗，它是根据个体基因特征、环境以及生活习惯，为病人量身设计出最佳治疗方案，以期达到治疗效果最大化和副作用最小化的一种定制医疗模式。 如今，精准医疗主要着重于癌症的预防与治疗，以及癌症战争新策略的研究和制定上。作为全球医疗技术创新的驱动者，美国早已开始积极推行精准医疗，而且已经成绩斐然！除了为已故苹果公司CEO史蒂芬·乔布斯在胰腺癌确诊后多争取了长达8年的生存时间之外；好莱坞女星安吉丽娜·朱莉也是通过基因测序，在发现罹患乳腺癌风险偏高以后切除乳腺以预防该疾病发生；同时，精准治疗也帮助患有白血
第13章 肿瘤遗传学
第十二章肿瘤遗传学 恶性肿瘤是一种体细胞遗传病，为相关基因结构与功能发生改变的结果。这些基因参与控制细胞的正常生长和凋亡过程、抑制细胞增殖或修复基因损伤。遗传性恶性肿瘤中基因的种系突变(germ line mutation)起主要作用。肿瘤的遗传基础十分复杂，因为突变基因的不同组合可发生相同类型的肿瘤。在各种类型的癌症中，一些基因的突变具有普遍性，而另外一些基因突变只限于某种特定类型的肿瘤细胞。 本章首先从细胞遗传学的角度介绍了染色体异常与肿瘤的关系，然后讨论了癌基因和肿瘤抑制基因的功能和作用，并论述了肿瘤发生的遗传学理论，最后介绍了遗传性恶性肿瘤综合征。 一、基本纲要 1．掌握肿瘤细胞的克隆演进、Ph染色体的意义；癌基因、原癌基因、肿瘤抑制基因、p53基因、二次突变假说、细胞癌基因、杂合性缺失和标记染色体等概念； 2．掌握癌基因激活的机制； 3．掌握恶性肿瘤发生的遗传学理论； 4．熟悉恶性肿瘤的多步骤发生，基因杂合性丢失与恶性肿瘤发生等； 5．了解临床上常见的遗传型恶性肿瘤。 二、习题 （一）选择题（A型选择题） 1．以下哪个是对Ph染色体的正确描述： A．22q+ B．22q- C．9q+ D．9q- E．der（22）t(9;22)(q34;q11) 2．视网膜母细胞瘤（RB）的致病基因为： A．ras B．rb C．p21 D．MTS1 E．NM23
3．下列哪个基因为肿瘤转移抑制基因： A．ras B．rb C．p21 D．MTS1 E．NM23 4．下列哪种为慢性髓细胞白血病（CML）的标志染色体： A．13q14- B．5p- C．22q- D．t(8;14) E．17q+ 5．存在于正常细胞中，在适当环境下被激活可引起细胞恶性转化的基因是：A．癌基因 B．抑癌基因 C．原癌基因 D．抗癌基因 E．隐性癌基因 6．Knudson提出的“二次突变假说”中，非遗传性肿瘤的第一次突变发生在： A．精子 B．卵细胞 C．受精卵 D．体细胞 E．生殖母细胞 7．慢性髓细胞性白血病属于______的肿瘤。 A. 多基因遗传 B. 染色体畸变引起 C. 遗传综合征 D. 遗传易感性 E. 单基因遗传 8．Bloom综合征（BS）属于______。 A. 单基因遗传 B. 多基因遗传 C. 染色体畸变引起 D. 遗传易感性 E. 染色体不稳定综合征 9．视网膜母细胞瘤属于______的肿瘤。 A. 单基因遗传 B. 多基因遗传 C. 染色体畸变引起 D. 遗传易感性 E. 染色体不稳定综合征 10．共剂失调性毛细血管扩张症（AT）属于______。 A. 单基因遗传 B. 多基因遗传 C. 染色体不稳定综合征 D. 遗传易感性 E. 染色体畸变引起 11．肾母细胞瘤属于______的肿瘤。 A. 染色体畸变引起 B. 遗传易感性 C. 染色体不稳定综合征 D. 多基因遗传 E. 单基因遗传 12．着色性干皮病（XP）是一种罕见的、致死性AR遗传病，发病率为1/250000。XP 属于______。 A. 多基因遗传 B. 染色体不稳定综合征 C. 遗传易感性 D. 染色体畸变引起 E. 单基因遗传
肿瘤个体化治疗检测技术指南(精准医疗-DNA检测-试剂盒研发)
肿瘤个体化治疗检测技术指南 （试行）
