肾综合征出血热、汉坦病毒肺综合征和汉坦病毒研究进展

肾综合征出血热、汉坦病毒肺综合征和汉坦病毒研究进展

第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心

白雪帆王平忠王伟李彧

第八届国际肾综合征出血热、汉坦病毒肺综合征和汉坦病毒（HFRS、HPS and Hanta- viruses）学术会议于2010年月5月20日～22日在希腊雅典举行。与会专家学者就HFRS/HPS 的流行病学、诊断、发病机制和免疫应答、治疗以及汉坦病毒的生态学、病毒与宿主的相互作用、病毒的种系发生、复制和形态发生、疫苗研制等方面进行了学术交流。下面分别予以简介。

一、流行病学

HFRS虽然主要流行于亚欧大陆，但是在非洲和美洲的部分国家也时有报告。我国自2005年以来，报告病例数逐年减少，近年年发病数已降至1万左右。韩国自2001年至2010年5月累计报告4861例HFRS，每年报告HFRS 300例～500例。而日本自1984年后再未发现人间病例。俄罗斯1978年～1995年间平均年发病3145例，但是自2000年～2009年10年间发病数明显增长，仅俄罗斯的83个行政区中的58个即累计报告HFRS病例74890例，平均年发病率达到5.2/10万人口。不同国家的主要流行病毒型别/毒株也有所不同，我国仍以汉滩型（Hantaan virus）和汉城型（Seoul virus）为主，近年还报告了沟型病毒和大别山型病毒；韩国除了上述两型病毒外，近年新发现了Muju virus和Soochong virus；而俄罗斯的远东地区则以卡巴罗夫斯克（Khabarovsk virus）、阿慕尔（Amur virus）、符拉迪沃斯托克（Vladivostok virus）病毒为主要流行株；印尼和新加坡的主要流行病毒则为2009年新发现的Serang virus（最早分离于印尼的Serang地区），泰国、柬埔寨和印度仍以泰国病毒（Thailand virus）为主。上述型别的病毒中，汉滩、阿慕尔和Soochong病毒为姬鼠型病毒，汉城病毒、泰国病毒、沟病毒和Serang病毒为家鼠型病毒，特别是Serang病毒与泰国病毒的结构上非常接近，而卡巴罗夫斯克、符拉迪沃斯托克、Muju以及流行于日本的各型病毒（如Hokkaido）均为平鼠型病毒。

美国夏威夷大学的Y anagihara R等通过长期的汉坦病毒动物宿主的调查和观测，发现多种鼩鼱科（Soricidae）动物如鼩鼱（shrew）和鼹科（Talpidae）动物鼹鼠（mole）可以携带汉坦病毒，包括携带索托帕拉亚病毒（Thottapalayam virus, TPMV）的臭鼩（Suncus）、携带Imjin和Jeju病毒的麝鼩（Crocidura）、携带千岛湖病毒的鼩鼱（Sorex）以及携带各型汉坦病毒的中国四川短尾鼩（Anourosorex squamipes）和北方短尾鼩（Blarina brevicauda）、欧亚普通鼩鼱（Sorex araneus）、中鼩鼱（Sorex caecutiens）、假面鼩鼱（Sorex cinereus）、暗黑鼩鼱（Sorex monticolus）、西伯利亚鼩鼱（Sorex roboratus）、亚洲白足鼩鼱（Crocidura shantungensis）、日本鼩鼹（Urotrichus talpoides）、美洲鼩鼹（Neurotrichus gibbsii）、欧洲普通鼹（Talpa europaea）、东方鼹（Scalopus aquaticus）、大麝鼩（Crocidura lasiura）等。不同型别病毒与上述动物宿主的关系有所不同，有些如Seewis病毒和Jemez Spring病毒有着较为广泛的动物宿主类型，前者同时被分布于不同国度和地区的暗黑鼩鼱、沼泽鼩鼱、特氏鼩鼱、漂泊鼩鼱等携带，后者同时被暗黑鼩鼱、特氏鼩鼱、漂泊鼩鼱等携带。源于上述宿主动物的汉坦病毒从结构上也可分为3类，一类与源于啮齿类动物的汉坦病毒同源性较强，另两类有较大差别。系统共进化分析表明，上述非啮齿类动物携带的汉坦病毒大多与其相应的宿主动物长期“和谐共处”，共同进化，仅在偶然的情况下发生宿主动物类型的转换。上述新的动物宿主的发现，不仅扩大了汉坦病毒属病毒的宿主范围，而且为这类新型宿主相关病毒的生物学特性及防控的研究提出了挑战。

