病毒纯化-YaoFeng
First day
17:00点垫蔗糖梯度：SW41管20, 30, 40, 50, and 60 % 各2ml，4℃保存过夜Second day
9:300.45um滤膜过滤病毒，量大可用0.8um泵抽滤
10:00 18000rpm 离心1h 4℃
11:45 溶解病毒（1ml/管）
12:45 1000rpm离心5min去除大块不溶杂质
13:00 SW41超速离心。50000g 20h 4℃
Third day
11:00 收病毒
12:00 18000rpm 超速离心1h
13:30 溶解过夜
Fourth day
10:00 1000rpm离心5min 4℃分装
新冠病毒是如何用病毒保存液进行过程保存的
病毒保存液在核酸标本保存过程中起到了什么作用？ 核酸检测假阳性、假阴性的问题一直是专家们的心头病，而核酸标本的采集和保存成为影响检测结果的重中之重，很多专家从实践工作中总结出的经验认为，鼻咽拭子标本2019-nCoV核酸检测阳性率高于口咽拭子，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液标本阳性率高于上呼吸道的口、鼻咽拭子采集的标本，为了提高检测阳性率，建议采集同一病人多部位标本，合并进行检测，下面我们来看看标本在采集、运输、保存过程中应该注意哪些问题。 口、咽拭子采集注意事项 1.不要从鼻孔或扁桃体上采样 2.不建议雾化导痰 3. 下呼吸道标本（相对于上呼吸道标本）更可能呈阳性 4.对于怀疑患感染新型冠状病毒的患者，特别是肺炎或严重疾病的患者，单个上呼吸道标本不能排除诊断，建议增加上呼吸道和下呼吸道标本。 病毒保存液 标本采集方法：
用于2019-nCoV核酸检测标本主要是口咽拭子，采集时让患者张大嘴后用特制棉签或小刷头刮取其咽部采集带病毒标本。如果平时医护人员咽拭子取样不多，刮取标本时患者的反应又比较大，往往导致刮取标本的位置不对，或力度和时间不够，没有刮取到带病毒的标本或刮取到的带病毒标本量少，最后导致检测结果阴性。 标本运输及保存条件: 2019-nCoV为RNA病毒，很容易被外源性或细胞破坏后所释放的RNA酶降解，而影响最后的检测效率。严格来讲标本采集后应及时送到实验室（疾控中心、医院检验科、第三方实验室），尽快完成检测。标本在常温条件下放置时间过长，也可能是造成最后检测结果假阴性的原因，如果因为特殊需要需要长时间保存的话，可以用病毒保存液来保存RNA病毒样本，此外还可以使用防止病毒核酸降解的标本采集管，但目前此类产品数量少、成本高、实际应用效果也需要进一步评价。 总的来说，标本采集后应及时送检，及时检测，如因某些原因标本采集后不能及时送检或及时检测，应将采样后的拭子放入病毒保存液中,病毒保存液是病毒采样管内添加的用于保护病毒样本的保护性液体！
病毒纯化
现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。 在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。 病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。现在我们讲解每个步骤的一些细节。 1.在大型装置中培养细菌。为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。每种病毒的培养都有不同的步骤。脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价）。 2.富含病毒培养液的去除。病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。低速离心除去大分子的细胞残骸。 3.通过沉淀将病毒物质浓缩。由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。 4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。在后者中，病毒在离心试管中成为一个分离带，这一过程与对DNA的分离相同，离心须要高速，即120000g,且要进行好几个小时，最好是一整夜。离心管中的液体通过试管底部的一点点滴出来，要检测每一滴的病毒滴度。在合适的离心条件下，所有的病毒分子都集聚在一或两个组分中，所以它们是非常纯的。结晶脊髓灰质炎病毒。如果能在合适的条件下浓缩大量且高纯度的病毒，就可以获得病毒晶体。这种晶体为化学分析提供了很好的材料，且易于通过X射线衍射技术进行结构分析。本章的部分讲到的脊髓灰质炎病毒的计算机拟合就是从这种高浓度脊髓灰质炎的病毒晶体获得的。
病毒的分离纯化
病毒的分离纯化 我设计了一套方案，请大家批评指正： 1. 新鲜病叶200g，-70℃冰冻30分钟，以2倍体积0.2mol/L磷酸缓冲液（PH7.5，含0.1%巯基乙醇,2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA）。组织捣碎机捣碎，双层纱布过滤。 2. 滤液中加入等体积的氯仿，冰浴激烈搅拌15分钟，充分乳化后2000 g离心15分钟 3. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。冰浴搅拌，4℃下过夜，次日取出10000g离心20分钟。 4. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素），2小时后，2000g离心10分钟。 5. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。冰浴搅拌4小时，10000g离心30分钟。 6. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH 7.2，2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA，1mol/L尿素），4℃下4小时后，10000g离心10分钟。 7. 上清用10%～40%蔗糖密度梯度离心(30000r/min,1.5h)，收集病毒带，用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）稀释，123000g离心2小时。 8.沉淀用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）悬浮，5000g离心15分钟，上清即为提纯病毒制品。 lf_12345
