黑曲霉产柠檬酸
柠檬酸发酵工艺条件的优化
摘要
柠檬酸（2-羟基丙烷三羧酸），是重要的工业原料。可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进行了相关比较。结果表明：1）摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为0.4%；实罐发酵最适硫酸铵浓度为0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2）实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度更稳定，两者的菌浓度、残糖、PH值变化规律高度一致，酸度变化规律基本一致。另外实验还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进行了探讨，结果表明实罐发酵的最适温度约为35℃，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。
1. 课题背景
1.1柠檬酸简介
柠檬酸（citric acid）是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸、2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸.
分子式：C6H8O7 （相对分子质量：192.13）物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，
稍有涩味。极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质。加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。
1.2柠檬酸用途
柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。
1.3柠檬酸循环
又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle），克雷布斯循环(Krebs cycle)。体内物质糖、脂
肪或氨基酸有氧氧化的主要过程。通过生成的乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成三羧酸（柠檬酸）开始，再通过一系列氧化步骤产生CO2、NADH及FADH2，最后仍生成草酰乙酸，进行再循环，从而为细胞提供了降解乙酰基而提供产生能量的基础。由克雷布斯（Krebs）于20世纪30年代最先提出。
1.4实验发酵机理
1）以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌（我们采用黑曲霉M288）糖化后产生高浓度的葡萄糖。
2）、黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸：葡萄糖以EMP（糖酵解途径或者）、HMP（磷酸戊糖循环）两种途径产生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧形成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应后生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA缩合产生柠檬酸。
3）生理调节：柠檬酸是黑曲霉的良好碳源，故柠檬酸的积累是菌体代谢失调的结果。1）Mn2+抑制蛋白质合成造成NH4+的浓度增大，从而解除对PFK的抑制，使EMP通畅；2）柠檬酸脱氢酶在柠檬酸浓度高的情况下活性降低，进一步促进柠檬酸的积累。
1.5发酵方法
发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵 3种方法。固态发酵是以薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品为原料，配好培养基后，在常压下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲，装入曲盘，在一定温度和湿度条件下发酵。采用固态发酵生产柠檬酸，设备简单，操作容易。液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。现多采用通用发酵罐。它的主要部件包括罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。发酵罐径高比例一般是1:2.5，应能承受一定的压力,并有良好的密封性。除通用式发酵罐外，还可
采用带升式发酵罐、塔式发酵罐和喷射自吸式发酵罐等。
为了得到产柠檬酸的优良菌种，通常是从不同地区采集的土壤或从腐烂的水果中分离筛选，然后通过物理和化学方法进行菌种选育。例如薯干粉深层发酵柠檬酸的菌种就是通过柠檬酸不断变异和选育得到的。菌种适合在高浓度下发酵，产酸水平较高。
1.6黑曲霉菌柠檬酸发酵的影响因素
柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风量及pH值等条件。一般认为，黑曲霉适合在28～30℃时产酸。温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60％饱和度对产酸有利。柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。
尽管经过几十年的研究，关于柠檬酸发酵机制仍然有很多不够了解的地方，柠檬酸的合成积累涉及到一系列的酶，它们是相互关联的，
影响制约柠檬酸发酵的因子也是多种多样的，发酵液中金属离子的含量对柠檬酸的合成有非常重要的作用，过量的金属离子引起产酸率的降低，铁离子能刺激乌头酸水合酶的活性，从而影响柠檬酸的积累。柠檬酸发酵用的糖蜜原料，因含有大量金属离子，必须应用离子交换法或添加亚铁氰化钾脱铁方能使用。然而微量的锌、铜离子又可以促进产酸。相对来说，发酵培养基中的金属离子以及小分子量的有机物是比较容易控制的因子。但是每种因子的影响不是绝对的，如金属离子Fe2+ 、Mn2+ 等，他们并不是可以无条件降低其浓度，同时它们也是微生物其它正常代谢途径中必须因子，我们只能寻找一个最合适于柠檬酸发酵的浓度。资料表明：高浓度Mn2+将刺激乙酰辅酶A，造成草酰乙酸浓度下降，不利于合成柠檬酸。铜离子能抑制柠檬酸裂解酶活力[6]，培养基中加Cu2+ ，有利于达到最高柠檬酸产量。柠檬酸在顺乌头酸酶的催化下转化为顺乌头酸，进而转化为异柠檬酸，Fe2+是乌头酸水合酶专一激活剂，但柠檬酸发酵开始时，需要少量铁存在以促进菌体生长和为柠檬酸合成作准备，随后要控制Fe2+ 的存在才能开始并大量积累柠檬酸。Johnson等在研究黑曲霉的CO2 固定作用时发现有两个CO2 固定系统，这两个系统需要Mg2+、K + 。也有说几种常见的金属离子对柠檬酸合成酶的抑制作用，且Ca2+> Mg2+ >Na+ >K+ ，当然还与离子强度有关。
AMP、无机磷和NH4+对磷酸果糖激酶(PFK)有活化作用，NH4+还能有效的解除柠檬酸和ATP对其抑制，NH4+的浓度和柠檬酸生产速度有密切关系。发酵过程中加入甲醇能明显提高柠檬酸产量。其可
能的机理为：甲醇抑制a一酮戊二酸脱氢酶活力，提高丙酮酸羧化酶的活力，增加柠檬酸穿过细胞膜能力，降低胞内柠檬酸浓度，促进柠檬酸的合成，甲醇还能抑制柠檬酸裂解酶的活力。同时发现，甲醇对细胞有一定毒性影响。据报道，某些氨基酸，B族维生素和生物素也能提高柠檬酸产量，另有多种化合物，如NaF、乙二胺四乙酸钠等，也能增加柠檬酸积累，还有植酸、植酸钠、物理因素能提高柠檬酸产量。
3. 工作内容
3.1 实验菌株 ;黑曲霉柠檬酸生产菌株M228。
3.2 主要仪器
电子天平、生化培养箱、10L机械搅拌式发酵罐、配套设备（空压机、过滤器、蒸汽发生器等）、立式灭菌锅、恒温水浴锅、血球计数板和显微镜、台式高速离心机、碱式滴定装置、离心机、电磁炉。
3.3 种子培养
茄形瓶斜面培养扩大制备孢子。马铃薯培养基，35℃恒温培养箱培养3~4天。标准糖液中加入0.5%的硫酸铵，八层纱布封口，121℃灭菌20min，用无菌移液管吸取25mL无菌水至茄形瓶斜面内，并用酒精灯烧过的接种环轻轻刮下孢子，摇匀后倒入已冷却好的100mL 的种子培养基内，包扎好后摇床35℃、200r/min培养20h[17]。
3.4 培养条件
3.4.1糖化清液
细度为40目以上玉米粉15g与100mL去离子水混合调成浆乳，
调节pH为5.5-6.0，加热并搅拌升温至（65±1）℃，按20U/g原料加入α-淀粉酶及1g/LCaCl2，搅拌均匀，恒温保持60min，液化15min 后用0.1%碘液检测不显蓝色或极微淡蓝色，即糖化完全。四层纱布过滤于250ml三角瓶即得糖化清液。
3.4.2 摇瓶发酵培养
标准糖液100ml，加入硫酸铵后于121℃灭菌20min，冷却至室温，接种。摇床35℃、200r/min培养。
3.4.3 实罐发酵培养
玉米粉900g,加入6L去离子水调成浆乳，调节pH为5.5-6.0，加入发酵罐，按20U/g原料加入α-淀粉酶及1g/LCaCl2，搅拌均匀，恒温保持30-60min，液化20min后用0.1%碘液检测不显蓝色或极微淡蓝色为止。再加入0.5%的硫酸铵。蒸汽实罐灭菌后，火焰法接种，200r/min,35℃下通空气发酵，罐压控制在表压0.1MPa。通风量控制0-18h:200-400L/h，18h以后：600-800L/h。接种后半小时测总糖一次（取发酵液5mL），并记录PH和通风量。以后每4小时记录PH和通风量，每八小时测残糖和酸度一次（取发酵液10mL，离心取上清），最后一个班次每2小时测1次。
3.5 分析方法
3.5.1 残糖测定
菲林热滴定定糖法（空白滴定+样品溶液预滴定+样品溶液正式滴定）。 3.5.2总糖测定
取5ml发酵液，加50ml水和7.5ml浓硫酸，加热至沸，保持5min，
急速冷却。冷后用40% NaOH溶液中和至PH7-8，定容至500ml，取样后以残糖测定方法进行测量。
3.5.3 酸度测定[20]
