食品中合成着色剂的测定方法

食品中合成着色剂的测定方法

食品中合成着色剂主要是以人工方法进行化学合成的有机色素类，按其化学结构不同可分为偶氮类色素和非偶氮类色素，偶氮类色素按溶解性不同又可分为油溶性和水溶性两类。合成类色素中还包括色淀。

食品中合成着色剂的种类很多，国际上允许使用的有30余种，我国允许使用的主要有苋菜红、胭脂红、赤藓红、新红、玫瑰红、柠檬黄、日落黄、亮蓝、靛蓝、牢固绿等。

6.1高效液相色谱法

1)原理

食品中的合成着色剂经聚酰胺吸附法或液一液分配法提取后，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性和与峰面积比较进行定量。

利用高效液相色谱法测定食品中合成着色剂的最小检出量为：新红5ng、柠檬黄4ng、苋菜红6ng、胭脂红8ng、日落黄7ng、赤藓红18ng、亮蓝26ng。当进样量为0.025g样品时，最低检出浓度分别为0.2、0.16、0.24、0.32、0.28、0.72、1.04mg／kg。

2)仪器和试剂

(1)仪器高效液相色谱仪，带紫外检测器。

(2)试剂

?正己烷。分析纯。

?盐酸。分析纯。

?乙酸。

?甲醇：经滤膜(0.45μm)过滤。

?聚酰胺粉(尼龙6)：过200目筛。

?乙酸铵溶液(0.02mol／L)：称取1.54g乙酸铵，加水至1 000mL，溶解，经滤膜(0.45μm)过滤。

?氨水：量取氨水2mL，加水至100mL，混匀。

?甲醇一甲酸(6+4)溶液：量取甲醇60mL，甲酸40mL，混匀。

?柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸(C6H8O7?H2O)，加水至100mL，溶解混匀。

?无水乙醇一氨水一水(7+2+1)溶液：量取无水乙醇70mL、氨水20mL、水10mL，混匀。

⑴三正辛胺正丁醇溶液(5％)：量取三正辛胺5mL，加正丁醇至100mL，混匀。

⑵饱和硫酸钠溶液。

⑶pH6的水：水加柠檬酸溶液调pH到6。

⑷合成着色剂标准溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.1000g，置100mL容量瓶中，加pH6的水到刻度。此溶液含着色剂1.00mg／mL。

⑸合成着色剂标准使用液：临用时合成着色剂标准溶液加水稀释20倍，经滤膜(0.45μm)过滤。配成每毫升相当50.0μg的合成着色剂。

3)操作步骤

(1)样品处理

①橘子汁、果味水、果子露、汽水等：称取20.0～40.0g，放入100mL烧杯中。含二氧化碳样品需要加热以驱除二氧化碳。

②配制酒类：称取20.0～40.0g，放l00mL烧杯中，加小碎瓷片数片，加热驱除乙醇。

③硬糖、蜜饯类、淀粉软糖等：称取5.00～10.00粉碎样品，放人l00mL小烧杯中，加水30mL，温热溶解，若样品溶液pH较高，用柠檬酸溶液调pH到6左右。

④巧克力豆及着色糖衣制品：称取5.00～10.00g放入100mL小烧杯中，用水反复洗涤色素，到巧克力豆无色素为止，合并色素漂洗液为样品溶液。

(2)色素提取

①聚酞胺吸附法：样品溶液加柠檬酸溶液调pH至6，加热至60℃，将1g聚酞胺粉加少许水调成粥状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，以G3垂熔漏斗抽滤，用60℃pH4的水洗涤3～5次，然后用甲醇一甲酸混合溶液洗涤3～5次(含赤藓红的样品用液一液分配法处理)，再用水洗至中性，用乙醇一氨水一水混合溶液解吸3～5次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL经滤膜(0.45μm)过滤，取l0μL。进行HPLC分析。

图8—6八种着色剂色谱分离图

1.新红；

2.柠檬黄；

3.苋菜红；

4.靛蓝；

5.胭脂红；

6.日落黄；

7.亮蓝；8.赤藓红

②液一液分配法(适用于含赤藓红的样品)：将制备好的样品溶液放入分液漏斗中，加2mL 盐酸、三正辛胺正丁醇溶液(5％)10～20mL，充分振摇提取，静置分取有机相，重复提取2～3次，每次10mL，直至有机相无色，合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗2次，每次10mL，分取有机相，放于蒸发皿中，水浴加热浓缩至l0mL，转移至分液漏斗中，加60mL正己烷，混匀，加氨水提取2～3次，每次5mL，合并氨水溶液层(含水溶性酸性色素)，用正己烷洗2～3次，分取氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5mL。