非灭活型病毒保存液介绍520
非灭活型病毒保存液介绍 一、病毒的特征： 病毒是一类个体微小，无完整细胞结构，含单一核酸（DNA或RNA）型来，必须在活细胞内寄生并复制的非细胞型微生物。 1.含有单一知种核酸（DNA或RNA）的基因组和蛋白质外壳，没有细胞道结构，个体微小、 结构简单。 2.在感染细胞的同时或稍后释放其核酸，然后以核酸复制的方式增殖，而不是以二分裂方 式增殖； 3.严格的细胞内寄生性。病毒自身不能复制，而是将基因侵入宿主细胞内，借助后者的复 制系统复制新的病毒。 二、非灭活型病毒保存液特点： 1.低温非冻型保存，不破坏病毒的外壳，方便长途运输。 2.适用于各种拭子样品，包括口腔拭子、鼻腔拭子、咽喉拭子、等 3.可以用于H1N1流感病毒和其他任何可以用拭子取样的病毒。 4.可以用柱式病毒DNAout或柱式病毒RNAout提取病毒核酸。 5.采样液中的抗生素能有效防止细菌和真菌污染。 6.采样液添加了牛血清白蛋白，能保护病毒样本，提高分离率 三、德晟非灭活型病毒保存液成分： 1.保存液成分为：Hanks液基础,庆大霉素,真菌抗生素,BSA(V),冷冻保护剂、生物缓冲
剂及氨基酸等。 2.多种抗生素联合，具有抗细菌和抗真菌的作用。 3.牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白质稳定剂，可在病毒的蛋白质外壳形成一种保护膜，使 其不易分解，保证病毒的完整性。 4.Hanks缓冲液构建的中性环境，有助于增加病毒的生存时间和感染稳定性。 5.用于临床流感、禽流感(如H7N9)、手足口病、麻疹等病毒标本及支原体、脲原体、衣 原体等标本的采集及运送 四、使用方法： 注意：标本采集人员需按有关规定做好个人防护。咽、鼻拭子最好在发病的头3天采集。 1.在安全柜内本产品分装到自备的、螺旋盖内有橡胶圈的5mL旋盖塑料管里（一级容 器）。B型产品已经在旋盖离心管中，可以跳过此步。 2.鼻拭子的采集：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭 子拭两侧鼻孔。将棉签浸入上步得到的、装有3mL本产品的旋盖离心管中，弃去拭子尾部，拧紧螺旋盖。 3.咽拭子的采集：用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉签浸入第一步得到的、装 有3mL本产品的旋盖离心管中，弃去拭子尾部，拧紧螺旋盖。 4.直接在一级容器上用油性记号笔写明样本的种类、采样时间、编号、患者姓名。 5.将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；每袋装一份标本。同时也将标本有 关信息填在标本送检表上，连同一级容器封于塑料袋内。 6.将装标本的密封袋放入自备的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料容器（二级容器内，拧紧盖， 在容器上标明有关信息。同一患者2份以上的密封标本，可以放在同一个二级容器内。
病毒保存液和细胞保存液的区别
病毒保存液和细胞保存液的区别 一、病毒保存液 病毒保存液适用于新型冠状病毒、流感病毒、手足口病毒等常见病毒样本采集保存运输工作，是采样管内浸末采样拭子病毒样本一种保护病毒的被检测物质的液体，可采集咽拭子、鼻拭子或特定部位组织样本,储存的样本可用于后续的核酸提取或纯化等临床实验。通常分为两种，一种是非灭活型，能够保护病毒的蛋白和核酸，另一种是灭活型，通常含有灭活病毒的裂解盐，裂解蛋白而保护核酸。 1、灭活型：添加有裂解盐的病毒保存液就是灭活型的病毒保存液，里面含有的Tris、裂解盐、EDTA等主要目的是裂解核酸而释放出核酸，从而通过后续的实时荧光RT-PCR进行核酸检测，以此判断样本是否含有病毒特征核酸，即是否感染病毒。 核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是生命的最基本物质之一。病毒结构单一，就只含有一种核酸和蛋白质，因此检测出特征核酸就检测除了病毒。病毒属于寄生生物，采样后体外无法存活，如果不能及时检测，就需要放入病毒保存液中。为了保护病毒检测环境的安全性，就需要加入裂解盐来灭活病毒，释放出可以被检测的核酸即可。 2、非灭活型：除了灭活型的病毒保存液，此外还有非灭活型病毒保存液，不含裂解盐，但是保存的病毒完整性更好，检出率更高，除了核酸检测外还可以用于其他研究。灭活型病毒保存液则使用上更安全，操作环境要求也不用那么严格，各有各的优势，目前研究的非灭活病毒保存液的成分主要为Hank's液基础，在Hank's液基础之上，还添加了诸如庆大霉素、
