3-磷酸甘油醛脱氢酶活性检测方法的改良及应用
磷酸钙法细胞转染试剂盒
磷酸钙法细胞转染试剂盒 简介： 外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。Leagene 磷酸钙法细胞转染试剂盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)是在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性，可用于磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。HEK293是最适合磷酸钙法转染的细胞之一，优化条件后转染效率可以高达85%以上，一般的转染效率可达40～50%左右。其他常见细胞(例如Hela 、CHO 细胞等)也适合磷酸钙法转染，但效率比293细胞要略低一些。 本转染试剂盒主要适合于大多数贴壁细胞的转染，也可于一些悬浮细胞的转染，一般要求DNA 浓度在10～50μg 为宜，Hela 、BALB 等细胞沉淀放置16h ，CHO 、DUKX 、B Ⅱ等细胞可以通过甘油、DMSO 进行热休克处理以提高转染效率。 组成： 自备材料： 1、 胰蛋白酶消化液 2、 完全培养基 3、 PBS 4、 无菌水 操作步骤(仅供参考)： (一)贴壁细胞转染： 1、 在转染前用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，待细胞密度达即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。 2、 在加入DNA 之，加入不含抗生素的完全培养液，置于CO 2培养箱培养。 3、 取DNA(体积不宜超过20μl)加入Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。 编号 名称 CZ0008 100T CZ0008 200T Storage 试剂(A): Calcium chloride solution 10ml 20ml -20℃ 试剂(B): BBS solution 10ml 20ml -20℃ 使用说明书 1份
3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性检测试剂盒说明书 微量法
3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC2215 规格：100T/96S 产品内容： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存。 试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体12uL×1支，4℃保存。临用前加入0.4mL蒸馏水充分混匀，或根据比例现配现用；用不完的试剂4℃保存一周。 产品说明： GAPDH（EC1.2.1.12）催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。 3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD+，340nm处测定NADH的减少量可反映GAPDH活性的高低。 试验中所需的仪器和试剂： 紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 血清（浆）：直接检测。 二、测定步骤： 1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，分光光度计蒸馏水调零。 2、工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，根据需要取一定的量置于37℃(哺乳动物) 或25℃(其它物种)预热10min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 3、操作表：在微量石英比色皿或96孔板中分别加入下列试剂： 试剂名称空白管测定管 样本（μL）6 蒸馏水（μL）6 试剂三（μL）44 试剂五（μL）190190在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值 A1，迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴或培养箱5min（酶标仪有控温功能可将温度调至37℃或25℃），拿出迅速擦干测定5min10s时的吸光值A2，计算△A测定管=A2测定-A1测定，△A空白管=A2空白-A1空白，△A=△A测定管-△A空白管。空白管只需做一次。 三、GAPDH酶活计算： 1、按微量石英比色皿计算： （1）按蛋白浓度计算 酶活定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 GAPDH酶活（U/mg prot）=△A÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Cpr）÷T =1072×△A÷Cpr （2）按样本质量计算 酶活定义：每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 GAPDH酶活（U/g鲜重）=△A÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T