近年研究发现，欧洲的汉坦病毒病的流行可能比亚洲更早，第一次世界大战期间英军在比利时北部的弗莱芒（Flanders）地区先后发生12000多例“战争肾炎”，这可能是汉坦病毒病大规模流行的最早报道。此外，二战期间前苏联远东地区的军队先后发生8000多例流行性肾病/肾炎，病死率达10%～20%；驻扎北欧斯堪的那维亚半岛北端Lapland地区的德军和芬兰军队也先后发生10000多例流行性肾病；囚禁在前南斯拉夫的德国战俘营中也报告先后有6000多例流行性肾病。新近研究表明，流行于欧洲大陆的汉坦病毒可以分为三类，对人类致病的病毒型别主要包括普马拉病毒（Pummala virus）、多布拉伐-贝尔格来德病毒（Dobrava-Belgrade virus）、Saaremaa virus和汉城病毒（SEOV）；对人类不致病的病毒主要为图拉病毒（Tula virus）；第3类病毒主要为新近在芬兰鼩鼱中发现的若干种病毒，如Seewis和Nova病毒。近年欧洲部分国家HFRS的流行日渐严重，如比例时2005年报告病例数372例，瑞典2007年全年报告发病数达2195例，芬兰2008年报告病例数达3259例且近10年已有4年年发病数超2000例，德国2007年报告发病数1678例。而俄罗斯自1995年以来每年发病数均在7000例～9000例。进入新世纪以来，HFRS已居俄罗斯所有人兽共患病毒性疾病（zoonotical virus infections）和自然疫源性疾病发病数的首位，约占上述疾病总数的33.5%，其它依次为莱姆病（32.6%）、蜱传脑炎（24.5%）、钩端螺旋体病（5.4%）、布鲁斯菌病（2.1%）。所有HFRS病例中的98.5%发生于俄罗斯的欧洲部分，10年间平均年发病率为6.5/10万人口，特别是该地区的东南数州为HFRS的高发区。既往在俄罗斯的欧洲部分主要流行病毒株为PUUV，但近年由黑线姬鼠作为传染源、由多布拉伐病毒引起的HFRS逐年增多，且97.4%的病例发生于农村地区，特别多发于俄罗斯南部的索契（Sochi）地区，发病高峰季节在11月～次年2月；与此相反，由平类动物作为传染源、由PUUV引起的HFRS 则主要（约69%）发生于城市/城镇地区，农村地区发病仅占31%，且发病高峰季节为每年的8月～12月。

自1993年在美国西南部的四个州暴发流行汉坦病毒肺综合征（HPS）以来，HPS的病例在南北美洲呈逐年增多趋势，其中2005年和2006年两年南北美洲报告病例数分别增至408和430例，而病死率则从1993年的70.3%降至近年的25%左右。迄今已有9个国家或地区报告人间HPS病例，包括北美洲的美国、加拿大，南美洲的巴西、阿根廷、智利、玻利维亚、巴拉圭、乌拉圭和法属圭亚那，哥伦比亚也已报告人类和啮齿类动物的感染，但未报告HPS 病例。另外一些国家如北美洲的墨西哥、洪都拉斯、哥斯达黎加和南美洲的秘鲁、委内瑞拉已发现啮齿类动物携带病毒。截止2010年2月16日，美国累计报告HPS病例541例，包括被证明于1993年以前发生的31例病例。上述病例分布于全美31个州，其中发病数最多的3个州为美国西南部的新墨西哥、科罗拉多和亚利桑那州，累计发病数分别为82、70和62例；≤16岁以下的儿童病例低于7%；总的病死率为35%。与美国和加拿大的HPS病例相比，南美洲的HPS在流行病学和临床发病方面有所不同，如已报告HPS的人-人传播、血清抗体在某些疫区的阳性率较高（自1%～7%不等）、儿童发病率较高、病死率较低（10%～40%不等）、轻症和非典型病例较多等。