取5ml发酵液，离心取上清液，精确吸取4ml，加入100ml锥形瓶中，加入2-3滴0.1%酚酞指示剂，用0.1429 mol／L（5.75gNaOH溶于煮沸过的冷蒸馏水中，定容到1000ml，混匀后标定）进行滴定，滴定至微红色，平行滴定3次，记录平均消耗NaOH的体积。滴定1ml样品液，每消耗1ml0.1429mol/LNaOH时的溶液为1%酸度，也即为发酵液产酸率（%）。
3.5.4 PH测定
精确PH试纸、PH计（台式）、发酵罐PH电极。
3.5.5 菌种质量检查
(黑曲霉菌)在发酵液成球形体，散开的菌丝较少，菌细胞短，一头较粗如“鞋底状”，而污染的菌多呈菌丝状生长，一般曲霉菌细胞较长而平滑。取培养液稀释在显微镜下观察，合格的菌丝球应是致密形的，菌球直径不应超过0．1ram，菌丝短且粗，分支少，瘤状，部分膨胀[28]。
3.5.6菌浓度测定
采用B种血球计数板，计数室体积为0.1mm3.一个计数室为一个大方格，一个大方格分成25个中格，每个中格又分为16个小格，即一个计数室由400个小方格组成。计数时，分别在左上、左下、右上、右下和正中五个中格进行计数，然后计算80个小格中平均每小格上
菌细胞数，再计算400个小格即整个计数室中的菌体细胞数。位于中格线上的菌体只记此中格的上方及右方线上的细胞；凡菌体母细胞分裂的子细胞达母细胞大小的一半时，即可作为两个细胞计。计算公式：每毫升发酵液中黑曲霉菌细胞数=（80小格内细胞数/80）*400*104*稀释倍数。将样品稀释50倍后，采用上述方法进行计数，每个样品重复计数3次，取平均值[29]。
3.5.7 氧浓度测定
通风量的控制及发酵罐氧分压电极测定。
(以下的是在学校图书馆查阅的）
3.1 引言
选育出一株优良的高产菌株只是发酵工作的开始，并不意味着就能得到高产，发酵过程中的发酵参数直接影响该菌株的潜力的发挥。发酵过程中会有较多因素影响柠檬酸发酵产量，在发酵培养基营养成分方面影响较大的有碳源、氮源、(NH4)2SO4 添加量、各种金属离子含量等等。在发酵培养条件中影响较大的有：发酵温度、发酵初始pH 值、发酵接种量、发酵通风量等等。控制适合菌株发酵的最佳营养条件和最佳发酵条件，对提高柠檬酸发酵产量有重大影响。在大规模工业生产中又以通气、搅拌对发酵影响最为显著。由于上述发酵影响因素对黑曲霉柠檬酸发酵的影响较为显著，所以对这些因素进行具体详细的研究是十分必要的。
为了给黑曲霉柠檬酸发酵创造好的条件，本实验研究了玉米粉凊
液发酵的工艺条件。并为黑曲霉柠檬酸补料发酵打下了基础。本实验利用摇瓶发酵在实验室采用单因子实验和正交实验研究了黑曲霉Wsy-03 的最佳发酵培养基组成（包括碳源，氮源），并对影响黑曲霉柠檬酸发酵的发酵温度、发酵初始pH 及过程中pH的控制、发酵接种量进行了研究，利用小型自控发酵罐对发酵溶解氧对黑曲霉柠檬酸发酵的影响形成进行了系统研究，以寻求最优发酵培养基和发酵控制条件，同时柠檬酸的补料发酵的研究提供可靠依据和坚实基础。
3.2 实验材料
3.2.1 菌种
以柠檬酸主要生产菌株黑曲霉(Aspergillus niger)作为实验菌株。3.2.2 培养基
(1) 玉米粉种子培养基：自来水与玉米粉按质量比4：1 的比例混合，110℃保温并不断搅拌，并加入α-高温淀粉酶，恒温20min-30min，用碘指示剂检验不变蓝，即糖化完全，冷却，回复原来体积，得到20％玉米粉糖化液。将20％玉米粉糖化液经两层纱布过滤得糖化清液。用盐酸调节pH 到 4.5，250mL 摇瓶加人50mL 的20％玉米粉糖化液，纱布封口，121℃灭菌30min，得种子培养基。
(2) 玉米粉发酵培养基：将20％玉米粉糖化液与过滤后的玉米糖化清液按1：5 比例混合(V/V)。在500mL 摇瓶中加入50mL 混合后的培养基，添加0.3% (NH4)2SO4，调pH4.5，纱布封口。121℃灭菌30min，得发酵培养基。
3.2.3 试剂及材料邻苯二甲酸氢钾硫酸铜分析纯天津化学试剂
有限公司
盐酸琼脂碘化钾氢氧化钠分析纯莱阳化工有限公司
次甲基蓝碘酚酞酒石酸钾钠葡萄糖耐高温α-淀粉酶 2 万酶活/mL 糖化酶 2 万酶活/mL 玉米粉土豆
3.2.4 仪器设备
10L 全自动发酵罐瑞士Bioengineering AG
空压机龙海力霸通用机械有限公司
PH 电极；pH2050e panel 瑞士Bioengineering AG
氧电极；DO4050e panel 瑞士Bioengineering AG
3.3 实验方法
3.3.1 初糖含量对柠檬酸发酵的影响
(1) 初糖浓度对菌体生长的影响
在无菌状态下，分别调整发酵液初始糖浓度为10%、14%、18%、20%，24%，在玉米液化清液中添加17%玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量50mL)，35±1℃，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵开始后，每隔6h 分别从各个不同初糖浓度的发酵液中吸取1ml，进行菌丝体净重测量，记录净重变化。
在无菌状态下，分别调整发酵液初始糖浓度为10%、14%、18%、20%，24%，在玉米液化清液中添加17%玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量50mL)，35±1℃，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。
3.3.2 氮源含量对柠檬酸发酵的影响
(1) 有机氮源的需求量
在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中分别添加12%，17%，23%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量50mL)，35±1℃，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。
(2) (NH4)2SO4 添加量对柠檬酸产量的影响
在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中添加17%的玉米液化全液，再分别添加0.1%，0.2%，0.3%，0.4%(NH4)2SO4，pH4.5，按10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量50mL)，35±1℃，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。
(1) 有机氮源的需求量
在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中分别添加12%，17%，23%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量50mL)，35±1℃，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。
(2) (NH4)2SO4 添加量对柠檬酸产量的影响
在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中添加17%的玉米液化全液，再分别添加0.1%，0.2%，0.3%，0.4%(NH4)2SO4，pH4.5，按10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量50mL)，35±1℃，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。
3.3.3 温度对柠檬酸发酵的影响
在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中添加17%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量50mL)，分别在30℃，33℃，36℃，39℃，42℃温度下，300r/min进行柠檬酸发酵，发酵72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。
在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中添加17%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，分别按6%，8%，10%，12%，14%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量50mL)，35±1℃，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。
3.3.5 通风量对柠檬酸发酵的影响
采用10L 全自动通风机械搅拌发酵罐，玉米粉液化清液添加17%玉米粉液化全液，定容到8L ，添加0.3%的(NH4)2SO4，调节初始pH4.5，转速250～300r/min，。通风量12h 前：0.12VVM；12h-72h：0.15VVM，35±1℃，培养72h。从发酵16h开始每隔6h 取样，测定发酵液中柠檬酸积累量、还原糖消耗量和pH 值的变化情况。
3.4 测定方法
1.柠檬酸测定方法：（粗测法）采用0.1429mol/L 氢氧化钠溶液滴定。
2. 还原糖测定：发酵液稀释后，由斐林试剂直接测定。
3. 总糖测定：发酵液经酸水解后，由斐林试剂测糖法测定。
4. 氮含量测定：凯氏定氮法。
5. pH 值测定：酸度计测定或者是精密pH 试纸测定。
6. 菌丝球大小测定：测微计测定。
7. 孢子计数：血球计数板计数法测定
8. 菌丝球干重的测定：取出一定量的发酵液，离心机中3000r/min，离心30min，
用蒸馏水洗两遍后，倒掉清液，在烘箱中烘干后称重，记为菌丝净重。
9. pH 值测定：酸度计测定或者是精密pH 试纸测定。
10. 菌丝球大小测定：测微计测定。
11. 孢子计数：血球计数板计数法测定
12. 菌丝球数量测定：吸取1mL 生长成熟的种子培养基，进行一定倍数的稀释，
在显微镜下进行直接计数
13. 糖酸转化率计算公式如下:
糖酸转化率（% ）=%
100
?