真菌抗生素、BSA（牛血清白蛋白第五组分）、生物缓冲剂HEPES、氨基酸、冷冻保护剂、甘油等多种组分： 3、病毒样本采集方法： a .鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法釆集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3成釆样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。 b.咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml病毒保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖。 c.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集器）。 二、细胞保存液： 通常所说的细胞保存液是一种通用型的细胞冻存液，可用于冻存人和各种动物细胞株；细胞冻存是细胞培养、引种、保种和保证实验顺利进行的重要技术手段。在细胞建株和建系中，及时冻存原始细胞是十分重要的。在杂交瘤单克隆抗体的制备过程中，杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞的冻存保种常常是必不可少的实验操作。因为在没有建立一个稳定的细胞系或稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能因细胞的污染、分
病毒空斑纯化步骤
猪流行性腹泻病毒(PEDV)纯化分离方案 (1) 将已准备好的VERO细胞消化均匀铺于6孔板中。 (2) 细胞长成单层后吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度并向每孔滴加0.4ml稀释好的病毒液, 置37℃吸附2小时后弃残液。 (3) 制备2％的琼脂糖（PCR电泳胶一样的琼脂糖），置40－50℃水浴待用。 (4) 将上述琼脂糖和双倍维持液（1:1）混合后，加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成覆盖层。 (5) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。 (6) 制备含0.002％中性红的2%琼脂糖：双倍维持液（1:1），置40－50℃水浴待用。 (7) 吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成第二覆盖层。 (8) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48小时内观察结果。 (9) 挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。 主要问题： 1、铺完琼脂糖层之后，24h之后细胞轮廓模糊，不清晰。48h之后有些孔的细胞基本上看 不清了，但是这都不是病毒造成的。（支原体的存在会不会导致这种情况） 2、使用中性红染色在一开始就染色还是等病毒造成一定的噬斑再染色，覆盖一层还是两层 琼脂糖层？ 3、使用的琼脂糖是不是有问题，与琼脂区别大不大？ 4、之前按照这个方法加了中性红的琼脂糖层之后，细胞着色很不理想。看不出明显的染色 区域，只是有些红色的点点。 5、温度不会出现问题，因为把握的很好，细胞不会被烫死的。就是不知道自己配制的液会 不会由于渗透压的原因导致细胞死亡。 6、一直拿不出照片的原因就是没法看到空斑，板孔中不能显示出一个一个比较像样的噬 斑，我挑也是挑病变情况有点不一样的病灶。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法 方法一超速离心沉淀法 1 仪器 超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管 2 方法步骤 （1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。 （2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。 （3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。 （5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。 （6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。 （7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。管底可见少量的半透明或白色沉淀。将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。 （8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。 （9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。 （10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。 （11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。 （12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中，分装50ul/管，保存于成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃冻存。 方法二 PEG-8000浓缩法
非灭活型病毒保存液介绍520
非灭活型病毒保存液介绍520 展开全文 非灭活型病毒保存液介绍 一、病毒的特征： 病毒是一类个体微小，无完整细胞结构，含单一核酸（DNA 或RNA）型来，必须在活细胞内寄生并复制的非细胞型微生物。 1. 含有单一知种核酸（DNA或RNA）的基因组和蛋白质外壳，没有细胞道结构，个体微小、结构简单。 2. 在感染细胞的同时或稍后释放其核酸，然后以核酸复制的方式增殖，而不是以二分裂方式增殖；