非洲是否存在汉坦病毒及汉坦病毒病一直是令人关注的问题，本次会议上，Klempa B 代表德国和斯洛伐克的相关课题组报告了他们在非洲进行的流行病学调查，在用RT-PCR对西非几内亚捕获的18属的啮齿类和1个属的鼩鼱共计1129只动物的标本进行汉坦病毒基因扩增后，仅在2只动物获得了阳性结果，其中1个阳性扩增产物来自2004年1月捕获的毛鼠属（Hylomyscus）动物，另一个扩增产物来自鼩鼱科的麝鼩（Crocidura）。基因测序和同源性分析表明，前一株病毒Sangassou（因相关动物捕获于靠近Sangassou村的森林而得名）的基因序列与汉滩型、汉城型和多布拉伐型等鼠科相关病毒（Murinae associated virus）最为接近，而后一株病毒Tanganya（相关动物捕获于几内亚Tanganya村附近的草地）的基因序列介于鼠科相关病毒与棉鼠科相关病毒（Signodontinae associated virus）之间。应用分离获

得的Sangassou病毒、表达的病毒抗原及免疫血清建立的血清学方法（IgG-ELISA、IFA、WB和FRNT）对三个相关疫区的居民所做的血清流行病学调查表明，ELISA+IFA+WB/FRNT 3项检测同时阳性的百分率自1.1%～4.4%不等。

二、发病机制和免疫应答

汉坦病毒感染人体后以毛细血管和小血管的内皮细胞为主要靶细胞，在感染数周内引发以发热、出血、肾损和血管渗漏（vascular leakage）为主要临床表现的临床综合征。HFRS 和HPS的主要病理基础为血管内皮屏障功能的破坏、肾脏及肺脏等微小血管非常丰富的脏器的严重损伤、血小板失能等，然而迄今血管内皮损伤的具体机制仍未明确。近年研究业已表明，β3整合素是致病性汉坦病毒感染的主要受体，并且可能参与了血管屏障功能的维持。因此，β3整合素在汉坦病毒感染入胞及发病中的作用受到越来越多的关注。

（一）β3整合素概述

整合素是分布于多种动物细胞表面的一类粘附分子。同一种整合素可以表达在多种细胞表面，而同一种细胞也可以表达几种不同的整合素。依据β亚单位的不同可将整合素分为不同的亚群。β3整合素亚群只有两个成员：αvβ3和αⅡbβ3。这类粘附受体能够介导细胞-细胞、细胞-胞外基质之间的粘附，以及细胞与某些病原体之间的作用。对于维持组织的完整性、促进细胞的移动、调节基因表达以及细胞粘附、分化和存活均至关重要。αvβ3整合素广泛表达于人体的内皮细胞、巨噬细胞、血小板、巨核细胞、单核细胞及某些活化的白细胞、平滑肌细胞、破骨细胞表面；在新生血管内皮细胞中高表达，在静息的内皮细胞表面表达水平相对较低。αⅡbβ3整合素主要表达于血小板及巨核细胞表面，在单核细胞、粒细胞、肥大细胞表面也有表达，在血小板聚集及血栓形成中有重要作用。在静息细胞中该受体受到抑制，但是在受到凝血酶和或血小板激活剂等的刺激以后活化，能介导纤维蛋白原与其配体结合。

2.β3整合素的构象变化和亲和力调控

β3整合素是由跨膜糖蛋白α和β亚单位组成的异源二聚体。α和β亚单位分别由胞外结构域、单一的跨膜结构域和短小的胞内结构域组成(图1a)。整合素晶状体结构的胞外域非常复杂，静息状态下呈致密的V型构象，由一个“头”部和两条弯曲的“腿”组成(图1b) 。α亚单位中的β片层结构域和位于β亚单位中的I 结构域并排分布，组成了能与含有RGD