前言 肿瘤的个体化治疗基因检测已在临床广泛应用，实现肿瘤个体化用药基因检测标准化和规范化，是一项意义重大的紧迫任务。本指南从诊断项目的科学性、医学实验室检测方法的准入、样本采集至检测报告发出的检测流程、实验室质量保证体系四个方面展开了相关论述，使临床医生能够了解所开展检测项目的临床目的、理解检测结果的临床意义及对治疗的作用；医学实验室为患者或临床医护人员提供及时、准确的检验报告，并为其提供与报告相关的咨询服务。检测技术的标准化和实验室准入及质量保证对临床和医学实验室提出了具体的要求，以最大程度的保证检测结果的准确性。 本指南是参考现行相关的法规和标准以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及肿瘤个体化治疗靶点基因的不断发现，本技术规范相关内容也将进行适时调整。 本指南起草单位：中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室、苏州生物医药创新中心，经国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会、中国抗癌协会相关专业委员会、中华医学会检验医学分会、中华医学会肿瘤学分会的专家修订。 本指南起草人：詹启敏、曾益新、王珏、姬云、钱海利、李晓燕、孙石磊
目录 1. 本指南使用范围 (1) 2. 简介 (1) 3. 标准术语和基因突变命名 (1) 3.1标准术语 (1) 3.2 基因突变命名 (2) 3.3 参考序列 (2) 3.4 各类变异 (2) 4. 分析前质量保证 (5) 4.1 样本类型及获取 (5) 4.2 采样质量的评价 (6) 4.3 样本采集中的防污染 (6) 4.4 样本运送和保存 (6) 5.分析中质量保证 (7) 5.1 实验室设计要求 (7) 5.2 检测方法 (7) 5.3 DNA提取方法与质量控制 (13) 5.4 RNA提取方法与质量控制 (14) 5.5 试剂的选择、储存及使用注意事项 (14) 5.6 核酸扩增质量控制 (15) 5.7 设备维护和校准 (15) 5.8 人员培训 (15) 5.9 方法的性能验证 (16)
艾科优美常见肿瘤遗传性风险基因检测
艾科优美常见肿瘤遗传性风险基因检测 引起疾病的根本原因： 先天的遗传基因缺陷； 基因与环境之间的相互作用； 基因的后天突变。 绝大多数疾病，尤其是肿瘤，往往可以在基因中发现病因。 艾科优美肿瘤遗传性风险基因检测： 女性16种： 肺癌、皮肤癌、肝癌、食管癌、结直肠癌、多发性骨髓瘤、肾癌、膀胱癌、 胰腺癌、胃癌、鼻咽癌、甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈 癌； 男性14种： 肺癌、皮肤癌、肝癌、食管癌、结直肠癌、多发性骨髓瘤、肾癌、膀胱癌、 胰腺癌、胃癌、鼻咽癌、甲状腺癌、前列腺癌、睾丸癌。 常见肿瘤遗传性风险基因检测的意义： 1及早了解疾病的发病风险。通过肿瘤遗传风险分析，能够提示肿瘤遗传风险度较高的检测者及早采取相应的预防措施，规避诱发肿瘤的危险因素，延缓或阻止肿瘤的发生。 2指导个性化健康生活。不健康的生活方式也是疾病发生的危险因素，对于基因检测结果显示肿瘤风险较高的受检者更需要避免相关的不健康的生活方式，保持心态平和，维持内分泌相对平衡，均衡膳食，避免不良环境，积极预防肿瘤的发生。 3辅助疾病诊断。肿瘤遗传风险分析可以作为疾病的辅助诊断手段，对疾病的遗传风险分析可以为医生提供判断依据。对于疾病的诊断具有一定的提示及指导意义。
检测结果： 风险阈值： 健康建议： 肿瘤风险基因检测的适宜人群： 1. 有肿瘤家族史人群，通过检测可以确定罹患肿瘤的风险并提前进行干预； 2. 肿瘤患者，查找肿瘤患者患病原因，为家人提示风险； 3. 有慢性疾病史的人，如有长期慢性胃炎、结肠炎疾病史的人群； 4. 关注自身健康，想了解自身罹患肿瘤风险的健康人群。 检测的必要性： 遗传性高：携带遗传性肿瘤风险基因致病突变的人可能将肿瘤风险遗传给下一代； 癌症早期治愈率高：早期发现，手术切除后，治愈率高达80%。 专业的检测报告和贴心的健康提示： 肿瘤遗传性风险基因检测
精准医疗时代的肿瘤药理学研究_丁健
Prog Pharm Sci Oct. 2015 V ol. 39 No. 10 2015年10月 第39卷 第10期2721 ???????????e????e E X P E R T F O R U M e??e 精准医疗时代的肿瘤药理学研究 （中国科学院上海药物研究所，上海201203） 丁健 过去20年，生命科学与技术的蓬勃发展推动新药创制理念、技术与研究方法发生革命性变化，也见证了抗肿瘤药物研究史无前例的飞速发展。特别是，对癌基因依赖和肿瘤异质性等肿瘤生物学本质认识的不断深入，推动了分子靶向药物治疗理念和研发格局的变革，肿瘤药物治疗已经进入了“量体裁衣”的精准治疗的新时代。