【CN110596256A】一种同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇酯的方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910349646.3 (22)申请日 2019.04.28 (71)申请人 福建省疾病预防控制中心（福建省 健康教育促进中心、福建省卫生检 验检测中心） 地址 350001 福建省福州市津泰路76号 (72)发明人 傅武胜 郑晓玲 高博 肖晶 林丽珊 郑奎城 陈镜泽 (74)专利代理机构 深圳国海智峰知识产权代理 事务所(普通合伙) 44489 代理人 王庆海 刘军锋 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (54)发明名称 一种同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇 酯的方法 (57)摘要 本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉 及一种同时检测食品中缩水甘油酯和氯丙醇酯 的方法。包括如下步骤：(1)称取油脂样品并加内 标液；(2)溴代反应：用溴化钠-硫酸溶液对油脂 样品中的缩水甘油酯进行溴代反应；(3)酸水解 反应：用硫酸－甲醇溶液对溴代产物以及油脂/ 脂肪中原有的氯丙醇酯进行酸水解反应；(4)基 质分散固相萃取净化：用装有硅藻土的固相萃取 柱净化酸水解液(5)衍生化反应：用七氟丁酰基 咪唑衍生净化后的酸水解液(6)色谱-质谱检测 分析。本发明将缩水甘油酯和氯丙醇酯分别转化 成3-溴-1,2-丙二醇和氯丙醇并用七氟丁酰基咪 唑衍生，实现了缩水甘油酯和氯丙醇酯的一次性 同时检测。相较于差量法计算缩水甘油酯的含 量，本发明的检测方法准确度高，工作量小，检测 成本低。权利要求书2页 说明书10页 附图6页CN 110596256 A 2019.12.20 C N 110596256 A
乳酸脱氢酶
乳酸脱氢酶 科技名词定义 中文名称：乳酸脱氢酶 英文名称：lactate dehydrogenase;LDH 定义：广泛存在的催化乳酸和丙酮酸相互转换的酶。L-乳酸脱氢酶(编号：EC 作用于L-乳酸； D-乳酸脱氢酶(编号：EC 作用于D-乳酸，两者均以NAD＋为氢受体。在厌氧酵解时，催化丙酮酸接受由3-磷酸甘油醛脱氢酶形成的NADH的氢，形成乳酸。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 求助编辑百科名片 催化机理 乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶。乳酸脱氢酶存在于机体所有组织细胞的胞质内，其中以肾脏含量较高。乳酸脱氢酶是能催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶，几乎存在于所有组织中。同功酶有五种形式，即LDH－1（H4）、LDH-2（H3M）、LDH－3（H2M2）、LDH-4（HM3）及LDH-5（M4），可用电泳方法将其分离。LDH同功酶的分布有明显的组织特异性，所以可以根据其组织特异性来协用诊断疾病。正常人血清中LDH2，〉LDH1。如有心肌酶释放入血则LDH1〉LDH2，利用此指标可以观察诊断心肌疾病。 目录 基本信息 临床意义 乳酸脱氢酶及其同工酶的简介 血清乳酸脱氢酶（LDH）同工酶测定及意义 乳酸脱氢酶高的原因 乳酸脱氢酶偏低的原因 乳酸脱氢酶（LDH）实验 基本信息 临床意义 乳酸脱氢酶及其同工酶的简介
编辑本段基本信息 英文名称：LDH（lactate dehydrogenase） 序列信息：1 gsgcnldsar frylmg 长度:16 aa{物种来源:Homo sapiens (human)} 正常范围：血清～L； 尿560～2050U/L； 脑脊液含量为血清的1/10。 编辑本段乳酸脱氢酶及其同工酶的简介 乳酸脱氢酶[1]（LD）分子量为135～140KD，由两种亚单位组成：H（表示heart）和M（表示muscle）。它们按不同的形式排列组合形成含4个亚基的5种同工酶，即：LD1（H4）、LD2（H3M1）、LD3（H2M2）、LD4（HM3）、LD5（M4）。 LD催化丙酮酸与乳酸之间还原与氧化反应，在碱性条件下促进lactic acid向pyruvic acid方向的反应，而在中性条件下促进pyruvic acid向lactic acid的转化（为逆反应）。LD是参与糖无氧酵解和糖异生的重要酶。 由于LD几乎存在于所有体细胞中，而且在人体组织中的活性普遍很高，所以血清中LD的增高对任何单一组织或器官都是非特异的。在AMI时升高迟、达峰晚，故对早期诊断价值不大。由于半寿期长（10～163小时），多用于回顾性诊断，如对人院较晚的AMI病人、亚急性MI的诊断和病情监测医学教育`网搜集整理。 LD在组织中的分布特点是心、肾以LD1为主，LD2次之；肺以LD3．LD4为主；骨骼肌以LD5为主；肝以LD5为主，LD4次之。血清中LD含量的顺序是LD2>LD1>LD3>LD4>LD5.