经滤膜(0.45μm)过滤，取10μL进高效液相色谱仪。如图8—6所示。

(3)高效液相色谱分析参考条件

①色谱柱：YWG-Cl8，10μm不锈钢柱，4.6mm×250mm。

②流动相：甲醇一乙酸铵溶液(0.02 mol／L)(pH4)。

③梯度洗脱：用浓度为20％～35％的甲醇洗脱5min；用浓度为35％～98％的甲醇5min；用浓度为98％的甲醇继续洗脱6min。

④流速：1mL／min。

⑤紫外检测器，波长254nm。

(4)测定取相同体积样液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。

4)结果计算

式中：

X——样品中着色剂的含量，mg／g；

m1——样液中着色剂的质量，μg；

V2——样品进样体积，mL；

V1——样品稀释总体积，mL；

m2——样品质量，g。

结果的表述：保留算术平均值的二位有效数，允许相对误差≤10％。

6.2薄层色谱法及纸色谱法

1)原理

水溶性酸性合成着色剂在酸性条件下，被聚酰胺吸附后与食品中的其他成分分离，经过滤、洗涤及在碱性溶液(乙醇一氨)中解吸附，再经薄层色谱法或纸色谱法纯化、洗脱后，用分光光度法进行测定，可与标准比较定性、定量。

2)仪器和试剂

(1)仪器

①可见分光光度计。

②微量注射器或血色素吸管。

③展开槽：25cm×6cm×4cm。

④层析缸。

⑤滤纸：中速滤纸，纸色谱用。

⑥玻砂漏斗G3(50mL)。

⑦抽气装置。

⑧恒温水箱。

⑨薄层板：5cm×20cm。

⑩电吹风机。

(2)试剂

?石油醚：沸程60～90℃。

?甲醇。

?聚酰胺粉(尼龙6)：200目，使用前于100℃洗化1h，放冷密封备用。

?硅胶G。

?硫酸(1+10)。

?甲醇一甲酸溶液(6+4)。

?氢氧化钠溶液(50g／L)。

?盐酸(1+10)。

?乙醇(50％)。

?乙醇一氨溶液：取1mL氨水，加乙醇(70%)至l00mL。

⑴pH6的水：用柠檬酸溶液(200g／L)调蒸馏水的pH至6。

⑵海砂、碎瓷片：先用盐酸(1+10)煮沸15min，用水漂洗至中性，再用氢氧化钠溶液(50g/L)煮沸15min，用水漂洗至中性，再于105℃干燥，储于具玻璃塞的瓶中备用。

⑶柠檬酸溶液(200g／L)。

⑷钨酸钠溶液(100g／L)。

⑸展开剂。

a.正丁醇一无水乙醇一氨水(1%)(6+2+3)：供纸色谱用。

b.正丁醇一吡啶一氨水(1％)(6+3+4)：供纸色谱用。

c.甲乙酮一丙酮一水(7+3+3)：供纸色谱用。

d.甲醇一乙二胺一氨水(10+3+2)：供薄层色谱用。

e.甲醇一氨水一乙醇(5+1+10)：供薄层色谱用。

f.柠檬酸钠溶液(25g／L)一氨水一乙醇(8+1+2)：供薄层色谱用。

⑹合成着色剂标准储备液：准确称取按其纯度折算为100％质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.100g，加少量pH为6的水溶解，再转移至100mL容量瓶中并定容至刻度。配制成的各着色剂标准储备液浓度为1.00mg／mL。

⑺合成着色剂标准使用液：临用时吸取合成着色剂标准溶液各5.0mL，分别置于50mL容量瓶中，加pH6的水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.10mg着色剂。

3)操作步骤

(1)样品的处理

①果味水、果子露、汽水：称取50.0g样品于100mL烧杯中。汽水需加热驱除二氧化碳。

②配制酒：称取100.0g样品于100mL烧杯中，加碎瓷片数块，加热驱除乙醇。

③硬糖、蜜饯类、淀粉软糖：称取5.00或10.0g粉碎的样品，加30mL水，温热溶解，若样液pH较高，用柠檬酸溶液调至pH4左右。

④奶糖类：称取10.0g粉碎均匀的样品，加30mL乙醇一氨溶液溶解，置水浴上浓缩至约20mL，立即用硫酸溶液(1+10)调至微酸性，再多加1.0mL硫酸，然后加入1mL钨酸钠溶液，使蛋白质沉淀，过滤后，用少量水洗涤，收集滤液。再用柠檬酸调pH至4。

⑤蛋糕类：称取10.0g粉碎均匀的样品，加海砂少许，混匀，用热风吹干样品(用手摸已干燥即可)，加入30mL石油醚搅拌。放置片刻，倾出含脂肪的石油醚，如此重复处理三次，以除去脂肪。吹干后研细，全部倒人玻砂漏斗中，用乙醇_氨溶液提取色素，直至着色剂全部提完，以下按奶糖类自“置水浴上浓缩至约20mL”起依法操作。

