手把手教你做PCR引物设计

PCR引物设计的黄金法则

1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

6. 碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过

高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）

9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。

10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）

可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11. 引物应具有特异性。

引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

POST by Bingsen Xu

前言：我是刚刚注册到丁香园，在PCR技术讨论版看见置顶贴，“请求助引物设计的战友先进来这里！”稍微浏览了一下，发现很多朋友对PCR引物设计还不是很熟悉，我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完之后，可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。

开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的讨论范围。另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：

第一步：找到Primer3的站点。你不用记住这个站点，但是要记住

“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0

(primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是

https://www.360docs.net/doc/c2856949.html,/。

第二步：贴上模板序列。进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。（附件Word文档里有图）在“Paste source sequ ence below (5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'->3'方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。

第三步：重要参数设定。首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500，具体看情况调整。第二个参数是“Primer Size”，默认值一般可以用，但是，当你用熟了这个软件，你自己就知道该怎么改了。第三个参数

是”Primer Tm”这个和Primer Size差不多。

第四步：Pick primers：点一下这个按钮，符合你大小预期的primer 就出来了，看看Primer3 Output的界面，多么漂亮！你要的primer 出来了，而且有primer在序列上的位置比对图，还有primer本身的信息，包括位置，长度，Tm，GC含量，任何位置互补碱基数，3'端互补碱基数，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'），还有产物大小，两引物间任意互补碱基数，两引物间3'端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内，但还不是最佳，将会给出警告。

比如（随便举例，本人在做一个超长引物）：

WARNING: Left primer is unacceptable: High 3' stability OLIGO start len tm gc% any 3' seq

LEFT PRIMER 1 33 69.02 45.45 6.00 1.00 TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCC

RIGHT PRIMER 1388 34 67.86 29.41 6.00 2.00 AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACAT

SEQUENCE SIZE: 1388

INCLUDED REGION SIZE: 1388

PRODUCT SIZE: 1388, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 3.00 第五步：引物设计检验：可以仅仅设计一向引物，只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的书写反向仍然是5'->3'）如果符合设定的条件，软件将对给出引物评分，同时给出警告信息，根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可，警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物，最好都要检查一下，这样就可以避免被别人有意无意误导。至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA对RT-PCR 的干扰。实际做引物的时候，要把内含子都去掉，仅仅把外显子序列放入源序列框中，并且通过自定义引物设计的方法，使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR，我将抽空另做说明。

至于设计出来的引物的实际效果，根据我的经验，一般情况下都能做到PCR一次成功，也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果，但是不管怎么说，软件做引物可以让自己心中有数。最后，GOOD LUCK TO EVERYONE.

手把手教你在线做PCR引物设计

POST by Bingsen Xu

前言：我是刚刚注册到丁香园，在PCR技术讨论版看见置顶贴，“请求助引物设计的战友先进来这里！”稍微浏览了一下，发现很多朋友对PCR引物设计还不是很熟悉，我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完之后，可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。

开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的讨论范围。另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0

(primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是

https://www.360docs.net/doc/c2856949.html,/。

第二步：贴上模板序列。进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。（附件Word文档里有图）在“Paste source sequence below (5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'->3'方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。

第三步：重要参数设定。首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500，具体看情况调整。第二个参数是“Primer Size”，默认值一般可以用，但是，当你用熟了这个软件，你自己就知道该怎么改了。第三个参数

是”Primer Tm”这个和Primer Size差不多。

第四步：Pick primers：点一下这个按钮，符合你大小预期的primer就出来了，看看Primer3 Output的界面，多么漂亮！你要的primer出来了，而且有primer在序列上的位置比对图，还要primer 本身的信息，包括位置，长度，Tm，GC含量，任何位置互补碱基数，3'端互补碱基数，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'），还要产物大小，两引物间任意互补碱基数，两引物间3'端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内，但还不是最佳，将会给出警告。比如（随便举例，本人在做一个超长引物）：

WARNING: Left primer is unacceptable: High 3' stability OLIGO start len tm gc% any 3'seq

LEFT PRIMER 1 33 69.02 45.45 6.00 1.00 TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCC

RIGHT PRIMER 1388 34 67.86 29.41 6.00 2.00 AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACAT

SEQUENCE SIZE: 1388

INCLUDED REGION SIZE: 1388

PRODUCT SIZE: 1388, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 3.00 第五步：引物设计检验：可以仅仅设计一向引物，只要在

Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的书写反向仍然是5'->3'）如果符合设定的条件，软件将对给出引物评分，同时给出警告信息，根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可，警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物，最好都要检查一下，这样就可以避免被别人有意无意误导。至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。实际做引物的时候，要把内含子都去掉，仅仅把外显子序列放入源序列框中，并且通过自定义引物设计的方法，使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR，我将抽空另做说明。

至于设计出来的引物的实际效果，根据我的经验，一般情况下都能做到PCR一次成功，也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果，但是不管怎么说，软件做引物可以让自己心中有数。最后，GOOD

LUCK TO EVERYONE.