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)试剂盒说明书
货号：MS2205 规格：100管/96样 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)试剂盒说明书 微量法 正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。 测定原理： 3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH活性的高低。 自备实验用品及仪器： 分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液一：液体100mL×1瓶，4℃保存。 提取液二：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存； 试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存； 试剂三：液体14uL×1支，4℃保存； 组织样本的前处理： ①总GAPDH酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定。 ②胞浆和叶绿体GAPDH酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一），冰浴匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆GAPDH酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g 离心10min，取上清测定叶绿体中GAPDH酶活性。 建议测定总GAPDH酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的GAPDH，则按照步骤②提取粗酶液。 细菌或培养细胞的前处理： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 第1页，共2页
磷酸钙转染法
磷酸钙转染法 材料： 质粒DNA 指数生长的真核细胞 2 M CaCl2 2×HBS （pH 7.05） 配方: 2×HBS (pH7.05)：900 ml 超纯水中加入NaCl 16.3 g, KCl 0.74 g, Na2HPO4 0.214g，Glucose 2.4 g和HEPES 10 g，调pH至7.05，定容至1 升，过滤（0.2μm 滤膜）后储存于4℃备用。 方法： 1. 细胞分盘：通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以1×105至4×105细胞/cm2的密度平铺细胞于60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的40~70％）。将细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育8~24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前2 h换液（用4 ml 新鲜的完全培养基置换旧的培养基）。 注：为得到较高的转染效率，尽量使用指数生长的细胞，转染时细胞的密度不超过80％。 2. 制备磷酸钙－DNA 沉淀：以60 mm 组织培养皿用500μl 反应总体积为例。在灭菌水中加入质粒DNA（总量4~10μg为佳），再加入31 μl 2 M CaCl2，使三者总体积达到250 μl，混匀。将等体积2×HBS 盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀。静置 2 min 后，立即将这500 μl 的磷酸钙－DNA悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。 注：可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色，应尽快将其混匀，避免形成过大的颗粒，影响转染效率。 3．若转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含5％CO2的37℃温箱孵育。8 h后吸去培养基与DNA 沉淀，加入5 ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，16-40 h观察其转染效率。
真核细胞转染操作方法
一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。 一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶，则更需要使用真核转染技术。由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。 利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途： (1) 通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。 (2) 对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。 (3) 大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。
(4) 研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的 情况。 (5) 通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。 (6) 使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为 mRNA的基因组序列 得到表达。 (7) 揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。 DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。 进行真核转染的一般程序： 克隆目的基因(经测序验证)-准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中-转染-筛选-鉴定 下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。 一、试剂准备 1、HBS(Hepes-buffered saline)：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。 2、核酸贮存液，过滤除菌。 3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。 二、操作步骤 (一)克隆目的基因 1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。 2、回收特异性扩增片段，连入T载体。 3、转化DH5α，质粒制备。 4、酶切初步鉴定，测序证实。 (二) 真核重组表达载体的构建：
甲基丙烯酸缩水甘油酯安全使用说明书