3. 严格的细胞内寄生性。病毒自身不能复制，而是将基因侵入宿主细胞内，借助后者的复制系统复制新的病毒。 二、非灭活型病毒保存液特点： 1.低温非冻型保存，不破坏病毒的外壳，方便长途运输。 2.适用于各种拭子样品，包括口腔拭子、鼻腔拭子、咽喉拭子、等 3.可以用于H1N1 流感病毒和其他任何可以用拭子取样的病毒。 4.可以用柱式病毒DNAout 或柱式病毒RNAout 提取病毒核酸。 5.采样液中的抗生素能有效防止细菌和真菌污染。 6.采样液添加了牛血清白蛋白，能保护病毒样本，提高分离率 三、德晟非灭活型病毒保存液成分： 1.保存液成分为：Hanks液基础,庆大霉素,真菌抗生素,BSA (V) ,冷冻保护剂、生物缓冲剂及氨基酸等。 2.多种抗生素联合，具有抗细菌和抗真菌的作用。 3.牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白质稳定剂，可在病毒的蛋白质外壳形成一种保护膜，使其不易分解，保证病毒的完整性。 4.Hanks缓冲液构建的中性环境，有助于增加病毒的生存时
间和感染稳定性。 5.用于临床流感、禽流感(如H7N9) 、手足口病、麻疹等病毒标本及支原体、脲原体、衣原体等标本的采集及运送四、使用方法： 注意：标本采集人员需按有关规定做好个人防护。咽、鼻拭子最好在发病的头3 天采集。 1. 在安全柜内本产品分装到自备的、螺旋盖内有橡胶圈的5 mL 旋盖塑料管里（一级容器）。B 型产品已经在旋盖离心管中，可以跳过此步。 2. 鼻拭子的采集：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入上步得到的、装有 3 mL 本产品的旋盖离心管中，弃去拭子尾部，拧紧螺旋盖。 3. 咽拭子的采集：用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉签浸入第一步得到的、装有 3 mL 本产品的旋盖离心管中，弃去拭子尾部，拧紧螺旋盖。 4. 直接在一级容器上用油性记号笔写明样本的种类、采样时间、编号、患者姓名。 5. 将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；每袋装一份标本。同时也将标本有关信息填在标本送检表上，连同一级容器封于塑料袋内。 6. 将装标本的密封袋放入自备的带螺旋盖内有橡胶圈的
病毒的超低温保存法
中华试剂网 试剂·原料·仪器 https://www.360docs.net/doc/bf3867176.html, TEL: +86-21-34053660 Add: old humin Road, Shanghai 200237, P.R.C 病毒的超低温保存法 大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（如植物的病原性真菌），通常可用超低温的方法保存（ATCC 1983；Halliday，Baker 1985）。此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，再将这些小管贮存在—150～－196℃的液氮中。 超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC 常用一种由甘油（10％）、二甲基亚砜（5％）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内 膜的冷冻损伤。 贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时，所形成的冰晶会将细 胞杀死，正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。 超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。在长期贮存的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。 2.2 材料 病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管（Nunc Cryoflex），液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。 2.3 方法 （1）剪一段两端各超出冷冻管长度2cm 的热收缩塑料管。 （2）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。 （3）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。 （4）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。 （5）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。 （6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套）。（7）将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内，同时记录样品的详细的存放位置、实验编号和存放日期等。 （8）需要用时，迅速从液氮罐内取出所需样品，并投入37℃水浴箱中解冻后，用解剖刀片在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。拧开冷冻管的盖子时不需要除去热收缩塑料管。
病毒保存液中EDTA和tris的作用
EDTA、Tris、病毒保存液在病毒检测中的应用 新冠病毒全球肆虐的环境下，如何快速检查并隔离阳性感染者在控制疫情的作用就不言而喻了。在目前流行的标本采集与处理方法中，EDTA、Tris、病毒保存液在不同的阶段发挥着重要作用。这里做一个简要梳理。 鼻咽拭子：采样器用一只手轻轻握住人的头部，拭子插入另一种，通过鼻孔插入拭子进入，沿着下鼻梁的底部慢慢变深。因为鼻管是弯曲的，所以不要用力过猛，以免造成外伤性出血。什么时候拭子的尖端到达鼻咽腔的后壁，轻轻旋转一次（如果出现反射性咳嗽，请稍等片刻），然后慢慢取出药签并将药签的尖端浸入装有2-3ml病毒保存液（或等渗盐溶液，组织培养液）的试管。 粪便标本：取1ml样品处理液，取大约一个大小的样品。粪便标本处理溶液可以在实验室内部制备：1.211g tris，8.5g 氯化钠，1.1克无水氯化钙或1.47克含结晶的氯化钙水，溶于800毫升去离子水中。以8,000rpm离心5分钟，吸收上清液保留使用。 肛门拭子：将消毒棉签轻轻插入肛门深3-5厘米，然后轻轻旋转并拉出，立即将拭子放入15毫升螺口盖采样管中包含3-5ml病毒保存溶液，丢弃尾巴并拧紧管盖。 血液样本：建议使用含有EDTA抗凝剂的真空血管收集5ml血液样本。核酸提取应在