序列的配体结合的“头部”结构域。β3整合素的两条“腿”,一条由α亚单位中的“Thigh”、“Calfl”和“Calf2”3 个结构域组成，另一条由β亚单位中的“Hybrid”、plexin/ semaphorin/integrin (PSI)、4 个“EGF-like”和1 个“β3-尾部”结构域组成。α亚单位的“thigh”和“calf-1”结构域与β3亚单位的“PSI”和“EGF 1 、2”结构域组成了灵活的“膝关节”结构。当整合素与配体结合或活化后，“膝关节”的运动使得整合素由弯曲的低亲和力状态而转变为伸展的高亲和力状态。新近研究证实PSI 结构域与其特异性抗体N29或8E3结合能够诱使hybrid和PSI/IEGF1结构域产生远离α亚单位中“膝关节”结构域的运动，而诱发整合素构象和结构域的改变。

图1 β3整合素结构及构象和亲和力变化(a) 一级结构中β3整合素的功能域组成；

(b)β3整合素的构象变化及亲和力变化。

3.β3整合素的配体

既往研究证实β3通过RGD (Arg-Gly-Asp-Arg)或是RGD样(Arg-Gly-Asp-Leu)的寡肽识别序列与胞外基质相结合。αⅡbβ3最重要的结合基序是RGD样的KGD 和KQAGDV。其配体主要有胶原、变性的胶原、血小板反应素、玻连蛋白、纤连蛋白、血管假性血友病因子、纤溶酶原、凝血素、血小板反应素等。αvβ3的配体主要有玻连蛋白(VN)、纤连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)、骨桥蛋白(OPN)、血小板反应素(TSP)等。αvβ3与VN 结合对维持毛细血管完整性起重要作用，并介导血小板粘附到固相化的VN。除了能特异性地结合含有RGD 序列的配体，作为以β3整合素为受体的致病性汉坦病毒、登革热病毒和猪出血热病毒等病原体本身并不含有RGD结构，其与β3整合素的连接通过与PSI结构域相互作用而实现。

4.β3整合素活性调节的信号通路

整合素的胞浆结构域短小且缺乏酶活性，需与其它的分子组成分子复合物参与信号传递。与其它分子的作用通常是短暂的，这增加了研究的复杂性。整合素传递跨膜双向信号，即是outside-in和inside-out信号。在outside-in信号传递通路中配体与整合素胞外域相结合，致使整合素的构象发生改变，并传导信号进入细胞内部。Inside-out信号传递通路中起源于细胞表面非整合素受体介导的或是细胞内部的分子活化的信号通路，最终导致了整合素的活化或失活。整合素活性的调节是通过构象的改变或聚集的程度实现的。这两种信号通路并不是截然分开的，而是同时发生并且互相影响。

整合素的相关信号通路在血小板与可溶性配体的粘附、淋巴细胞与抗原提呈细胞的粘附、巨噬细胞和颗粒细胞对细菌的吞噬中也发挥重要作用。

观察发现很多生长因子介导的信号传导通路都能被整合素所活化，整合素的参与对于生长因子介导的生理反应是必不可少的。提示对细胞功能的调控中，二者之间可能存在相互协调的机制。在内皮细胞，αvβ3通常与受体型络氨酸激酶VEGFR2（血管内皮生长因子受体2）相互关联。VEGF（血管内皮生长因子）可以诱导αvβ3的表达。同时，αvβ3可以增强VEGFR2的磷酸化水平和对VEGF的敏感性以易于下游分子信号FAK和MAPK/P38的活化。所以分析二者在信号传导途径中的串联作用可能有助于理解胞外刺激所引起的生理反应。