GMA安全使用数明书 1.化学产品和公司标识 商标名称：宇浩牌 分子式： C 7H 10 O 3 分子量： 142.15 生产商：夏邑县宇浩助剂有限责任公司 地址：河南省夏邑县李集镇开发区 2.产品技术指标 性质典型值 分子量142.2 状态清澈液体 纯度，% ≥99.5 密度25℃（77℉），g/l 1.074 沸点760Hg，℃（℉）195(383) 含水量,% max 0.15 颜色,Pt-Co max 25 水溶性20(℃)/68(℉),g/g 0.023 表氯醇,ppm max 99 TG℃/(K) 75(348) 含氯,% max 0.25 阻聚剂(MEHQ),ppm ≤100 3.危害信息 危害概论：无色透明液体。可燃！蒸汽具有毒性，单体会刺激眼睛，皮肤，以及呼吸系统 1)：此产品会严重刺激眼睛，引起角膜损伤 2)：此产品会刺激或烧伤皮肤 3)：吸入此产品的气体会刺激上呼吸道。在高温下，高浓度蒸汽带来危害甚至死亡 4)：如果吞食此物质会导致喉咙烧伤、肠胃刺激及溃疡 慢性危害警告：对活体动物研究显示，GMA会对精子形态及数量产生影响，虽然这并不由职业接触这一暴露途径引起。职业暴露限制为1ppm 过度暴露影响：口服LD 50为700mg/Kg，低于中等水平；皮肤吸收（兔）LD 50 为 480mg/Kg，直接与此物质接触会引起严重皮肤烧伤，长期暴露吸收的有害剂量可以致死。过度暴露在高温蒸汽中会引发死亡。 4.处理方法 眼睛：保持眼睑张开，立刻使用水冲洗至少15分钟。送医务处理
皮肤：立即使用大量的水冲洗接触的皮肤并脱去污染衣服和鞋，送医务处理。污染衣物在未洗涤前不要再使用，销毁被污染的鞋子。 吸入：如果吸入后，将受害者转移至空气新鲜处。 吞食：不要诱导呕吐，以免上涌的胃液被吸入肺部。饮用适量的水或牛奶并立即就医处理。除非患者意识清醒，否则禁止给其卫视任何东西。 5.防火措施 闪点(闭口杯)：85℃ 燃烧范围（摩尔％，100℃）：1.1下限 自燃温度：没有相关数据 分解温度：没有相关温度 燃烧的危害：由于挥发性低，GMA的火灾危害性不大；但单体在高温下不稳定，储存容器应有适合大小的通风孔以减少这一隐患。其蒸汽具有毒性 灭火介质：用二氧化碳、干粉、雾状水、抗醇泡沫灭火 灭火设备及建议：灭火员应穿全套防护服和配戴正压自吸式呼吸器 其他信息：移走火场附近的包装容器或洒水喷雾使之冷却。 6.意外泄漏处理 紧急处理：立刻隔离泄漏或倾倒区域。让不相关人员远离。人员处于上风向，在进入前对隔离区域进行通风。消除所有燃烧源（严禁吸烟、点火、火花、火焰、非防爆电子设备）。不能接触或穿过泄漏物质。如果能做到，应立即停止倾倒。清理时应穿戴合适的个人防护装备。小面积泄漏：使用干沙或聚丙烯基质吸收剂覆盖并装到容器中以备以后处理。大量泄漏：在泄漏液体前围堤以备以后处理。防止进入水渠，下水道，地下室。用水冲洗前要做好适当处理废水的计划；没有具备生物降解能力及被认可的工业设备时，不要使用大量的水冲洗。最好使用真空油槽车处理。 7.处理和储存 处理过程：避免与皮肤和眼睛接触。衣服更换后充分洗涤。交接班后应进行淋浴、洗涤交接班的衣物。应将个人衣物及工作物品分别储存。储存和使用该产品的地方，不得携带、储存和使用食品、饮料和香烟；使用食品、饮料和香烟前应充分洗脸和手。 储存过程：将此物质保存在清凉，通风的地方。应保持在15℃储存以避免凝固而导致阻聚剂分离，不要与引发有害聚合及单体变色的生铁、软钢、紫铜和黄铜等接触。不能在明火、热源或其他燃烧物附近处理或储存，避免阳光直射和其他紫外辐射以及酸。搬运时轻装轻放 碱和氧化、还原性物质。储存区域需带有自动洒水系统或其他适合的消防系统。搬运时轻装轻放，需有足够的通风和防护措施。使用通常的连接或接地技术避免电荷累积。 8.暴露控制/个人防护 工艺控制：提供足够的局部排气通风，来保持工作环境低于暴露极限。建议在周围或限制区域安装局部通风装置 眼睛/面部的保护装备：穿戴化学品眼罩，安全帽
3-磷酸甘油醛脱氢酶
货号：QS2205-25 规格：25管/24样 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)试剂盒说明书 分光光度法 正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。 测定原理： 3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH活性的高低。 自备实验用品及仪器： 分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：30mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存； 试剂二：液体25mL×1瓶，4℃保存； 试剂三：液体×1支，4℃保存； 样本的前处理： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、样本测定 （1）工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟；现配现用。 （2）在试剂三中加入500μL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂4℃保存一周。 （3）在1mL石英比色皿中加入30μL样本、20μL试剂三和950μL工作液，混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，记录340nm处20s时的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。 第1页，共2页
转化和转染
转染和转化的区别 转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。 基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。 转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。通过感染方式将外来DNA 引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。转染是转化的一种特殊形式。 基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。 载体:能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。 转化:指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。 感染:以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。 转导:指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。 转染:指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。 基因转染 基因转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。 基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，
各种转染方法比较