(2)吸附分离将处理后所得的溶液加热至70℃，用柠檬酸溶液(200g／L)调pH至4，加入0.5～1.0g聚酰胺粉充分搅拌，使着色剂完全被吸附，如溶液还有颜色，可以再加一些聚酰胺粉。

将吸附着色剂的聚酰胺全部转入玻砂漏斗中抽滤，用已被柠檬酸酸化至pH4的70℃热水反复洗涤，每次20mL，边洗边搅拌。若含有天然着色剂，再用甲醇一甲酸溶液洗涤1～3次，每次20mL，至洗液无色为止。再用70℃热水充分搅拌、洗涤沉淀，至洗液为中性。然后用乙醇一氨溶液分次解吸全部着色剂，收集全部解吸液，于水浴上驱氨。

如果为单色，则用水准确稀释至50mL，用分光光度法进行测定。如果为多种着色剂的混合液，则进行纸色谱或薄层色谱法分离后测定，即可将上述溶液置水浴上浓缩至2mL后移入5mL容量瓶中，用乙醇(50%)洗涤容器，洗液并人容量瓶中并稀释至刻度。

(3)定性分析

①纸色谱法：取层析滤纸，在距底边2cm处用铅笔划一条点样线，于点样线上间隔2cm 标记刻度。在每个刻度处分别点3～10μL样品纯化溶液和l～2μL着色剂标准溶液，各点直径不超过3mm，悬挂于分别盛有正丁醇一无水乙醇一氨水(1％)(6+2+3)、正丁醇一吡啶一氨水(1％)(6+3+4)的展开剂的层析缸中，用上行法展开，待溶剂前沿展至15cm处，将滤纸取出于空气中自然晾干，与标准色斑移动的距离(Rf值)进行比较定性。如Rf值相同即为同一色素。

也可取0.5mL样液，在起始线上从左到右点成条状，纸的左边点着色剂标准溶液，依法展开，晾干后先定性后再供定量用。靛蓝在碱性条件下易褪色，可用甲乙酮一丙酮一水(7+3+3)展开剂。

②薄层色谱法。

薄层板的制备：称取1.6g聚酰胺粉、0.4g可溶性淀粉及2g硅胶G，置于合适的研钵中，加15mL水研匀后，立即置涂布器中铺成厚度为0.3mm的板。在室温晾干后，于80℃干燥1h，置干燥器中备用。

点样：在距离板底边2cm处将0.5mL样液，从左到右点成与底边平行的条状，板的左边点2μL色素标准溶液。

展开：苋菜红与胭脂红用甲醇一乙二胺一氨水(10+3+2)展开剂，靛蓝与亮蓝用甲醇一氨水一乙醇(5+1+10)展开剂，柠檬黄与其他着色剂用柠檬酸钠溶液(25g／L)一氨水一乙醇(8+1+2)展开剂。取适量展开剂倒人展开槽中，将薄层板放入展开，待着色剂明显分开后取出，晾干，与标准斑移动的距离(Rf值)进行比较定性。如Rf值相同即为同一色素。

(4)定量分析

①标准曲线制备：分别吸取0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00mL胭脂红、苋菜红、柠檬黄、日落黄色素标准使用溶液，或0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL亮蓝或靛蓝色素标准使用溶液，分别置于10mL比色管中，各加水稀释至刻度。用1cm比色杯，以零管调节零点，于一定波长下(胭脂红510nm，苋菜红520nm，柠檬黄430nm，日落黄482nm，亮蓝627nm，靛蓝620nm)，测定吸光度，分别绘制标准曲线。

②样品的测定：将纸色谱的条状色斑剪下，用少量热水洗涤数次，直至提取完全，合并

提取液于人10mL比色管中，冷却后加水至刻度。 -

将薄层色谱的条状色斑包括有扩散的部分，分别用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇一氨溶液解吸着色剂，少量反复多次至解吸液于蒸发皿中，于水浴上挥去氨，移人10mL比色管中，加水至刻度，做比色用。

将上述样品液分别用1cm比色杯，以零管调节零点，按标准曲线绘制操作，在一定波长下测定样品液的吸光度，并与标准系列比较定量或与标准色列目测比较。

4)结果计算

式中：

X——样品中着色剂的含量，g／k；

m1——样品比色液中着色剂的质量，mg；

V1——样品解吸后总体积，mL；

V2——样液点板(纸)体积，mL；

m——样品的质量(或体积)，g(或mL)。

结果的表述：保留算术平均值的二位有效数。