-B
A
C
式中C——最终柠檬酸酸度(g/100mL)；
A——发酵液起糖浓度(g/100mL)；
B——发酵结束糖浓度(g/100mL)；
14. 产酸速率计算公式如下：
产酸速率（g/100ml?h）=
T C
C
2
1
-
式中
1
C——发酵最高酸度(g/100mL)；
2
C——发酵起始酸度(g/100mL)；
T——总发酵时间(h)。
3.5 结果与讨论
3.5.1 培养基成分对柠檬酸产量的影响
在柠檬酸发酵过程中，发酵初期黑曲霉会利用培养基中的营养成
分，利用碳源提供能量，利用氮源提供自身生长发育所需要的蛋白质和核酸等等。如果提供的营养成分不够就会影响黑曲霉的菌体生长和发育。在发酵后期，为了使黑曲霉能有效的积累柠檬酸，必须为菌体提供限量的营养因子。同时发酵液中的金属离子和各种产酸刺激物和抑制物都会对菌体生长和代谢柠檬酸有较大的影响。
3.5.1.1 初糖含量对柠檬酸产量的影响
(1) 初糖含量对菌体浓度的影响
不同初糖浓度的发酵培养基对黑曲霉菌丝球的生长发育有不同的影响。黑曲霉菌丝球接种到发酵培养基后还要继续生长，经过一段时间的生长发育，菌丝球的净重会达到一个饱和值，然后才开始发酵产酸。将黑曲霉菌丝球接种到不同糖浓度的发酵培养基中，跟踪菌体净重变化，了解不同初糖浓度的发酵培养基对菌丝球生长的影响，结果见图3.1。
从图3.1 可以看出，黑曲霉Wsy-03 菌丝球在接种到发酵培养基
中以后，菌丝球还会继续生长，经过一段时间会达到一个菌丝球浓度饱和值，这个饱和值在初糖浓度18%以下的发酵培养基中都相同，不同在于达到这个饱和值所要用的时间。从图 3.1 中可以看出，随着发酵液初糖浓度的提高，黑曲霉Wsy-03 菌丝球净重达到这个最大值所用的时间会越来越长，即较高的初糖浓度会对菌丝球生长产生抑制作用。同时也证明，从菌丝球生长方面看来，控制12%的发酵初糖，有利于补料发酵。
(2) 初糖对产酸的影响
发酵液初糖浓度的高低将直接影响黒曲霉菌体的生长与发育，影响柠檬酸产率和糖酸转化率。从黑曲霉发酵柠檬酸过程分析，如果发酵液初始糖浓度过高，会对孢子的生长发育有抑制作用，同时由于发酵原料是玉米液化液，所以过高的糖浓度还会使发酵培养基浓度过高，严重影响发酵液溶氧，由于在种子生长初期，孢子发育耗氧量非常大，所以发酵液初始糖浓度过高会严重影响菌丝球成型。但是，如果发酵液初始糖浓度太低，则菌丝球会长的很大，且形状不规则，生长不正常。不同发酵初糖浓度对黑曲霉Wsy-03 柠檬酸发酵的影响见表 3.1。
从表 3.1 可以看出，黑曲霉Wsy-03 在发酵液初糖浓度低于18%时，糖酸转化率一直保持在90%以上，且柠檬酸产量随发酵液糖浓度的增加而增加。但是在初糖浓度高于18%时，如果继续提高发酵液初糖含量，明显可以看出柠檬酸产量开始降低，同时糖酸转化率也开始降低。初糖浓度为18%时产酸率最高，而且糖酸转化率能达到90.12%，残糖含量仅为 2.92g/100mL。如果从降低粮耗的角度考虑，批料发酵时选择初糖含量在18%最为合适，产酸率，糖酸转化率都很高。同时从上表中可以看出黑曲霉Wsy-03 菌株在初糖浓度为14%的发酵培养基中，发酵速度快，残糖浓度低只有0.13g/100mL，碳酸转化率高达91.29%，有利于流加发酵，缩短发酵时间。所以，本实验采用发酵液初糖浓度18%研究批量发酵的最优条件，采用初糖浓度14%发酵培养基研究补料发酵的最优条件。3.5.1.2 氮源对柠檬酸产量的影响
菌体利用发酵液中的氮源是为了合成自身生长发育所需要的各种蛋白质、核酸和各种氨基酸.利用部分无机氮源作为菌体自身生长代谢的调节剂。在菌体的生长过程中，不同菌体利用各种有机氮或无机氮的种类是不同的。但是黑曲霉的生长过程比较粗放，可以利用各种
有机氮或无机氮作为其自身氮源。但是氮源的含量对黑曲霉柠檬酸的发酵却有十分重大的影响，如果氮源含量过低，会使发酵液处于营养贫瘠状态，使得菌体不能正常的发育生长，具体表现为菌体不能发育成为较完整的菌丝球，使得发酵产酸很低。但是如果发酵液中氮源含量过高，即发酵液营养过于充足，会使得菌丝球疯长，长的过大，且菌丝体过多，大大增加发酵液的粘稠度，影响发酵液溶氧，从而影响产酸。所以研究发酵液氮源含量对提高柠檬酸发酵产量有重要的意义。
(1) 氮源的需求量
分别测定总糖含量为18%的玉米液化清液和玉米液化全液的氮含量，具体结果见表3.2：
以玉米粉液化滤液为基料进行柠檬酸发酵时，需要补充一定量的氮源，通常调整氮源玉米粉液化全液，有时也用薯干粉或豆饼粉。在生产中调节发酵培养基中不同的氮源含量，发现明显影响发酵产酸量。为此，下面对以玉米粉液化滤液为基料，分别添加不同比例的玉米液化全液，调节不同的氮源含量。不同的氮源量对柠檬酸发酵产酸量的影响见表3.3。
从表3.3 可以看出，黑曲霉Wsy-03 以玉米粉为原料发酵柠檬酸时，蛋白质含量在0.32%时，即往玉米液化清液中添加17%的玉米液化全液，柠檬酸产量最高达
13.23g/100mL，同时糖酸转化率达90.87%。发酵液中蛋白质含量在0.26%时，虽
然糖酸转化较高，但是产酸量相对较低，只有90.65%，同时过高的氮源严重影响
了菌丝球的形成。所以本实验采用氮源含量在0.32%，即添加17%的玉米液化全液，
柠檬酸发酵产量最好。
从图3.2，3.3，3.4（此二图放大倍数为250 倍）可以看出，不同的蛋白质含量对黑曲霉Wys-03 菌丝球生长形态有较大的影响。蛋白质含量较少时，由于菌丝球不能得到充足的养分，使得菌丝球发育不好，菌球过小，且菌丝细长，有的发育过短的菌丝不能缠绕成完整的菌丝球。但是当蛋白质含量较高时，菌丝生长又会过于旺盛，大量的分散菌丝不能形成完整的菌丝球，大大的增加了发酵液的粘稠度。增加发酵液溶氧的困难。再次证明发酵液蛋白质含量在0.32%时，菌
柠檬酸及生产工艺
柠檬酸及生产工艺 一.柠檬酸的简介 1. 柠檬酸的理化性质 柠檬酸（Citric acid），又称枸椽酸，是一种三元羧酸,其学名为3-羟基-3-羧基戊二酸，分子式C6H8O7(无水物)，在自然界中存在于柠檬、柑桔、梅、子、梨、桃、无花果等水果中。柠檬酸具有无毒，无色，无臭特性，一般为半透明结晶或白色粉末，易溶于水、乙醇、乙腈、乙醚等[1]，不溶于苯，微溶于氯仿。相对密度1.542g/cm3，熔点153℃(失水)。柠檬酸结晶形态因结晶条件不同而不同，有无水柠檬酸，也有含结晶水的柠檬酸。在干燥空气中微有风化性，在潮湿空气中有潮解性，175℃以上分解放出水及二氧化碳。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H＋可以电离；水溶液呈酸性，加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。 2. 柠檬酸的用途 柠檬酸具有令人愉悦的酸味，入口爽快，无后酸味，安全无毒，被广泛用作食品和饮料的酸味剂；能与二价或三价的阳离子形成络合物，被用作金属加工的鳌合剂和洗净剂（起软化水作用的洗净力补充剂）；还能衍生形成许多衍生物，可用作有机化学工业的原料。因此被广泛用于食品饮料、医药化工、清洗与化装品、有机材料等领域，是目前世界需求量最大的一种有机酸[2]，到目前还没有一种可以取代柠檬酸的酸味剂。 二.生产技术 柠檬酸的生产方法共可分为 3 种: 水果提取法,化学合成法, 生物发酵法三种[17]，目前以发酵法生产柠檬酸为主[18]。发酵法又分为固体发酵法和液体深
层发酵法。固态发酵能耗小但劳动力大，占地面积大，不适合大规模的生产应用。深层通风发酵法采用不锈钢罐体，机械搅拌通风，微生物在液体相中分布均匀，发酵时不生成孢子，全部菌体细胞用于代柠檬酸，发酵速度高，实现了机械化或自动化操作，利于大规模生产。 三.生物发酵法制取柠檬酸 1.本工艺选择的原料及生产方法 本次生产工艺设计以薯干为原料，采用直接粉碎、调浆、液化，进行好气液体深层发酵，钙盐法提取，最后结晶、干燥得到柠檬酸 2.工艺流程 接收糖浆后，根据糖浆组成作适当的处理或配制，配成发酵原料，进行连续杀菌并冷却后，进入发酵罐，加入菌种和净化压缩空气后进行发酵；发酵液经升温、过滤处理后，进入中和罐，用中和处理；再经过过滤洗涤，得到柠檬酸钙固体，送入酸解罐，再添加酸解，并加入活性炭进行脱色；然后，通过带式过滤机过滤、酸解过滤，除去及废炭；酸解过滤液经离子交换处理后，进行蒸发、浓缩，再进行结晶；结晶后，用离心机进行固液分离，对得到的湿柠檬酸晶体进行干燥与筛选，最后得到成品柠檬酸。
柠檬酸生产工艺简介
柠檬酸生产工艺简介第一节概述 一、柠檬酸的用途 （一）在食品工业的应用 1、饮料 据统计75%～80%的柠檬酸用于饮料工业。 2、果酱与果冻 3、糖果 4、冷冻食品 5、酿造酒 6、冰淇淋和酸奶 7、脂肪与油 8、腌制品 9、罐头食品和水果加工 10、豆制品和调味品 （二）柠檬酸在药物、美容品、化妆品上应用 1、药物 “999胃泰” 2、发蜡与化妆品 （三）柠檬酸在工业上应用 1、金属净化