全血或血浆中进行根据核酸提取试剂的类型选择。对于血浆分离，整个血液应以1,500至2,000 rpm离心10分钟，然后将上清液收集在带螺帽的无菌塑料管中。 血清标本：用真空负压血液采集5毫升血液标本收集管。将标本在室温下放置30分钟，在1,500-2,000的范围内离心 rpm 10分钟，并在带螺帽的无菌塑料管中收集血清。其他材料：根据设计要求以标准化的方式收集。
病毒和病毒成份的提纯
第十四章病毒和病毒成份的提纯 一、病毒的提纯 (一)沉淀法 (二)层析法 (三)两相溶剂间分配系数法 (四)红细胞吸附法 (五)电泳法 (六)超速离心法 (七)超滤法 二、病毒蛋白亚单位的分离 三、病毒脂质的抽提 四、病毒糖类的抽提 一、病毒的提纯 所谓病毒提纯,就是应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质——DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。 病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定标准。 1.物理均一性 测定病毒样品的物理均一性,是证明其纯度的常用方法,包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。 2.病毒滴度与蛋白含量的比例 测定病毒材料的感染力或其血清学反应滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高,说明病毒的纯度越高。
3.免疫学反应 免疫反应单一而无非特异反应，则说明病毒材料比较纯净。 4.结晶形成 病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。 病毒提纯的主要依据和条件有: (1)病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖, 要在病毒不失活的前提下，使之从细胞中释放出来，去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒,病毒粒子被释放到细胞外，可以从培养液或尿囊液中提纯；而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA病毒，在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外，大量提纯时必须首先裂解细胞，使病毒大量释放。实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、蛋白酶解等物理和化学的方法。通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液，其中常含有大量的细胞碎片，一个有效的方法是以2000～6000r/min离心30～40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质。 (2)病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒，可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。 (3)对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子,可以采用分级分离的技术。当然不同的病毒，其生长特性及理化学性质不同，因此提纯方法也不尽一致。 (一)沉淀法 主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。 1.中性盐沉淀法 病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。 2.聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉的主要是分子量为2000～6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG
两种病毒保存液的比较：灭活与非灭活
两种病毒保存液的比较：灭活与非灭活 简介： 病毒保存液适用于新型冠状病毒、流感病毒、手足口病毒等常见病毒样本采集保存运输工作，是采样管内浸末采样拭子病毒样本一种保护病毒的被检测物质的液体，可采集咽拭子、鼻拭子或特定部位组织样本，储存的样本可用于后续的核酸提取或纯化等临床实验。通常分为两种，一种是非灭活型，能够保护病毒的蛋白和核酸，另一种是灭活型，通常含有灭活病毒的裂解盐，裂解蛋白而保护核酸,两者有着各自不同的特点，有着不同的应用方向。 一、灭活型病毒保存液： 核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是生命的最基本物质之一。病毒结构单一，就只含有一种核酸和蛋白质，因此检测出特征核酸就检测除了病毒。病毒属于寄生生物，采样后体外无法存活，如果不能及时检测，就需要放入病毒保存液中。为了保护病毒检测环境的安全性，就需要加入裂解盐来灭活病毒，释放出可以被检测的核酸即可。 灭活型病毒保存液主要是核酸提取裂解液改良的病毒裂解型保存液，里面添加有高浓度的裂解盐，能够迅速高效地使待测样本利的病毒蛋白裂解失活，可以有效防止操作员二次感染，同时又含有Rnase酶抑制剂，能保护病毒核酸不被降解，里面含有的Tris、裂解盐、EDTA 等主要目的是裂解核酸而释放出核酸，从而通过后续的实时荧光RT-PCR进行核酸检测，以此判断样本是否含有病毒特征核酸，即是否感染病毒。灭活型保存液能在常温下保存相对较长的时间，节省了病毒样品保存以及运输的成本。 灭活型病毒保存液产品的特点：