新时期肿瘤药理学研究的核心内涵，是深化肿瘤个性化治疗的理念，以肿瘤分子分型研究为基础，全面诠释分子靶向药物的个性化特征，以支持个性化药物研发的新模式。 本期“肿瘤药理学研究进展”专题，综述了抗肿瘤药物研究在多个领域的最新进展。主要内容包括：当前热点的免疫微环境的重要组成——肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤发生发展中的作用，以及相关的肿瘤治疗策略；传统的细胞周期蛋白激酶（cyclin-dependent kinase ，CDK ）抑制剂经过多年探索未见临床突破之后，如何调整策略，聚焦选择性抑制剂，一举推动CDK4/6选择性抑制剂被批准上市；低氧诱导因子（hypoxia inducible factors ，HIFs ）HIF-1α如何通过同时影响肿瘤细胞和肿瘤微环境，影响肝癌的发生发展和治疗等。希望各位读者在了解这些领域最新进展的同时，通过本文能够放眼肿瘤药理学 2015,39 39 (10):721-722 P ROGRESS IN P HARMACEUTICAL S CIENCES 研究全局，避免“窥豹一斑”，对肿瘤药理学未来的发展方向有所思考。 1 肿瘤个性化治疗新理念推动药理学研究格局改变 肿瘤在发生发展和演进过程中，由于基因组的不稳定性，导致特定细胞亚群发生基因突变，或特定细胞亚群选择性的克隆形成，造成肿瘤的高度异质性。相同的肿瘤表型往往起源于不同的分子信号异常已经成为共识。肿瘤的高度异质性是肿瘤最重要的本质特征，是肿瘤治疗面临的最大挑战。与此同时，肿瘤癌基因依赖（oncogene addiction ）的现象也被逐步证实，即尽管肿瘤中同时存在着多种、不同层面的基因异常，特定的肿瘤亚群往往高度依赖于一个或几个基因维持其生长优势。这一认识则为高度异质性肿瘤的治疗带来希望。 当前，对肿瘤的认识已经突破了以往的组织学、病理学分型，进入了基于基因异常的分子分型新时代。在这一背景下，肿瘤的药物治疗从传统化疗药基于“疾病表型”的治疗模式，逐渐转向以分子靶向药物为主体的、基于“疾病分子分型”的治疗模式，也带来了个性化抗肿瘤药物的可喜进展。2011年上市的针对占恶性黑色素瘤50%~60%的B-RAF V600E 突变分型的激酶抑制剂vemurafenib 的临 [专家介绍] 丁健 :中国工程院院士、肿瘤药理学家、上海药物研究所研究员、博士生导师。现任中国科学院大学药 学院院长，上海药物所学术委员会主任，兼任中国抗癌协会、中国药学会和中国药理学会的常务理事，中国抗癌协会抗癌药物专业委员会、中国药理学会肿瘤药理专业委员会的主任委员。担任Acta Pharmacol Sin 主编和J Biol Chem 、Eur J Pharmacol 、J Ethnopharmacol 和Molecular Pharmacology 等SCI 学术杂志编委。 作为主要发明者之一，领导研发了一批抗肿瘤新药，具有自主知识产权的3个候选新药目前正处于临床研究。其中盐酸希明替康在Ⅰ期临床研究中显示出对当前结肠癌一线治疗耐药的患者有效；Lucitanib 正在欧洲进行Ⅱ期临床试验,对多线治疗失败的乳腺癌患者治疗效果卓著。另外，1个候选新药新近进入临床研究，5个候选药物正在进行系统 临床前研究，其中2个实现成果技术转让。相关成果申请国内外专利160余项，获国内外专利授权42项。 在国际著名杂志J Natl Cancer Inst 、Cancer Res 等发表研究论文240余篇，他引4 000余次。研究成果获国家自然科学奖一等奖（1项）、国家自然科学奖二等奖（2项）、国家科技进步二等奖（1项）、上海市自然科学一等奖（2项）、上海市科技进步一等奖（1项）、何梁何利科技进步奖、吴阶平医学研究奖—保罗·杨森药学研究奖一等奖、上海市十大科技精英等各类重要奖项10余项。
肿瘤基因检测的解读流程
. 从临床进入基因检测流程是入口，检测结果结合临床信息进行合理解读是出口，临床这一入一出之间需经历检测前临床咨询部分、实验室部分、信息分析部分、患者信其中的第四部分临床解读部分即是根据检测结果、解读部分共四个环节。息、医生共识综合判断，临床和遗传咨询有效衔接、充分沟通，最终出具临床解读报告。包括解读的步在做成临床解读报告之前，首先需要将解读的各个环节进行明确，使解读过程解读的技术细节。这样才有可能真正的做到解读的规范化，骤流程，基因检测才能更好的服有章可循，才能出具一份好的临床解读报告，有据可依，原始数基因检测数据解读可分为三个步骤：务患者和临床医生。从大的框架讲，临床病例结合的解读。据→分析数据、基于数据库的解读→与患者个体表征/ 、读懂原始数据1软件比对至经BWA）将测序的原始序列数据（FASTQ 去除接头及低质量序列，版本）人类基因组参考序列UCSC版本）或NCBIhg19/hg38（GRCh37/38（ANNOVAR使用与SNVIndel变异，检测使用Picard上，去除重复序列，GATK 1.vcf进行变异注释。最后获得一份文件（图）。. . 图1 从测序的原始序列数据到vcf文件的流程 一份vcf文件包含如下基本信息。