2、去垢剂 3、无土栽培农艺 4、矿物 5、…… 二、乳酸的用途 L-乳酸聚合成聚乳酸（PLA） 三、L-苹果酸的用途 三、葡萄糖酸的用途 四、琥珀酸的用途 我国柠檬酸发展简史 1968年我国第一家以淀粉为原料深层发酵柠檬酸成功投产的厂是上海酵母厂。同期，天津工微所开展了以适合我国国情的薯干原料深层发酵柠檬酸的研究工作。之后，上海工微所用该所的“东酒2号”黑曲霉为出发菌株，用薯干粉做培养基，很快选出了我国第一代深层发酵柠檬酸生产菌种AL558，由原轻工业部立项，组织上海、天津两个工微所、上海复旦大学生物系、上海新型发酵厂(筹)、上海酵母厂、天津柠檬酸厂(筹)、南通油洒厂(南通发酵厂前身)等单位，在南通油酒厂展开了善于深层发酵、全离交提取工艺的中、大型试验工作，并取得了成功，因而推动了我国柠檬酸工业于20世纪70年代初形成了工业体系。70年代中期到80年代是我国柠檬酸菌种选育的高峰期，先后选育出5代薯干原料高产菌株和适应淀粉、木薯、葡萄糖母液、糖蜜等原料的优良菌株。上海、天津两工微所和上海复旦大学生物系为此做出了很大贡献。各生产厂的广大科技人员和生产工人通过不懈地努力，提高了柠檬酸行业的整体水平，特别在缩短发酵周期、提高单产方面成绩突出，使我国柠檬酸发酵技术处于世界领先地位。无锡轻工业学院和天津轻工业学院为柠檬酸行业培养了一大批科技力量，已成为行业发展的骨干。1995年金其荣与蚌埠柠檬酸厂共同开发了玉米去渣发酵新工艺。同年黑龙江甘南柠檬酸厂于脱胚玉米去渣发酵工艺也成功投产。玉米新工艺的成功，使我国的柠檬酸工业进入一个
钙盐沉淀法提取柠檬酸
钙盐沉淀法提取柠檬酸 摘要：利用黑曲霉进行分离复壮，然后利用改良的马丁培养基进行发酵，再通过离心发酵液，利用两种不同的方法钙盐沉淀法和离子交换法进行分离柠檬酸，比较两种方法分离柠檬酸的产量，及两种方法的优缺点，同时还要注意发酵过程中，菌种的产量。 关键字；黑曲霉钙盐沉淀离子树脂交换 引言： 生产史;1784年C.W.舍勒首先从柑橘中提取柠檬酸。他是通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的。天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州、意大利和西印度群岛。意大利的产量居首位。到1922年，世界柠檬酸的总销售额的90％由美国、英国、法国等垄断。发酵法制取柠檬酸始于19世纪末。1893年C.韦默尔发现青霉（属）菌能积累柠檬酸。1913年B.扎霍斯基报道黑曲霉能生成柠檬酸。1916年汤姆和柯里以曲霉属菌进行试验，证实大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。如柯里以黑曲霉为供试菌株，在15％蔗糖培养液中发酵，对糖的吸收率达55％。1923年美国菲泽公司建造了世界上第一家以黑曲霉浅盘发酵法生产柠檬酸的工厂。随后比利时、英国、德国、苏联等相继研究成功发酵法生产柠檬酸。这样，依靠从柑橘中提取天然柠檬酸的方法逐渐为发酵柠檬酸所取代。1950年前，柠檬酸采用浅盘发酵法生产。1952年美国迈尔斯试验室采用深层发酵法大规模生产柠檬酸。此后，深层发酵法逐渐建立起来。深层发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸生产的主要方法。中国用发酵法制取柠檬酸以1942年汤腾汉等报告为最早。1952年陈声等开始用黑曲霉浅盘发酵制取柠檬酸。轻工业部发酵工业科学研究所于1959年完成了200l规模深层发酵制柠檬酸试验，1965年进行了生产100t甜菜糖蜜原料浅盘发酵制取柠檬酸的中间试验，并于1968年投入生产。1966年后，天津市工业微生物研究所、上海市工业微生物研究所相继开展用黑曲霉进行薯干粉原料深层发酵柠檬酸的试验研究，并获得成功，从而确定了中国柠檬酸生产的这一主要工艺路线。薯干粉深层发酵柠檬酸，原料丰富，工艺简单，不需添加营养盐，产率高，是中国独特的先进工艺。中国石油发酵柠檬酸的研究起步较早。1970年，天津、上海、沈阳、常州等地研究单位利用解脂假丝酵母(candida lipolytica)进行石蜡油（正构烷烃）发酵生产柠檬酸的试验。1979年徐子渊等筛选出一株对氟乙酸敏感的变异株解脂假丝酵母，其乌头酸水合酶的活性很低，柠檬酸的生成比例从原来的50％提高至80％，从而提高了石油发酵柠檬酸的产率。随着生物技术的进步，柠檬酸工业有了突飞猛进的发展,全世界柠檬酸产量已达0.4Mt。在柠檬酸发酵技术领域，由于高产菌株的应用和新技术的不断开拓，柠檬酸发酵和提取收率都有明显提高，每生产1t柠檬酸分别消耗2.5～2.8t糖蜜,2.2～2.3t 薯干粉或1.2～1.3t蔗糖。人们正在大力开发固定化细胞循环生物反应器发酵技术 柠檬酸 又名枸橼酸，外观为白色颗粒状或白色结晶粉末，无臭，有强烈的酸味，它存在于天然果实中，其中以柑桔、菠萝、柠檬、无花果等含量较高。早期柠檬酸是以天然果实为原料加工而成，1893年德国微生物学家Wehmen发现二种青霉菌能够积累柠檬酸，1951年美国Miles公司首先采用深层发酵大规模生产柠檬酸。我国1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬酸成功，柠檬酸生产由于工艺简单、原料丰富、发酵水平高，至20世纪70年代中期，已初步
吸交法提取柠檬酸新工艺及实验方案
吸交法提取柠檬酸新工艺及时验方案 一、实验目的 我国的柠檬酸生产厂家目前全部采用“钙盐法”提取工艺，每生产一吨柠檬酸要产生两吨固体硫酸钙，成为工业垃圾，造成严重的环境污染；由于需要加热和洗涤，生产过程粗放，因而能源消耗大、自动化水平较低；工艺本身存在缺陷，至少要有10％已经发酵好的柠檬酸未被提取，造成巨大浪费。采用“吸交法”新工艺后，柠檬酸总提取收率平均达90.09％，产品质量显著提高，98％以上达到英国药典规定标准，生产成本每吨下降1180元，副产品硫酸钠可回收利用，实现了清洁化生产。 二、实验原理 将发酵液用板框过滤，清液在经膜过滤、通过炭柱脱色，阳柱除去阳离子，然后用吸交柱将柠檬酸解吸出来。选择吸交法提取工艺路线。“吸交法”是利用吸交树脂吸取滤液中的柠檬酸，然后用一定浓度的硫酸溶液将柠檬酸洗出。 发酵液 ↓ 菌丝体（50%水）←压滤 ↓↓ 烘干膜过滤 ↓↓ 菌丝体（10%水）炭柱←脱色 ↓ 阳柱←盐酸 ↓ 稀硫酸—→吸交柱 ↓
阴柱 ↓ 浓缩 ↓ 结晶 ↓ 三、实验器材 1 仪器 烧杯、离子交换柱、三角瓶、碱式滴定管、移液管。 2 试剂 经板框压滤后的发酵清液、活性炭、阴阳离子交换树脂、5%Hcl、浓硫酸、氢氧化钠、酚酞指示剂。 四、实验步骤 1、取发酵精滤液约500ML,测量精确体积V 1及酸度C 1 。 种子液、发酵液酸度测定： 取过滤后的种子液1ml于250ml三角瓶中，加25ml蒸馏水，摇匀，加入2滴1%酚酞指示剂，摇匀，用0.1429mol/L的NaOH滴定至溶液由无色到粉红色为终点，记下所消耗的NaOH的ml数。 0.1429×V NaOH×0.07 酸度%= ×100% 1 2、将发酵液过炭柱脱色，控制流速为170v/h,观察溶液的颜色变化。待脱色完 毕后再测体积V 2和酸度C 2 。用蒸馏水洗炭柱，pH 由2至2.5时中止洗涤，测量 洗液体积V 3及浓度C 3 。继续水洗炭柱至到中性。 3、先将体积V 2和酸度C 2 的溶液过阳离子交换柱，以脱去溶液中的一些阳离子。 严格控制流速为170v/h。待过完阳柱后，测体积V4及酸度C4。再将体积V3及浓度C3 的洗液过阳柱，水洗阳柱后测体积及酸度（这一部分洗液可作为回收待用溶液，暂不作下一步实验用）。 过完阳柱后，离子交换树脂需立即再生与活化，方法如下： 强酸性阳离子交换树脂的再生方法：先用水从交换柱下端反顶树脂，逐去气泡及污物，
柠檬酸产生菌黑曲霉的筛选
微生物上游技术综合实验报告书 （2013‐2014学年） 实验题目：柠檬酸产生菌黑曲霉的筛选 学院名称：生物与化学工程学院
柠檬酸产生菌黑曲霉的筛选 前言：柠檬酸(也称构椽酸)是重要的有机酸,是柠檬、袖子、柑橘、葡萄等水果天然酸味的主要成分。天然柠檬酸在自然界中分布很广，天然的柠檬酸存在于植物如柠檬、柑橘、菠萝等果实和动物的骨骼、肌肉、血液中。柠檬酸行业是我国生物农业中的一个重要行业，广泛用于食品、医药、生物工程、精细化工等行业，具有极其广阔的发展前景，而黑曲霉是生产柠檬酸最为重要的菌种，它的产酸能力将直接影响柠檬酸的产量，因此黑曲霉的选育将会产生极大的经济效益。柠檬酸发酵生产目前所采用的菌种主要是黑曲霉菌种和酵母菌菌种，而淀粉质原料发酵主要以黑曲霉菌种为主。对于柠檬酸发酵行业来说，菌种产酸水平的高低是决定柠檬酸发酵生产的关键因素之一，因此，柠檬酸菌种黑曲霉的选育研究一直成为科研人员关注的焦点，国内外有很多关于柠檬酸发酵菌种黑曲霉选育的研究报道。我国柠檬酸生产菌种的发酵水平经过几十年的努力，工业产酸水平平均达到13%以上，尽管我国柠檬酸发酵技术在世界上暂时处于领先地位，但菌种选育方面的竞争依然形势严峻。因此，应当加快产柠檬酸产生菌的研究，继续筛选高产柠檬酸的优良菌株，扩大产柠檬酸菌种的来源。本实验主要进行了土壤中柠檬酸高产菌株黑曲霉的筛选、形态、产酶条件及酶学性质的研究。 黑曲霉（Aspergillus niger）的形态特征和生理特征。在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有