（二）β3整合素在汉坦病毒感染中的作用

1.β3整合素是致病性汉坦病毒的受体

致病性和非致病性的汉坦病毒都能够感染人类的内皮细胞，这提示单纯的病毒侵入过程不足以引起病理损伤。与非致病性汉坦病毒以整合素α5β1作为受体不同，致病性的汉坦病

毒（(HTNV, PUUV, SEOV, SNV, ANDV and NY-1V)都是以αvβ3为受体侵入内皮细胞的。

此外，致病性汉坦病毒对β3在调节内皮细胞屏障功能和活化血小板功能方面的影响与HPS、HFRS的基本病理改变也颇为相同。考虑到诸多型别和亚型汉坦病毒的差异、被感染宿主的种属差异以及世界各地发病地域的不同，β3亚群整合素作为汉坦病毒的受体与其功能之间是否存在必然联系确实值得关注。

致病性和非致病性汉坦病毒利用的整合素受体不同是通过以下实验得以证实的：αvβ3的高亲和性配体玻连蛋白可以抑制致病性汉坦病毒HTNV和NY-1对体外培养的人内皮细胞等细胞的感染，但是对非致病的汉坦病毒PHV感染没有抑制作用。αvβ3的抗体同样可以抑制致病性汉坦病毒对人内皮细胞以及VeroE6细胞的感染，但是对PHV或是TULV的感染没有抑制作用。不含有β3的CHO细胞在转染了表达人类β3整合素（αvβ3或是αIIbβ3）以后，能够感染致病性汉坦病毒。β3亚基N端43个残基组成的PSI结构域被证实是致病性汉坦病毒作用于β3的部位，抗PSI结构域的抗体可以阻断汉坦病毒的感染。PSI 结构域只有在β3整合素处于弯曲状态下才能够暴露出来。汉坦病毒与处于弯曲状态下非活性的αvβ3相结合正好解释了为什么在能活化αvβ3的高Mn2+环境中，汉坦病毒的感染没有增强，反而受到抑制。电子显微镜研究显示汉坦病毒感染数天以后，病毒在细胞表面所形成的覆盖层。汉坦病毒覆盖在弯曲的αvβ3的表面而阻断了αvβ3的活性，抑制了其调节内皮细胞通透性的功能。

2.致病性汉坦病毒影响内皮细胞的迁移能力

致病性汉坦病毒NY-1, SNV, HTN, SEO 和PUU能够阻断由β3整合素与配体结合所介

导的内皮细胞迁移，而用抗β3抗体也可阻断β3整合素与玻连蛋白的结合而导致内皮细胞的迁移能力下降，两者的作用极其相似，但对β1所介导的迁移能力均无影响，表明只有以β3为受体的致病性汉坦病毒的感染才能抑制内皮细胞的迁移，而细胞的迁移是β3与胞外基质连接后导致粘着斑复合物活化和细胞骨架运动的结果。致病性病毒感染后对β3迁移能力下降的原因存在两种可能：①感染后αvβ3处于抑制状态，不能与胞外基质发生高亲和力结合；②致病性病毒与αvβ3 PSI结构域结合后使得αvβ3伸展并处于与胞外基质的高亲和力状态，然而由于病毒的感染使αvβ3的功能受到影响，细胞骨架结构破坏和粘着斑复合物的形成受到抑制，进而抑制了细胞的迁移能力。

3.致病性汉坦病毒增强内皮细胞对于VEGF介导的通透性的反应性

VEGF最早被称为血管通透因子，其介导液体穿过血管屏障的效应要比组织胺强5000倍，能有效的介导局部组织水肿。β3整合素的胞内域与VEGF的受体VEGFR2形成功能复合体，αvβ3通常是通过调节VEGFR2的作用而影响内皮细胞的通透性。β3整合素敲除鼠和细胞受到VEGF刺激后表现出很高的通透性，表明β3整合素在调节血管对VEGF的反应中发挥作用。与β3敲除的情况相似，致病性汉坦病毒在感染后数天可以提高内皮细胞对VEGF 的敏感性，使其通透性增高18～23倍。这与β3整合素功能的失活以及汉坦病毒在细胞表面形成覆盖层相关。上述研究表明致病性汉坦病毒与非活化状态的β3整合素的相互作用破坏了VEGFR2-β3整合素的功能复合体，并导致内皮细胞出现类似于β3整合素被敲除后的变化，这一重要发现为致病性汉坦病毒感染通过改变内皮细胞的功能而增加内皮细胞的通透性提供给了一种合理的解释。