各种转染方法比较 转染方法原理主要应 用 特点主要的厂家及产品 DEAE－葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核酸 带负电的磷酸骨架相互作用形成 的复合物被细胞内吞 瞬时转 染 相对简便、重复比磷酸钙好,但对细 胞有一定的毒副作用,转染时需除血 清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS 细胞系 Sigma-Aldrich(DEAE-Dextran Transfection Kit) DNA复合物吸附细胞膜稳定转 染,染瞬 转染 不适用于原代细胞（所需的DNA浓 度较高）,操作简便但重复性差,有些 细胞不适用 细胞建议用CSCL梯度离心，转染 是拷贝数较多 GIBCO BRL，Promega 阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的 磷酸基团形成复合物，然后脂质 体上剩余的电核与细胞膜上的唾 液酸残基的负电核结合；另一种 解释是通过细胞是内吞作用而被 进入细胞。(若DNA浓度过高， 中和脂质体表面电核，而降低了 与细胞的结合能力) 稳定转 染,瞬时 转染,所 有细胞 使用方法简单，可携带大片段DNA， 通用于各种类型的裸露DNA或 RNA，能转染各种类型的细胞，没 有免疫原性。虽在体外基因转染中 有很高的效率，但在体内，能被血 清清除，并在肺组织内累积，诱发 强烈的抗炎反应，导致高水平的毒 性，这在很大程度上限制了其应用 Invitrogen（Lipofectamine 2000，Lipofectamine， Lipofectin，Lipofectamine Plus，Cellfectin） Roche（Dosper，DOTAP，FuGENE 6） CPG Biotech Co（GeneLimo Plus，GeneLimo Super） Promega（Transfast，Tfx， Transfectam）
3- 磷酸甘油酸激酶(3- Phosphoglycerate kinase ,PGK )试剂盒说明书
货号：MS2208 规格：100管/96样 3-磷酸甘油酸激酶 （3-Phosphoglycerate kinase，PGK）试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义； 3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化1，3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸，产生1分子ATP，具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。 测定原理； 3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸，340nm处的吸光度变化反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。 自备实验用品及仪器； 天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板。 试剂组成和配制； 提取液：液体100mL×2瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加2mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂三：粉剂×1支，-20℃避光保存。临用前加1mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂四：粉剂×1支，-20℃避光保存。临用前加1 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂五：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加4 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 酶液提取； ①总PGK酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，500g离心5min，取上清测定。 ②胞浆和叶绿体PGK酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液），冰浴匀浆后于4℃，500g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆PGK酶活性，取沉淀加1mL提取液，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，500g离心5min，取上清测定叶绿体中PGK酶活性。 建议测定总PGK酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的PGK，则按照步骤②提取粗酶液。 测定操作； 1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 第1页，共2页
RNA干扰载体的构建的实验经过流程
RNA干扰载体的构建的实验流程 RNA干扰载体主要用来研究基因表达调控，RNA干扰技术已已被广泛用于基因结构功能研究和传染性疾病及基因治疗领域，进行RNA 干扰实验首先是构建RNA干扰载体，本文以pRI系列载体为例论述了干扰载体的构建的实验流程。 产品技术背景 pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。 pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间内对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。插入寡核苷酸设计
pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。 合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体XhoI，BglII位点之间，位于载体上H1启动子下游正确的位置上。连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。 1. 选择干扰序列 在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效果。我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列： 推荐长度为19 nt，采用21 nt序列也可以取得良好效果。 RNA干扰序列中不包含大于3 nt的连续相同碱基。 RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平(推荐GC含量在35%到50%之间)。 不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。确保RNA干扰序列与其它基因没有较高的同源性。 方向：在编码mRNA的正义链上选择RNA干扰序列。
3- 磷酸甘油酸激酶