柠檬酸生产工艺
柠檬酸及生产工艺 摘要：柠檬酸广泛应用于食品工业、医药工业和化学工业等方面。它可利用糖质原料如土豆、地瓜中的淀粉等，在多种霉菌及黑曲菌的作用下，控制较低的温度和pH值、较高的通气量和糖浓度，用发酵法制得。 关键词：柠檬酸化工产品发酵法 1 产品说明 柠檬酸又名枸橼酸，学名3-羟基-3-羧基戊二酸，分子式C6H8O7为无色、无臭、半透明结晶或白色粉未，易溶于水及酒精。加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。 柠檬酸主要应用于食品工业，因为柠檬酸有温和爽快的酸味，普遍用于各种饮料、汽水、葡萄酒、糖果、点心、饼干、罐头果汁、乳制品等食品的制造。柠檬酸在化学工业上可作化学分析用试剂，用作实验试剂、色谱分析试剂及生化试剂，用作络合剂，掩蔽剂，配制缓冲溶液。采用柠檬酸或柠檬酸盐类作助洗剂，可改善洗涤产品的性能，可以迅速和沉淀金属离子，防止污染物重新附着在织物上，保持洗涤必要的碱性，使污垢和灰分散和悬浮，提高表面活性剂的性能，是一种优良的鳌合剂。 2 生产原理 2.1 生产方法简介 中国现有柠檬酸生产厂近百家，总年产能力约80万吨，是全球最大的柠檬酸生产国和出口国。目前，柠檬酸生产方法有水果提取法，
化学合成法和生物发酵法三种。水果提取法是指柠檬酸从柠檬、橘子、苹果等柠檬酸含量较高的水果中提取，此法提取的成本较高，不利于工业化生产。化学合成法的原料是丙酮，二氯丙酮或乙烯酮，此法工艺复杂，成本高，安全性低。而发酵法发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸生产的主要方法。 2.2 反应方程式 C12H22011 +H20+302→2C6H8O7+4H2O (蔗糖) （柠檬酸） 3 工艺过程及流程图 3.1工艺过程 3.1.1菌种培养 在4～6波美度的麦芽汁内加入25％至30％的琼脂，然后接入黑曲霉菌种（无茵操作），在30～32℃条件下培养4天左右。这种培养方法称为“斜面培养”。将麸皮和水以1：1的比例掺拌，再加入10％的碳酸钙、0．5％的硫酸铵，拌匀后装入容量为250毫升的三角瓶中，用1．5公斤压力灭菌60分钟。接人斜面培养法培养出的菌种，培养96～120小时后即可使用。 3.1.2原料处理 湿粉渣必须经过压榨脱水，使含水量在60%左右；干粉渣含水量低，应按60％的比例补足水分；结块的粉渣需粉碎成二至四毫米颗粒。然后加入2%碳酸钙、10％至11％的米糠，掺匀后，堆放2小时，
柠檬酸
柠檬酸生产工艺技术及进展
柠檬酸生产工艺技术及进展 周明 （辽宁科技大学化学工程学院化工08·5） [ 摘要 ]介绍了水果提取法、化学合成法、生物发酵法3种柠檬酸的生产方法以及传统生产工艺。详细阐述了目前国内外在开发柠檬酸生产的新原料、改进生产工艺及提取工艺等方面的进展情况,并对各种技术的原理、优缺点、应用等方面进行了论述和比较。 [ 关键词 ]柠檬酸；发酵；提取 Abstract : Three methods of citric acid-production are introduced, such as separating from fruit, chemical synthesis, biological ferment .The tradition technology of citric acid-production is reviewed. The exploitation of new material, some progresses of production technology and separation technology are presented. In addition, the principles, technique development , advantages and application are described and compared. Key words: citric acid; ferment ; separation 柠檬酸,又名枸橼酸,分子式C6H8O7(无水物),是世界产量较大的一种有机酸。主要用于食品工业、医药业、化学工业,并且在电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域中也有十分广阔的应用。传统的柠檬酸生产是以薯干为原料,经生物发酵工艺和钙盐法提取工艺制得。传统工艺存在环境污染严重,生产成本高,产品质量不高等问题。近年来,在生产新原料方面,研究出了以玉米粉、稻米、秸杆等为原料的生产方法[1-4],使生产成本大大降低,废物排放减少。采用工业离子色谱法、母液净化处理、循环利用废糖液等技术[5-7]对生产工艺进行了改进,降低了生产成本、能耗及污染物的排放。为保护环境,使用了离子交换树脂法、电渗析、膜分离和吸交法等提取技术[8-12] ,基本实现了清洁的生产工艺。通过这些改进,使柠檬酸的生产提高了产品质量,降低了生产成本,减少了对环境的污染等。本文介绍了柠檬酸的生产方法及传统的生产工艺, 阐述了国内外在新原料,生产工艺改进及新提取技术等方面的进展,并对其原理、优缺点、应用等方面进行了论述和比较。 1 柠檬酸的生产方法 柠檬酸的生产方法共可分为3种：水果提取法,化学合成法，生物发酵法。1.1 水果提取法 柠檬酸可以从柠檬、橙、橘子、苹果等柠檬酸含量较高的水果中提取。当今，水果的生产已经产业化,水果产量也随之增加,并且比较集中,在考虑生态果园和综合利用时,可以利用这种方法来提取柠檬酸。但此法成本较高,不利于投入工业化生产[12,13] 。
黑曲霉的次级产物的提纯
淮北师范大学信息学院 07生物工程 实验课题：利用黑曲霉生产柠檬酸的 实验设计方案 设计成员：万纹纹王磊 陈晨夏柱宝 指导老师：高翔
利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案 实验步骤： 筛选 → 诱变 → 培养基条件 → 发酵→ 产品分离纯化 一、 菌种的筛选： 1、 土壤采样： 采样人： 万纹纹 王磊 陈晨 夏柱宝 采样时间： 采样地点： 环境条件： 用取样铲，将表层5cm 左右的浮土除去，取5～25cm 处的土样10～25g ，装入事先准备好的塑料袋内扎好。应在三处不同的地点进行采样，将采集好的样品带回实验室备用。 2、 倒平板： 将PDA 培养基加热融化，待冷却至55-60℃倒平板15皿。 PDA 培养基配方： 马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 自然 3、 制备土壤稀释液：各称土样10g ，迅速倒入带玻璃珠的90mL 无菌水的三角瓶中(玻璃珠 用量以充满瓶底力最好)，振荡约20min ，使土样充分打散，用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后在用无菌吸管从此试管中 吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管里，混合均匀，以此类推制成110-、210-、3 10-、410-、510-、610-不同稀释度的土壤溶液。
4、 涂布：将倒好平板的底面用记号笔标上4 10-、5 10-和6 10-三种稀释度，然后用无菌吸 管分别由4 10-、5 10-和6 10-三管土壤稀释液中各吸取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温静置5-10min ，使菌液吸附进培养基。 5、 培养： 将涂布好的平板倒置于35℃的培养箱中培养3-5d. 6、 挑菌落：黑曲霉形态特征：在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑 色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐，菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成1层或2层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。 用灭菌后的接种环在单个菌落上挑取少许要分离的细胞，接种到PDA 培养基的斜面上。置于35℃的培养箱中培养，待菌苔长出后观察其特征是否一致。 7、 划线分离： 用灭菌后的接种环挑取斜面培养基上的菌落在培养皿中划线。此步需要9 个培养皿。（注意：接种的过程最好在接种箱内进行。）将已划线的培养皿置于35℃的培养箱中培养3-5d 。观察菌落特征是否一致。 8、 镜检：在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘挑取少量已 产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。（试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液；仪器用具：无菌吸管，载玻片，盖玻片，解剖针，镊子，50%乙醇及显微镜等） 9、 制备母斜面：用灭菌的接种环将三种划线平板中的纯种黑曲霉接种到斜面上，作为母斜 面，35℃培养，备用。 10、产酸能力的检测： 将培养基50ml 分装到250ml 三角瓶内，灭菌后接入斜面孢子2环，于30~33℃培养。旋转式摇床的转速为300r/min ，往复式摇床振幅6cm ，频率为120