1.操作使用简单，无需配液，体系内含有高效病毒裂解液，采样后即刻灭活病毒，有效防止二次感染风险，保障运输及检测人员安全； 2.病毒DNA/RNA可在常温保存与运输1周不降解，按大多数商业化试剂盒进行提取后，获得的DNA/RNA质量好，得率高，可完成各种基因检测及分析实验，如PCR、qPCR等，同时节省运输成本； 3.内含核酸RNA酶抑制剂，最大化程度保护病毒核酸稳定不被降解，大幅提高核酸提取效率。 4.适用于新冠病毒、流感病毒、手足口病毒等常见病毒样本采集保存运输工作，可采集咽拭子鼻试子或特定部位组织样本，储存的样本可用于后续的核酸提取或纯化等临床试验。 二、非灭活型病毒保存液： 非灭活型病毒保存液，不含裂解盐，但是保存的病毒完整性更好，检出率更高，主要是以运送培养基为基础改良的病毒维持液型保存液，除了核酸检测外还可以用于其他研究。这一种是同时保留了病毒的蛋白质外壳以及病毒核酸DNA或者RNA，这样病毒在体外具有蛋白抗原表位和核酸的完整性，当然操作失误时也有一定的感染性风险。其成分通常含有Hanks液基础,庆大霉素,真菌抗生素,BSA(V),冷冻保护剂、生物缓冲剂及氨基酸等，保护病毒蛋白质外壳不易分解，最大程度地保持了病毒样本的原始性，采样后长时间保存需要保持严格低温。 非灭活型病毒保存液特点： 1.低温非冻型保存，不破坏病毒的外壳，方便长途运输。 2.适用于各种拭子样品，包括口腔拭子、鼻腔拭子、咽喉拭子等 3.可以用于H1N1流感病毒和其他任何可以用拭子取样的病毒。 4.可以用柱式病毒DNAout或柱式病毒RNAout提取病毒核酸。
PEG沉淀法-病毒提纯方法
1. Viruses such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation. 2. Adjust the pH of the virus-containing supernatant to Polyethylene glycol (PEG, MW 6,000) is added to a final concentration of 8% (w/v). 3. Stir at 4℃for 2 hours. 4. Centrifuge at 10,000 x g for 2 hours. 5. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( ., RNase-free ddH2 for virus RNA prep). 沉淀法-病毒提纯方法 主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。 1.中性盐沉淀法：病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。 2.聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为2 000～6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年) 成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。 3.有机溶剂沉淀法：甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。 4.等电点沉淀法：病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。多数病毒的等电点在～之间，因此在pH3～6范围内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀，此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时，必须注意pH对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。 5.皂土法：Girin(1989年)应用皂土在酸性条件下(pH4～吸附轮状病毒SA-11，再在碱性条件下（），又使其洗脱下来，从而达到纯化目的。 6.鱼精蛋白沉淀法：鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于50nm的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/LNaCl时，病毒又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm的异种蛋白质。 聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)( Polyethylene Glycol 简写为PEG)，它的亲水性强，溶于水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的PEG。 PEG 的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液pH 和温度等因素的影响。在一定的pH 值下，盐浓度越高，所需PEG 的浓度越低，溶液的pH 越接近目的物的等电点，沉淀所需PEG 的浓度越低。在一定范围内，高分子量和高浓度的PEG 沉淀的效率高。以上这些现象的理论解释还都仅仅是假设，未得到充分的证实，其解释主要有：①认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。②由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。