Chr：变异所在的染色体 Start：变异在染色体上的起始位置 End：变异在染色体上的结束位置 Ref：参考基因组的序列 Alt：检测样本基因组的序列 . . Func.refGene：变异所处参考基因的功能区（exonic，intronic，UTR3，UTR5，splicing，upstream，downstream，intergenic）（此处的exonic特指外显子编码氨基酸区，不包括外显子的UTR区） Gene.refGene：变异所处参考基因名称（如果是基因间，则是两侧的基因）GeneDetail.refGene：非外显子区处于特定转录本中的具体位置（如果是基因间，则是距离两侧的基因的距离） ExonicFunc.refGene：外显子区的变异类型（frameshift insertion，frameshiftdeletion，stopgain，stoploss，nonframeshift insertion，nonframeshiftdeletion，synonymous SNV，nonsynonymous SNV），如果这一栏是一个“.”的话，就说明该变异不在外显子区 AAChange.refGene：氨基酸水平的改变（同一个基因可能具有多个转录本，氨基酸改变的位置在不同的转录本中有可能不一样） 经注释后的vcf文件还会包含如下信息：
精准医疗面临的挑战及发展建议
一、中国精准医疗发展历程回顾 中国早在20世纪初就开始关注精准医学，2006年首先提出了精准外科的概念，得到了国内、国际的医学界认可后被引用到肿瘤放疗、妇科等医学领域。其目标是通过合理资源调配、全流程的成本调控，获得效益与耗费之比的最大化。精准医疗相比传统经验医学有了长足进步，可以通过将精密仪器、生命科学等先进的现代技术与我国优秀的传统经验整合在一起，大大减小临床实践的不确定性，从而在手术中实现“该切的片甲不留，该留的毫厘无损”，在保证精准的同时尽可能将损伤控制到最低。 图表精准医疗在我国的发展历程 资料来源：产研智库 二、中国精准医疗发展现状分析 造血干细胞移植、基因芯片诊断、免疫细胞治疗等第三类医疗技术临床应用准入审批2015年取消。在此之前，国家卫计委、科技部等多次出台政策，并组织生物医药等领域专家对精准医疗、基因测序等开展研究。在政策利好推动下，精准医疗有希望进入发展快轨。 多项政策支持 政府高层相当重视精准医学，批示国家卫计委和科技部组织专家论证，精准医学也迎来了多项政策支持。 2015年3月，第一批肿瘤诊断与治疗项目高通量基因测序技术临床试点单位名单发布。同月，科技部召开国家首次精准医学战略专家会议，计划在2030年前，在精准医疗领域投入600亿元。其中，中央财政支付200亿元，企业和地方财政配套400亿元。
2015年4月15日，卫计委和科技部组织生物医药等领域专家，同中国科学院等部门共同研讨精准医学研究计划。 2015年5月10日，国务院发布《关于取消非行政许可审批事项的决定》，其中指出，取消第三类医疗技术临床应用准入审批，包括造血干细胞移植、基因芯片诊断、免疫细胞治疗等第三类医疗技术临床应用。 国家政策的支持将对基因测序、细胞治疗、干细胞等精准医疗相关领域构成利好。预计2015-2020年全球精准医疗市场规模增速达15%，是医药行业增速的3-4倍；2013年基因测序市场规模约45亿美元，2013年-2018年复合增长率为21.2%，而中国和印度市场2012-2017年复合增长率为20%-25%。 肿瘤检测市场先行 短期来看，个性化医疗相关技术和产品对相关公司的收入贡献有限，但随着市场的不断拓展，未来将对相关公司带来可观的增量。 目前国家卫计委允许怀12周以上的高危产妇利用基因测序技术进行无创产前筛查。以这一项检查为例，我国每年新生儿数量约1600万，按10%的市场渗透率，3500元/人次计算，市场空间约56亿元/年。