离子交换法提取柠檬酸概述
离子交换法提取柠檬酸概述 应富祥 (安徽省皖东化工厂,天长 239300) 柠檬酸生产工艺,目前均采用钙盐法,劳动强度大,所产生的硫酸钙废渣,污染环境,而且提取收率低,能耗大,往往由于水解和分离不彻底,使柠檬酸混杂于废渣中废弃,严重影响收率。离子交换法是提取柠檬酸的新工艺,值得推广。过去曾有人用离子交换膜、电渗析法生产柠檬酸,由于种种原因,没能成功,以后有人采用离子交换法,但因当时国产离子交换树脂品种少,价格高,物化性能也满足不了工艺要求,造成提取收率低,成本高,母液中残留其它有机杂酸和色素,结果仍需采用“钙盐法”进行净化,故无明显优势,没有得到发展。离子交换法新工艺,工艺简单,容易操作,连续化管道化生产,自动化操作,大大减轻劳动强度,不产生硫酸钙废渣,提取收率可由旧工艺的70%提高到90%以上。新工艺简单易行。将发酵液过滤后用颗粒活性炭脱色除杂,经特制的高强度高交换容量的弱碱性阴离子交换树脂交换吸附,饱和后用氢氧化钠或氢氧化铵进行洗脱,洗脱液再经特制的大孔强酸性阳离子交换树脂除杂,用氢离子交换使柠檬酸钠(铵)转化为柠檬酸,经浓缩结晶可获得质量优良的柠檬酸产品。结晶母液再经阴离子交换树脂除杂,再浓缩结晶,也获得合格产品。 离子交换法提取柠檬酸工艺流程如下 : 1 离子交换法提取柠檬酸交换洗脱原理 1.1 吸附 阴离子交换树脂以OH 型进行交换与吸 附 3R OH+C 6H 8O 7→R CHO+3H 2O 1.2 洗脱 采用氢氧化钠或氢氧化铵为洗脱剂 R 3C 6H 5O 7+3NaOH →Na 3C 6H 5O 7+3R OH 如用氨水洗脱: R 3C 6H 5O 7+3NH 3?H 2O →(NH 4)3C 6H 5O 7+3R OH 1.3 利用大孔阳离子交换树脂 以氢离子交换除阳离子,使柠檬酸盐成为柠檬酸,阳离子交换树脂经酸再生后仍成为氢型。 Na 3C 6H 5O 7+3RSO 3H →3RSO 3N a +C 6H 8O 7(NH 4)3C 6H 5O 7+3RSO 3H →3RSO 3(NH 4)3+C 6H 8O 7 再生: RSO 3Na +HCl →RSO 3H+NaCl RSO 3(NH 4)3+HCl →RSO 3H+NH 4Cl 注:R 为阳树脂骨架,R 为阴树脂骨架。 2 离子交换树脂型号的选择 2.1 专用阴树脂与一般的201×7比较其体积交换量m mol/ml 为2.7,而201×7为1.4,所用专用的阴树脂比较优越,体积几乎高出一倍。 2.2 专用的大孔强酸阳树脂与一般的001×7比较 其体积交换量(mmol/ml)为1.57,0.01×7为1.8,但大孔强酸树脂不易破碎寿命 24总第95期1998年第5期 安 徽 化 工
教案实验四 黑曲霉发酵生产柠檬酸
实验四黑曲霉发酵生产柠檬酸 【目的要求】 1. 掌握实验室菌种种子生产方法。 2. 掌握柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。 3. 熟悉并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况； 4. 掌握钙盐法提取柠檬酸的原理与方法。 【基本原理】 黑曲霉发酵生产柠檬酸实验中需要大量活化的孢子，其制备是采用麸皮培养基中保藏的黑曲霉孢子，在新的麸皮培养基上于适当的温度下活化并大量繁殖，从而产生大量活化孢子。 黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）转变为丙酮酸；丙酮酸氧化脱羧形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA循环不能充分进行，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为：C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H2O 以薯干粉或玉米粉为原料的黑曲霉柠檬酸发酵液，除了含有大量柠檬酸外，还有大量的菌体，少量没有被黑曲霉利用的残糖、蛋白质、脂肪、胶体化合物以及无机盐类等。柠檬酸提取就是从成分复杂的发酵液中分离提纯获得柠檬酸。从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法主要有：钙盐-离子交换法、溶剂萃取法、“吸交”法、离子色谱法等。目前国外生产主要采用钙盐-离子交换法和溶剂萃取法；国内生产主要采用钙盐-离子交换法，“吸交”法和离子色谱法正在推广中。 钙盐法首先采用过滤或超滤除去发酵液中的菌丝体等不溶残渣，然后在澄清过滤液中加入碳酸钙（或氢氧化钙）发生中和反应，生成难溶的柠檬酸钙沉淀，利用在80-90℃下柠檬酸钙的溶解度极低的特性，通过过滤（或离心）将它与可溶性的糖、蛋白、氨基酸、其它有机酸、无机离子等杂质分离开，用80-90℃热水反复洗涤柠檬酸钙，除去残糖和其他可溶性杂质，经过滤（或离心）获得较净的柠檬酸钙，然后在洗净的柠檬酸钙中缓慢地加入稀硫酸进行酸解反应，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，经过滤（或离心）除去硫酸钙沉淀，获得粗制的柠檬酸。其主要反应式为： 2C6H8O7·H2O+3CaCO3Ca3（C6H5O7）2·4H2O +3CO2 +H2O
黑曲霉发酵提取柠檬酸
黑曲霉发酵提取柠檬酸 实验一黑曲霉保藏菌的复苏 实验目的：了解黑曲霉保藏菌的生长状况和保藏菌的活化处理过程。实验原理：能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉中的一些菌株都能够利用淀粉质原料大量积累柠檬酸。目前国内主要利用黑曲霉（Aspergillus niger）通过固体发酵或液体深层发酵生产柠檬酸。发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是微生物产生糖化霉首先将淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经过糖酵解途径（EMP）转变为丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶的作用下乙酰辅酶A和草酰乙酸合成为柠檬酸。产生的柠檬酸经碳酸钙作用形成柠檬酸钙沉淀，再经稀硫酸作用释放出柠檬酸。 实验步骤：1、观察保藏菌的生长状况，记录PH 2、黑曲霉复苏培养基的配制 （1）、分别称取蔗糖30g，KNO3 1g, K2HPO4 1g, 麸皮10%，MgSO4.7H2O 0.5g, KCL 0.5g, FeSO4.7H2O 0.01g, 于500ml搪瓷缸中。 （2）、加蒸馏水100ml，调节pH至7.0-7.2 （3）、牛皮纸包扎，灭菌 3、保藏菌的活化扩增 （1）配制5oBe’麦芽琼脂培养基 （2）20℃麦芽汁，糖度为5
（3）加0.7%的琼脂 （4）加热，使其沸腾 （5）分装与试管中，每管约3ml （6）包扎灭菌，制成斜面培养基 （7）在超净工作台上划菌，包扎 （8）置于28~30℃培养箱中培养 实验要求：分析复苏和保藏培养基的区别，原因，营养成分的差异和操作的目的和意义。并加注参考文献。
实验二黑曲霉一级种子的制备 实验目的：了解种子扩大培养的程序，比较复苏均至一级种子的生境变化。 实验原理：黑曲霉在生长过程中不仅需要有充足的营养成分，而且还需要一定的氧气环境等。通过拌菌等增加菌种与培养基营养成分的充分接触，获得良好的生长。 实验步骤：1、观察活化的保藏菌生长状况，并记录。 2、在超净工作台上，将2-4管/组，活化的保藏菌分别加入约3mL双蒸水。 3、在混匀器上，将活化的保藏菌制成孢子悬液。 4、在超净工作台上，将孢子悬液一次倒入察氏培养基中。 5、用灭过菌的玻棒，将菌液和培养基充分拌匀。 6、测定此时的pH值，并记录。 7、取5ml充分拌匀的菌液培养基，用滤纸过滤。 8、收集滤液于20ml 离心管中。 9、3000r/min, 离心5min。 10、收集上清于试管中，标记后置于-4℃冰箱中。 11、每隔2天，用灭过菌的玻棒，在超净工作台上拌菌。同时测定pH，并取5ml样品，以上述做法，将收集的上清液保藏于-4℃冰箱中。注意：标记时，要标明实验日期，组别，班号。