货号：QS2208 规格：50管/48样 3- 磷酸甘油酸激酶 （3-Phosphoglycerate kinase，PGK）试剂盒说明书 紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义: 3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化1，3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸，产生1分子ATP，具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。 测定原理: 3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸，340nm处的吸光度变化反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。 自备实验用品及仪器: 天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿。 试剂组成和配制: 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加5mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加2.5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂四：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加2.5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂五：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加10 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 酶液提取： ①总PGK酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，500g离心5min，取上清测定。 ②胞浆和叶绿体PGK酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液），冰浴匀浆后于4℃，500g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆PGK酶活性，取沉淀加1mL提取液，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，500g离心5min，取上清测定叶绿体中PGK酶活性。 建议测定总PGK酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的PGK，则按照步骤②提取粗酶液。 测定操作： 1.分光光度计预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 第1页，共2页
慢病毒包装、纯化、滴度测定和感染
慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染 包装 1. 包装细胞 Lenti-X? Lentiviral Expression SystemsUser Manual.pdf (P11) ; Lenti-X? shRNA Expression Systems User Manual.pdP16) 2. 病毒载体及包装质粒 病毒载体：DNA组构建及中量提取； 包装质粒：商品化产品(Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf ( P12 ) ; Lenti-X? shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17))或DNA中量提取(目前唯一使用来源)； 3. 细胞转染 方法一： Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf( P12); Lenti-X? shRNA Expression Systems User Manual.pdfP17)； 方法二： 按照Lipofectami ne? LTX & Plus Reage nt (Cat.No.15338,i nvitroge n)进行，简要中文说明如下： a. 转染前24小时，把4七x 106个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为80-90%; b. 293T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基； c. 用之前充分混匀PLUS Reagen，在EP管中加入15ug的DNA 混合物(pLVX- shRNA Plasmid DNA : pMDLg : pRes-Rev: pCMV-VSV-G 的摩尔比为1：1：1：1)，15ul 的PLUS Reagen，用Opti-MEM 定容到500ul,标记为Tube 1,温和混匀，室温孵育5分钟； d. 充分混匀Mix Lipofectamine LTX，在EP管中加入45ul 的Mix Lipofectamine LTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube 2,温和混匀; e.将Tube 1的溶液加到Tube 2中，温和混匀，室温孵育5分钟; Tube 1 (Plasmid DNA) Tube 2 (LTX)
脂质体转染原理步骤
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。 学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法—脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。 上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。 外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。 本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。 293T细胞 MyoD表达质粒和EGFP表达质粒 DMEM培养基 链霉素/青霉素（双抗）
PBS（磷酸盐缓冲溶液） 酒精灯 废液缸 血球计数板 涡旋振荡器 35mm培养皿 转染管 细胞传代 (2) 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 (5) 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 细胞转染 1）转染试剂的准备 2）选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂， 再次震荡。 7）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 第二次细胞传代 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度