④通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。 有机聚合物沉淀的优点是：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性；②沉淀效能高，使用很少量的PEG 即可以沉淀相当多的生物大分子；③沉淀后有机聚合物容易去除。 水溶性非离子型聚合物沉淀法常用的聚合物为聚乙二醇（PEG）及硫酸葡聚糖。水溶性聚合物沉淀蛋白质的机制尚不清楚，大致有如下解释：①聚合物与蛋白质形成共沉物；①聚合物与蛋白质之间发生水的重分配；①聚合物与蛋白质形成复合物。此法受许多因素影响，主要是pH、离子强度、蛋白质浓度和PEG的分子量等。分子量为2000～6000的PEG皆适宜于做蛋白沉淀用。如若使用得当，效果甚为满意。一般认为，PEG浓度在3％～4％时沉淀免疫复合物，6％～7％可沉淀IgM，8％～12％可沉淀IgG，12％～15％可沉淀其他球蛋白，25％可沉淀白蛋白。最突出的应用是用3％～4％的PEG沉淀免疫复合物，未结合的抗原和抗体留在溶液中。按此原理设计了快速测定法和循环免疫复合物测定法 从网上搜索到得关于PEG沉淀提纯病毒的方法，先汇总至此贴，希望大家支持本版 1、用超声波或冻融的方法使细胞破碎释放出病毒； 2、慢慢搅动并加入NaCl终浓度是L,有助于病毒的沉淀，再等量加入10％PEG(一般使用的是PEG6000就可以了。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 一、包装细胞293T细胞的培养 一、293T细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7.将细胞离心，1000rpm，2min。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。 4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。 三、293T细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。 5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下 5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer), 5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and 5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe) 2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat. no. 4304437) 3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat. no. 401970) 4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat. no. 4316844) 用于包装的293T细胞的培养 用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达到100%。 慢病毒的包装 1. 预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。
病毒保存液的用途及标本采集方法
病毒保存液的用途及标本采集方法 本产品用于流感病毒、手足口病毒、麻疹风疹病毒、冠状病毒等各种病毒及 相关样本的采集和常温运输。它可在快速灭活病毒和酶的活性，同时能保护病毒 的核酸在常温下 4 天不降解，方便样品的运输。本产品具有以下特点： 1. 一 站式，含有拭子样品采集和保存的所有试剂和耗材。 2. 含病毒快速灭活试剂， 可以 1 分钟之内灭活各种 DNA 病毒和 RNA 病毒，使之失去传染性。 3. 含 有高效酶灭活试剂，可以快速灭活包括 DNase 和 RNase 在内的各种酶，使 得病毒蛋白失去活性。 4. 含有特殊的核酸保护和稳定试剂，可以保护释放出来 的病毒 DNA 和病毒 RNA 在常温下 4 天内无明显的降解。 5. 可用于各种拭 子样品，包括口腔拭子、咽喉拭子、鼻腔拭子、阴道拭子等等。 6. 保存的样品 可以在常温运输，尤其适用于远距离采样和运输。 7. 本试剂盒一次采样可以进 行 5 次核酸提取（如果使用柱式病毒 RNAout 或柱式病毒 DNAout ）。 灭活型病毒保存液 非灭活型病毒保存液 标本采集方法 1.咽拭子:用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁， 将拭子头浸入含3ml 病毒保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓 冲液)的管中，尾部弃去，旋紧管盖。 2.鼻拭子:将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻 后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧 鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3ml 采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。 3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物:用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从 气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器 头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml 采样液冲洗收集器1次(亦可用小 儿导尿管接在50ml 注射器.上来替代收集器)。 本产品适用于新型冠状病毒、流感病毒、手足口病毒等常见病毒样本采集保 存运输工作。可采集咽拭子、鼻拭子或特定部位组织样本,储存的样本可用于后 续的核酸提取或纯化等临床实验。