产柠檬酸黑曲霉的筛选
产柠檬酸黑曲霉的筛选 组长：高鸿飞 组员：刘光明，何笑军，董慧，王志昆，胡明慧 （西南大学药学院，重庆 400716） 【摘要】：以从西南大学各处土壤中分离得到的黑曲霉作为出发菌株，并对其进行了初步分离。利用酸分离法和变色圈法进行初步筛选，以产酸能力的强弱作为复筛指标，筛选到了一株稳定，高产柠檬酸的优势菌株。并利用正交实验法优选柠檬酸产生菌的最佳发酵培养基，紫外诱变育种法探究高产菌诱变的较佳时间。 【关键词】：黑曲霉；酸分离法；变色圈法；筛选；正交试验；诱变 柠檬酸又名枸橼酸，是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一。产柠檬酸的微生物包括真菌、细菌和酵母，黑曲霉是迄今为止产柠檬酸最佳的微生物之一。本次实验的目的是从土壤中筛选柠檬酸的黑曲霉高产菌株，并对其培养基的配置及最佳产酸条件进行探索，为今后进一步完善和优化其筛选工艺提供一定理论依据。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 出发菌种 从西南大学食堂周围，山顶，试验田土壤中分离获得。 1.1.2 培养基 察氏培养基 成分硝酸钠3g 磷酸氢二钾1g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g 氯化钾0.5g 硫酸亚铁0.01g 蔗糖30g 琼脂20g 蒸馏水1000mL 制法：加热溶解，分装后121℃灭菌20min。 1.1.3其他柠檬酸，可溶性淀，Deniges试剂，蔗糖 NH4NO3，KH2PO4，MgSO4·7H2O ，溴甲酚绿指示剂，氢氧化钠溶液，KMn044溶液 1.2 实验方法 1.2.1黑曲霉筛选的流程 土壤→稀释分离→变色圈平板→挑菌→纯化→ 摇瓶初筛→产物鉴定→复筛→正交实验→最优组合 →诱变育种 1.2.2 黑曲霉的分离与鉴定 采集表层以下 5-10cm 处土壤，称 1.0g 土壤迅速倒入装有玻璃珠的无菌水三角瓶中，配成 10-2的土壤菌悬液，然后用移液管将其稀释到10-3、10-4、10-5倍。分别吸取10-3、10-4、10-5倍稀释液注入到酸分离培养基上以及涂布到察氏琼脂培养基上，静置 5min 后倒置于恒温培养箱内 35℃培养 3-4d，观察菌落形态特征，挑选出黑曲霉疑似菌株。 1.2.3 黑曲霉的初筛 将上述所得菌种连续划线接种到初筛培养基平板上，在37℃的恒温培养箱培养3-4d 后，发现菌落周围有黄色的变色圈（溴甲酚绿指示剂遇酸会产生颜色反应）。快速测定菌落及周围变色圈直径的大小，选择生长较快、变色圈与菌落直径之比相对较大者作为初筛菌株。并利用Deniges试剂(HgO 1g溶于20ml 0.2L／L H2S04中)鉴定柠檬酸和用0.1429mol/L 的NaOH测定产酸量 1.2.4 黑曲霉的复筛 将初筛到的黑曲霉（变色圈明显）接种到摇瓶培养基中，发酵 3-5d，重复培养一次。然后用 0.1429mol/L 的 NaOH 溶液滴定10mL 的发酵液，记录各自消耗 NaOH 的体积和计算产酸量。采用正交试验确定培养基浓度。选取四个主要影响因素：蔗糖、NH4NO、KH2PO4，MgSO4·7H2O每个因素各取三个水平，采用四因素三水平进行正交试验L9(34)以优势黑曲霉所产柠檬酸的产酸量为评价指标。这样各个营养成分的浓度也就较为容易地确定下来了。 1.2.5 柠檬酸鉴定及产酸量的测定
黑曲霉产柠檬酸的发酵过程表征及乙醛酸的形成
黑曲霉产柠檬酸的发酵过程表征及乙醛酸的形成 杨晓涛1,2，郭艳梅2，曾祥峰2，满云3，郑平2，王昌禄1，孙际宾2 （1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）（2.中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308）（3.中粮集团安徽丰原生化股份有限公司，安徽蚌埠 233010） 摘要：本文对黑曲霉柠檬酸生产过程的菌体形态、总糖、还原糖及有机酸的变化进行了系统地研究。研究结果表明：整个发酵过程中，菌球形态保持紧密稳定，发酵产物中以柠檬酸为主，产量达到155 g/L。并首次发现柠檬酸发酵过程中伴随有乙醛酸的生成，最大浓度可达9.4 g/L。对于菌种和发酵工艺的改进有着重要的指导意义。 关健词：黑曲霉；柠檬酸；乙醛酸；发酵过程 文章篇号：1673-9078(2011)10-1183-1186 Characterization of the Hyperproduction Process of Citric Acid by Aspergillus niger and the Formation of Glyoxylic Acid YANG Xiao-tao1, GUO Y an-mei2 , ZENG Xiang-feng2, MAN Yun3, ZHENG Ping2, W ANG Chang-lu1, SUN Ji-bin2 (1.College of Food Science and Bioengineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China) (2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin, 300308, China) (3.Anhui BBCA Biochemical Co., Ltd, Bengbu 233010, China) Abstract:China is the major manufacturer for citric acid in the world. The morphology, sugar fluctuation and organic acid formation were systematically and quantitatively measured during the citric acid fermentation process by an industrial strain Aspergillus niger. It was shown that the hyphae was tightly packaged as stable pellets throughout the fermentation process; citric acid up to 155g/L is the major product. Surprisingly, we found that glyoxylic acid, which was thought as an toxic metabolite and less possible to be accumulated during the fermentation process, is the key product coupling with citric acid production. The concentration of glyoxylic acid reached up to 9.4g/L at the end of fermentation. This finding leads to new ideas for the strain improvement and process optimization in the future. Key words: Aspergillus niger; citric acid；glyoxylic acid; fermentation 黑曲霉是一种重要的工业微生物，在酶制剂、有机酸和异源蛋白领域有重要的应用。柠檬酸作为一种有机酸，在食品、医药、生物工程、化装品、化工、洗涤剂等行业有着广泛的应用[1~2]，世界上柠檬酸的产量已超过120万t，其中三分之二产能来自中国。柠檬酸主要通过黑曲霉发酵生产，而黑曲霉菌种水平一直是制约柠檬酸生产和经济效益的一个瓶颈[3~4]。通过几代人不懈的努力，中国的柠檬酸生产菌种曾经达到较高的水准，菌种技术一度出口国外。但是随着现代基因组测序、系统生物学的兴起，基因组工程技术在国际上得到广泛采用，成功实例不断增加，国内基于传统菌种选育技术获得的菌种面临着挑战。急需定量收稿日期：2011-05-20 基金项目：国家自然科学基金项目(30870574)；中科院重要方向项目（KSCX2-YW-G-030） 作者简介：杨晓涛（1984-），男，硕士 通讯作者：孙际宾，研究员，博导，研究方向：工业微生物系统生物技术解析国内菌种的代谢调控瓶颈，应用先进的菌种设计技术对工业菌株进行研究和改造。 黑曲霉积累柠檬酸通常认为有四方面的调节：糖酵解及丙酮酸代谢的调节，三羧酸循环的调节，Mn2+调节和O2的调节等。黑曲霉只有在限制氮源和锰等金属离子，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，细胞才能大量积累柠檬酸并排出体外。但是对该发酵过程生理生化调控的分子机制还缺乏统一的认识。到目前为止，对国内黑曲霉柠檬酸生产过程各种理化参数变化的分析报道还比较少，导致国内柠檬酸发酵过程控制基本上不透明，大大影响了发酵工艺的优化和菌种的设计改造进程。刘加兰等利用HPLC检测柠檬酸发酵液中的有机酸进行了定量分析，柠檬酸的产量达到了107 g/L，其他有机酸(草酸、富马酸、苹果酸、乌头酸)的量维持在1 g/L以下[5]，但对于发酵液中的其他有机酸(乙醛酸、琥珀酸)，没有同时进行检测。苹果酸是三羧酸循环的重要中间产物，是生物法生产 1183