VEGF介导的内皮细胞通透性的改变受到内源性和外源性细胞因子的影响。例如血管生成素（angiopoietin-1，Ang1) 和神经鞘胺醇（sphingosine- 1-phosphate，S1P) 都可以调节细胞对于VEGF的反应性。S1P通过与内皮细胞上Ang1受体结合而抑制内皮细胞的渗透性。S1P 能够增强血管内皮细胞粘附连接中钙黏蛋白(VE-cadherin)的稳定性而增强内皮细胞的屏障

作用。粘附连接是维持内皮细胞屏障功能的主要因素，由内皮细胞特殊的蛋白和血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）组成。VEGFR2活化能诱导VE-cadherin的磷酸化，通过解离作用和细胞对VE-cadherin的内吞作用而破坏粘附连接结构的完整性，使内皮的通透性升高。新近的

研究显示HTNV和ANDV感染可以明显促进内皮细胞对VEGF诱导的VE-cadherin的内吞作用（升高达2～7倍），而增加Ang1或是S1P几乎可以完全阻断上述效应。相反，非致病性的TULV 感染内皮细胞后无论在有否VEGF刺激的作用下VE-cadherin的内吞作用都不发生改变。这些研究结果显示致病性汉坦病毒可以提高内皮细胞对VEGF的敏感性而促进VE-cadherin的内

吞作用而破坏了粘附连接的完整性，以此来调节内皮细胞的通透性（图2）。

图2 汉坦病毒与弯曲的β3整合素结合，抑制了β3整合素对VEGF的调节功能。

导致VE-cadherin降解，粘附连接结构破坏，内皮通透性升高。

4.汉坦病毒与血小板的相互作用

血小板数量减少和功能缺陷是HPS和HFRS最常见的病理表现之一。αIIbβ3整合素是血小板上分布最丰富的受体（80,000拷贝/血小板）。与αvβ3类似，αIIbβ3整合素通过其β3亚单位与病毒相互作用介导汉坦病毒的感染。致病性汉坦病毒对于β3整合素功能的调节不仅影响血管内皮细胞的功能，也可以影响血小板的功能，导致血小板的减少和血管通透性增高。静止的血小板能够粘附于感染的内皮细胞，用抗β3整合素的中和抗体或其Fab片段阻断汉坦病毒对内皮细胞的感染可以阻止这种粘附作用，表明血小板的粘附有赖于内皮细胞表面汉坦病毒的存在，并且可能与汉坦病毒感染后病毒在细胞表面所形成的覆盖层相关。静止期的血小板通过其表面的β3整合素与内皮细胞表面覆盖的病毒相连，在内皮细胞表面形成了覆盖层并且改变了与内皮细胞粘附的性质。在HPS患者肺部的毛细血管，血小板覆盖在内皮细胞上可能影响氧气交换，加重缺氧和低氧诱导因子(hypoxiainduciblefactor-1α,HIF-1α)诱导的VEGF的生成导致肺部的渗出和水肿。以上表明，HPS患者严重的缺氧和血浆渗出可能均与汉坦病毒感染导致的β3类整合素的功能失衡有关，血小板的损伤不仅影响患者的凝血功能，而且与血管内皮通透性的增强密切相关。

三、实验诊断

汉坦病毒不仅感染人，而且被许多啮齿类动物(rodents)特别是食虫动物（insec- tivores）长期携带，因此发展人类和动物感染后血清学和病毒标志物的检测同样重要。目前在大多数国家，人类的汉坦病毒感染特别是两类显性感染——HFRS和HPS，主要采用IgM 抗体捕获法ELISA进行诊断，也有采用免疫印渍（immunoblotting）或采用RT-PCR检测病毒RNA进行诊断的，后者检测阳性后还可以进一步施行基因序列测定或病毒分离。对于疫区现场特别是动物宿主的研究，可以将浸透血标本的纸条干燥保存，以备以后对浸出液进行检测。免疫胶体金/免疫层析测定（immunochromatographic assay）近年也已用于被感染者血清抗HV-IgM和IgG抗体或啮齿类动物IgG抗体的检测，其优点是可以在5分钟内获得检测结果。针对汉坦病毒核衣壳蛋白（nucleocapsid protein）的免疫印渍检测以及针对病毒囊膜糖蛋白的中和抗体检测也已研发，但临床少有应用。血清学研究表明，针对小鼠或大鼠相关的汉坦病毒抗体可以发生交叉反应，而针对平鼠（bank vole）和棉鼠（sigmodon）相关的汉坦病