随着技术的发展，成本继续下行将进一步打开市场空间。假设成本下行至1500元/人次，渗透率至50%，则市场空间有望上行至120亿元/年。 考虑到每年三四百万的癌症发病人数，基因测序的应用空间巨大。中国癌症发病率正“大幅”上升，2014年中国约有220万人死于癌症，但很多病例本是可预防的。对这类恶性疾病的治疗，一方面是加大治疗药物的研发突破，另一方面应从精准治疗角度进行治疗技术的突破。当前的肿瘤治疗正逐渐从宏观层面对“症”用药向更微观的对基因用药转变，实现“同病异治”或“异病同治”，精准治疗成为肿瘤治疗的一个趋势。 三、实现精准医疗面临的挑战 2015年，“精准医疗”随着奥巴马的宣言一跃成为年度热词。那么，精准医疗的实现目前还面临哪些关键环节的挑战呢？ 临床及生物信息整合 精准医学的基本思想应是将临床信息、患者表型与基因蛋白谱进行整合，从而为患者量身制定精准诊断、预后及治疗策略。基于大规模组学数据和临床医学信息的整合需求，临床信息和信息学是精准医学发展的重中之重。
肿瘤个体化治疗检测技术指南(总40页)
肿瘤个体化治疗检测技术指南(总40页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1 -CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除
肿瘤个体化治疗检测技术指南 （试行）
前言 肿瘤的个体化治疗基因检测已在临床广泛应用，实现肿瘤个体化用药基因检测标准化和规范化，是一项意义重大的紧迫任务。本指南从诊断项目的科学性、医学实验室检测方法的准入、样本采集至检测报告发出的检测流程、实验室质量保证体系四个方面展开了相关论述，使临床医生能够了解所开展检测项目的临床目的、理解检测结果的临床意义及对治疗的作用；医学实验室为患者或临床医护人员提供及时、准确的检验报告，并为其提供与报告相关的咨询服务。检测技术的标准化和实验室准入及质量保证对临床和医学实验室提出了具体的要求，以最大程度的保证检测结果的准确性。 本指南是参考现行相关的法规和标准以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及肿瘤个体化治疗靶点基因的不断发现，本技术规范相关内容也将进行适时调整。 本指南起草单位：中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室、苏州生物医药创新中心，经国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会、中国抗癌协会相关专业委员会、中华医学会检验医学分会、中华医学会肿瘤学分会的专家修订。 本指南起草人：詹启敏、曾益新、王珏、姬云、钱海利、李晓燕、孙石磊
目录 1. 本指南使用范围.................................. 错误!未指定书签。 2. 简介............................................ 错误!未指定书签。 3. 标准术语和基因突变命名.......................... 错误!未指定书签。 3.1标准术语.................................................... 错误!未指定书签。 3.2 基因突变命名 ............................................... 错误!未指定书签。 3.3 参考序列 ................................................... 错误!未指定书签。 3.4 各类变异 ................................................... 错误!未指定书签。 4. 分析前质量保证.................................. 错误!未指定书签。 4.1 样本类型及获取.............................................. 错误!未指定书签。 4.2 采样质量的评价 (6) 4.3 样本采集中的防污染.......................................... 错误!未指定书签。 