(完整版).细胞保存液-产品技术要求
细胞保存液产品技术要求
医疗器械产品技术要求编号： 细胞保存液 1.产品型号/规格及其划分说明 1.1 规格 1.2 组成成分及装量 表1 宫颈脱落细胞保存液主要组成成分 配制完毕后，调节pH值至8.0（±0.2）。 2.性能指标 2.1 外观 细胞保存液内容物为清亮液体，无色、无絮状纤维、颗粒杂质，振荡可产生白色泡沫。 2.2 pH值 在25℃下，测试细胞保存液的pH值，应为8.0±0.2。 2.3 细胞保存效果 2.3.1 将人体细胞株悬液加到细胞保存液中，提取DNA，PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，应有效检出人β球蛋白基因（250bp），且条带位置正确，无HPV基因检出。 2.3.2 将插入HPV18型L1基因的Hela细胞悬液加到细胞保存液中，提取DNA，PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，应有效检出人β球蛋白基因（250bp）和HPV基因（450bp），且条带位置正确。 2.4 批间差
三个批次细胞保存液的ΔpH应≤0.3。 3.检验方法 3.1 外观 目测外观，应符合2.1的要求。 3.2 pH值 在25℃下用pH计测定细胞保存液的pH值，应符合2.2的要求。 3.3 细胞保存效果 3.3.1 将人体细胞株悬液加到细胞保存液中，使其终浓度为50个细胞/μL，提取保存液中DNA，使用β球蛋白基因引物和HPV通用引物MY09/11扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为有效检出人β球蛋白基因（250bp），且条带位置正确，无HPV基因检出，符合2.3.1的要求。 3.3.2 将插入HPV18型L1基因的Hela细胞悬液加到细胞保存液中，使其终浓度为50个细胞/μL，提取保存液中DNA，使用β球蛋白基因引物和HPV通用引物MY09/11扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为有效检出人β球蛋白基因（250bp）和HPV基因（450bp），且条带位置正确，符合2.3.2的要求。 3.4 批间差 抽取三个批次的细胞保存液，25℃下，分别用pH计测定其pH值，计算最大pH值与最小pH值之差，即ΔpH，应符合2.4的要求。
2020年病毒纯化浓缩方法
作者：非成败 作品编号：92032155GZ5702241547853215475102 时间：2020.12.13 病毒纯化浓缩方法 方法一超速离心沉淀法 1 仪器 超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管 2 方法步骤 （1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。 （2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。 （3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。 （4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，
对剩下3管进行同样处理。 （5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。 （6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。 （7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。管底可见少量的半透明或白色沉淀。将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。 （8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。 （9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。 （10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。 （11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。 （12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中，分装50ul/管，保存于成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃冻存。 方法二 PEG-8000浓缩法 (1)5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。 (2)使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液； (3)每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000+NaCl母液7.5 ml； (4)每20～30min混合一次，共进行3-5次； (5)4度放置过夜； (6)4度，4000 g，离心 20min； (7)吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；