毒抗体也可以发生交叉反应，但针对两类病毒的抗体间却少有交叉反应。因此，欲对两类病毒引起的HFRS和HPS或感染进行筛检诊断，则必须建立或购买两类诊断试剂盒。不同型别病毒感染的分型检测则主要依赖中和抗体的检测和病毒RNA序列的测定。

本次会议上日本札幌市北海道大学的Arikawa J报告了他们研制的基于截短的病毒核衣

壳蛋白（NP）和ELISA技术的血清分型检测方法。他们研究发现，汉坦病毒NP氨基端片段aa50- 100不仅是一个优势的抗原反应性表位，而且是一个能够与已知的各种旧世界（old world,即欧亚大陆）流行的血清型病毒如汉滩（HTNV）、汉城（SEOV）、多布拉伐（DOBV）、泰国（THAIV）及普马拉(PUUV)发生交叉反应的抗原表位。而NP的片段aa230-302是一个变异性的血清型特异性表位（serotyping specific epitope），可用于不同血清型病毒的分型检测。进一步用针对旧世界各血清型病毒NP aa1-100的单克隆抗体研究证明能够与新世界（即美洲大陆）各国主要流行型别病毒如新诺柏（SNV）、安弟斯（ANDV）、黑港渠（BCCV）、CARV（流行于墨西哥、由棕禾鼠携带的汉坦病毒，目前与人类疾病的关系尚不清楚）和LANV（流行于南美洲中部、由草原暮鼠携带的汉坦病毒，可以引起一种轻型的HPS）病毒发生抗原抗体反应，证明这些新发现的病毒具有与欧亚大陆流行的各型别汉坦病毒共同的抗原表位。根据已在美洲大陆各国分离到的汉坦病毒或通过基因扩增获得的病毒基因序列的地理分布及基因和氨基酸结构的系统进化分析（phylogenetic analysis），可将这些病毒分为5个组，其中2～4组还可细分为3～5个不同的亚型。初步的研究表明，针对SNV、ANDV、LANV和CARV的病人血清或啮齿类动物免疫血清均可与上述病毒的全NP发生血清学反应，但是对截短表达的氨基端蛋白片段（trN 100）的反应强度差别较大，作者认为，上述病毒的trN 100有可能用于新世界各型病毒的分型检测。

同样来自日本北海道大学的Yoshimatsu K等报告了他们研制检测各群汉坦病毒的PCR 共同引物的结果。作者根据已报道的源于欧亚和美洲的汉坦病毒的结构特征和地理分布，提出将已发现的各血清/基因型病毒分为至少3个群，其中第1群为鼠亚科相关汉坦病毒（murinae associated hantavirus），包括HTNV、SEOV、DOBV、THAIV、SNGV（Sangassou virus）等，第2群为平相关汉坦病毒（arvicolinae associated hantavirus），包括PUUV、TULV(图拉病毒)、PHV（prospect hill virus, 希望山病毒）、ISLAV（isla vista virus, 埃斯拉病毒）、KHAV（khabarovsk virus,卡巴罗夫斯克病毒）等，第3群为林鼠/棉鼠相关汉坦病毒（neotominae and sigmodontinae associated hantavirus），主要包括源于美洲各国的病毒，如SNV、ANDV、BAYV(bayou virus)、CADV(Cano Delgadito virus)等。将编码上述病毒核衣壳蛋白的S基因序列进行比对分析，找出同源性较高的区段，分别设计合成了针对各群病毒的多对候选引物，其中第1群有3对候选引物，第2、3群合成了各4对候选引物。同时，分离上述3群共计15株病毒的S基因并构建重组质粒作为检测的模板，然后常规进行PCR扩增，结果发现其中部分引物可以分别扩增出组内所有病毒的目的基因片段，检测灵敏度可达103拷贝数。上述结果证明初步的检测实验是成功的，可望用于研究现场汉坦病毒动物标本和临床感染病人标本的检测。