4.4 样本运送和保存.............................................. 错误!未指定书签。 5.分析中质量保证................................... 错误!未指定书签。 5.1 实验室设计要求.............................................. 错误!未指定书签。 5.2 检测方法 ................................................... 错误!未指定书签。 5.3 DNA提取方法与质量控制...................................... 错误!未指定书签。 5.4 RNA提取方法与质量控制...................................... 错误!未指定书签。 5.5 试剂的选择、储存及使用注意事项.............................. 错误!未指定书签。 5.6 核酸扩增质量控制............................................ 错误!未指定书签。 5.7 设备维护和校准.............................................. 错误!未指定书签。 5.8 人员培训 ................................................... 错误!未指定书签。 5.9 方法的性能验证.............................................. 错误!未指定书签。
肿瘤基因检测的解读流程
从临床进入基因检测流程是入口，检测结果结合临床信息进行合理解读是出口，这一入一出之间需经历检测前临床咨询部分、实验室部分、信息分析部分、临床解读部分共四个环节。其中的第四部分临床解读部分即是根据检测结果、患者信息、医生共识综合判断，临床和遗传咨询有效衔接、充分沟通，最终出具临床解读报告。 在做成临床解读报告之前，首先需要将解读的各个环节进行明确，包括解读的步骤流程，解读的技术细节。这样才有可能真正的做到解读的规范化，使解读过程有据可依，有章可循，才能出具一份好的临床解读报告，基因检测才能更好的服务患者和临床医生。从大的框架讲，基因检测数据解读可分为三个步骤：原始数据→分析数据、基于数据库的解读→与患者个体表征/临床病例结合的解读。1、读懂原始数据 将测序的原始序列数据（FASTQ）去除接头及低质量序列，经BWA软件比对至GRCh37/38（NCBI版本）或hg19/hg38（UCSC版本）人类基因组参考序列上，Picard 去除重复序列，使用GATK检测SNV与Indel变异，使用ANNOVAR进行变异注释。最后获得一份.vcf文件（图1）。
Func.refGene：变异所处参考基因的功能区（exonic，intronic，UTR3，UTR5，splicing，upstream，downstream，intergenic）（此处的exonic特指外显子编码氨基酸区，不包括外显子的UTR区） Gene.refGene：变异所处参考基因名称（如果是基因间，则是两侧的基因）GeneDetail.refGene：非外显子区处于特定转录本中的具体位置（如果是基因间，则是距离两侧的基因的距离） ExonicFunc.refGene：外显子区的变异类型（frameshift insertion，frameshiftdeletion，stopgain，stoploss，nonframeshift insertion，nonframeshiftdeletion，synonymous SNV，nonsynonymous SNV），如果这一栏是一个“.”的话，就说明该变异不在外显子区 AAChange.refGene：氨基酸水平的改变（同一个基因可能具有多个转录本，氨基酸改变的位置在不同的转录本中有可能不一样） 经注释后的vcf文件还会包含如下信息： CLINSIG：该变异在ClinVar数据库中的临床意义（Benign，Likely benign，Uncertain significance，Likelypathogenic，Pathogenic，Drug-response）CLINDBN：该变异所引起的疾病名称 CLINACC：该变异的登记号和版本号（VariantAccession and Versions）