柠檬酸及生产工艺
艺工及生产柠檬酸柠檬酸的简介.一 1. 柠檬酸的理化性质 柠檬酸（Citric acid），又称枸椽酸，是一种三元羧酸,其学名为3-羟基-3-羧基戊二酸，分子式C6H8O7(无水物)，在自然界中存在于柠檬、柑桔、梅、李子、梨、桃、无花果等水果中。柠檬酸具有无毒，无色，无臭特性，一般为半透明结晶或白色粉末，易溶于水、乙醇、乙腈、乙醚等[1]，不溶于苯，微溶于氯仿。相对密度cm3，熔点153℃(失水)。柠檬酸结晶形态因结晶条件不同而不同，有无水柠檬酸，也有含结晶水的柠檬酸。在干燥空气中微有风化性，在潮湿空气中有潮解性，175℃以上分解放出水及二氧化碳。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H＋可以电离；水溶液呈酸性，加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。 2. 柠檬酸的用途 柠檬酸具有令人愉悦的酸味，入口爽快，无后酸味，安全无毒，被广泛用作食品和饮料的酸味剂；能与二价或三价的阳离子形成络合物，被用作金属加工的鳌合剂和洗净剂（起软化水作用的洗净力补充剂）；还能衍生形成许多衍生物，可用作有机化学工业的原料。因此被广泛用于食品饮料、医药化工、清洗与化装品、 有机材料等领域，是目前世界需求量最大的一种有机酸[2]，到目前还没有一种可以取代柠檬酸的酸味剂。 二.生产技术 柠檬酸的生产方法共可分为3 种: 水果提取法,化学合成法, 生物发酵法
三。发酵法又分为固体发酵法和液体深[18]，目前以发酵法生产柠檬酸为主[17]种 不适合大规模的生产应用。固态发酵能耗小但劳动力大，占地面积大，层发酵法。深层通风发酵法采用不锈钢罐体，机械搅拌通风，微生物在液体相中分布均匀，发酵时不生成孢子，全部菌体细胞用于代谢柠檬酸，发酵速度高，实现了机械化或自动化操作，利于大规模生产。 生物发酵法制取柠檬酸.三 本工艺选择的原料及生产方法1. 本次生产工艺设计以薯干为原料，采用直接粉碎、调浆、液化，进行好气液体深层发酵，钙盐法提取，最后结晶、干燥得到柠檬酸 工艺流程2. 接收糖浆后，根据糖浆组成作适当的处理或配制，配成发酵原料，进行连续杀菌并冷却后，进入发酵罐，加入菌种和净化压缩空气后进行发酵；发酵液经升中和处理；再经过过滤洗涤，得到柠檬酸钙固温、过滤处理后，进入中和罐，用酸解，并加入活性炭进行脱色；然后，通过带式过滤机体，送入酸解罐，再添加浓缩，酸解过滤液经离子交换处理后，及废炭；进行蒸发、过滤、酸解过滤，除去 再进行结晶；结晶后，用离心机进行固液分离，对得到的湿柠檬酸晶体进行干燥与筛选，最后得到成品柠檬酸。 淀粉筛配 酸
黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺的优化
黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺优化 摘要 柠檬酸（2-羟基丙烷三羧酸），是重要的工业原料。可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进行了相关比较。结果表明：1）摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为0.4%；实罐发酵最适硫酸铵浓度为0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2）实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度更稳定，两者的菌浓度、残糖、PH值变化规律高度一致，酸度变化规律基本一致。另外实验还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进行了探讨，结果表明实罐发酵的最适温度约为35℃，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。 关键词：黑曲霉，柠檬酸，硫酸铵，实罐，摇瓶 Abstract Citric acid(2-hydroxytricarboxylic acid), is an important industrial raw material. It can be extracted from plant materials or be obtained by fermentation of sugar. In this treatise, we studied the different impacts to the fermentations in erlenmeyers and fermenters which were made by the different concentration of the ammonium sulfate. We compared the differences between the fermentation in erlenmeyers and fermenters by analyzing the concentration of the bacteria, the PH during the fermentation process, acidity, residual sugar and the temperature changes during the fermentation process. The results showed that: 1) the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in erlenmeyer is 0.4% while the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in fermenters is 0.5%.when the concentration of ammonium sulfate is too high, the fermentation cannot be succeed for the large number of foam. 2) when the initial sugar content, bacteria concentration and fermentation temperature are under the same circumstances, the fermentation in the erlenmeyer has more stable fermentation temperature. Both the two methods of fermentations have the same variation in the concentration of the bacteria ,residual sugar, PH value and changes of acidity. Another experiment also studied the influence to the fermentation in the fermenter made by temperature. The result showed that the production of citric acid from the fermentation of Aspergillus niger is the highest when the temperature is 35℃,when the temperature is too high , fermentation will fail for the excessive loss of water. Keywords：citric acid, Aspergillus niger, fermentation, erlenmeyer, fermenter, ammonium sulfate 1. 课题背景 1.1柠檬酸简介[1]