四、疫苗研制和应用

HFRS的主要防控措施为接种汉坦病毒疫苗。国内上世纪90年代研制生产的疫苗主要有沙鼠肾细胞（MGKC）制备的单价汉滩型病毒灭活疫苗、金地鼠肾细胞（GHKC）制备的单价汉城型病毒灭活疫苗、乳鼠脑制备的单价汉滩型病毒灭活疫苗和GHKC或MGKC制备的双价汉滩和汉城型病毒灭活疫苗。近年新研制了由GHKC、MGKC和Vero-E6细胞制备的纯化精制双价（汉滩和汉城型病毒）疫苗，新型疫苗不仅接种后局部副反应轻微，而且仅需2针接种即可取得良好的免疫防护效果。今后仍需进一步改进疫苗的精制纯化工艺，努力提高疫苗接种后中和抗体的应答水平和保护效力，降低副反应发生率。针对已发现的新的流行病毒型别（如PUUV），应着手研制新的多价疫苗，并深入研究疫苗免疫机制、建立新的疫苗效力检测方法

和评价标准，同时继续开发新的疫苗品种如基因工程疫苗等。

除了新型疫苗的研发外，国家自2000年以来还通过包括转移支付在内的财政拨款，在国内重点流行省区（黑龙江、陕西、辽宁、山东、河北、浙江等）启动了扩大的疫苗接种计划，已在包括上述省区接种人群约1700万，明显降低了本病的发病率。

目前除中国外，已初步研制成功汉坦病毒灭活疫苗的国家还有朝鲜、韩国、俄罗斯及欧洲部分国家，但除了中国、朝鲜和韩国外，均未开始临床应用。

本次会议上，美国陆军传染病研究所的Boudreau E报告了他们研制的汉滩病毒和普马拉病毒 M基因DNA疫苗的I期临床试验结果,该试验的目的在于验证疫苗的安全性和免疫效力。免疫途径采用PMED（particle mediated epidermal delivery）装置，即基因枪皮内注射DNA疫苗包被的直径约10纳米的金颗粒。在临床I期试验前对77只金地鼠的免疫试验证明，间隔3周3次免疫后，约94%的动物产生了特异性抗体，抗体滴度自1：20～10240不等；而采用间隔1周3次免疫方案，100%和80%的受试动物分别产生了抗HTNV和PUUV的抗体。在进一步对灵长类动物的免疫试验中，100%的受试动物产生了针对HTNV和PUUV的中和抗体。其后开展的I期临床试验分为3组，每组9例（第1组最初为10例，后因故中途脱落），分别单独接种HTNV、PUUV DNA疫苗和联合接种两种疫苗，接种方案均为3次，每次间隔4周。主要副作用包括接种后3天内出现疲劳/倦怠（约占所有受试者的34%）、头痛（21%）、肌痛/关节痛（16%），其它如咽疼、鼻阻、胃肠不适、低热/微汗、头晕和失眠等的发生率均≤10%。免疫效力观测表明，HTNV、PUUV和联合疫苗免疫组在接种后不同时间点中和抗体的阳性（指抗体滴度≥1：20）数分别为56天时为2/10、1/9、1/9，84天时测定为3/10、4/9、4/9，180天时测定为0/9、2/9、5/9。以上试验结果表明，受试者对DNA疫苗的接种均能较好地耐受，未发生严重的副反应/不良事件；所研制的汉滩和普马拉病毒M基因DNA疫苗对人体具有免疫原性；免疫后血清抗体的总体阳转率偏低（＜50%），抗体阳转率最高组出现在联合疫苗免疫组（＞50%）；抗体阳转者中大多数中和抗体（PRNT50）滴度≥1：1000，且大多出现于免疫后6个月。

参考文献（略）