蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白前期准备
（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。（3）透析Buffer的选择可参考文献。
蛋白复性
包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤
破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装
40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。
包涵体的溶解
1、对于尿素和盐酸胍的选择：
尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
2、去垢剂：
温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。
包涵体的复性
1复性：
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折
叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。
2复性的效率：
复性是一个非常复杂的过程，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。
4、复性中常采用的方法有：
稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，缺点是易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺
点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。
复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定！
包涵体的复性还要注意以下几点：
1.首先要获得较高纯度的包涵体。
2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。
3.复性前后均要离心
4.复性不能太快.
5.纯化的最佳条件要摸索和结合相关文献。
6.变性蛋白的浓度
浓度不要太高，一般0.4-0.5mg/ml 左右较适宜，若浓度高了，可稀释至适宜浓度。有些蛋白可能更低，此时需要结合文献和实践，确定最佳浓度。要结合透析前后的浓度，如果透析液加入甘油，这需要结合浓缩比（10%甘油可浓缩20%左右）。
复性Buffer的选择
包涵体复性液配方
对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。Tris
系统和PBS系统都没有明确的规定，这些需要你在实验过程中不断试验，确定合适的缓冲系统；复性过程主要是注意以下几个问题：
（1）最适pH值范围为8.0-9.0之间；(有时需要过酸或过碱性)
（2）温度适宜选择4℃；
（3）复性过程蛋白浓度不宜过大；（小于0.5 mg/ml为宜）
（4）复性时间一般为24-36小时；
（5）低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用。
（6）氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG等。常用的氧化方法有：空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。
氧化还原电对（redox）：常采用GSSG/GSH（1:5-1:10），通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如DTT，如：5 mM GSSG/2 mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。
（7）复性过程的添加剂：
1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、0.4-0.6 M L-Arg：促进蛋白溶解，（成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，也可以抑制二聚体的形成。）
3、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%-30%。
4、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。
5、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等（如分子伴侣等）很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。
6、特殊离子：如CaCl2，MgCl2等特殊的金属离子，可参与蛋白质的正确折叠，促进活性的作用。（此时勿加入EDTA。）
例如复性Buffer：
50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM CaCl2，0.4 M L-Arg, 2mM GSH/0.4mM GSSG,10%甘油。
透析buffer：
50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM CaCl2，2mM DTT, 10%甘油。
复性中蛋白析出！
出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈。复性应该采取复性液浓度和pH值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔1个pH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。
（1）蛋白析出最大的可能性：蛋白浓度太高，建议稀释以后再复性；
（2）透析的盐浓度（比如urea）要平缓降低：8M-6M-2M-PBS；
(3）若加变性剂（尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M）；
（4）另外可将甘油浓度增加（范围可在≤30%），且在复性样品中也可加适量甘油；
（5）如果还不行，可以换新的复性缓冲液；
（6）纯度不够！出现纯化的目标蛋白纯度不够时，可以先过分子筛再复性；
带有二硫键蛋白的复性！
如果蛋白中存在两个以上的半胱氨酸，立即形成正确的二硫键是不可能的。随着二硫键的数目增加（分子间与分子内的），可能的组合数目也在剧烈上升（3个二硫键就是15种可能组合，4个对应105，5个对应945等等）。
如果二硫键是正确折叠所必须的话，应该在溶解时加入一种还原性试剂（如1－10mM DTT）。这种还原性试剂能够被复性用二硫化物置换试剂所取代。加入二硫化物置换试剂（如氧化型＋还
原型谷胱甘肽）是为了提供氧化还原作用力。这些试剂同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体。这些二硫键的形成或断裂反应是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这种平衡才会被破坏。这个过程被称作氧化型折叠。
综述改性蛋白质的安全性
综述改性蛋白质的安全性 改性方法主要有物理法、化学法、酶法、生物基因工程法等。 1 化学改性 化学改性实质是通过改变蛋白质的结构、静电荷和疏水基团分布，去除抗营养因子，从而改善大豆蛋白的性质。蛋白质的化学改性可分为两大类，一类是蛋白质分子的特定基团与改性试剂以共价键相连接，即化学衍生化反应，另一类则不存在蛋白质与改性试剂之间的共价键，主要包括亲油化、酸、碱处理等。 最常用的食品蛋白质化学改性方法：乙酸酐和琥珀酸酐作为酰化试剂的酰化作用。它们的作用机理是酰化试剂一般与赖氨酸ε-氨基作用，带正电的氨基被一个中性的酰基残基取代。酰化作用的功能：提高蛋白质的溶解度和水合作用和改进蛋白质的乳化性质。酰化蛋白质的特点：较低的等电点、较高的正极电迁移率、较好的起泡能力、较差的泡沫稳定性、结构较无序、电荷推斥、热稳定性高（主要由前两个决定）。决定酰化蛋白质营养质量的因素：蛋白质的种类、改性的程度、所采用的酰化剂。其他改性方法，如化学磷酸化—利用并入的高亲水性的磷酸基，提高蛋白质在水中的溶解度；温和酸处理—增加蛋白质表面的负电荷、导致蛋白质结构的展开、疏水性残基的暴露—具有较好的溶解度、乳化性质、起泡性质。 化学变化的危害方面需要考虑因素有两个①改性蛋白质和它的消化产物的毒性；②使用的化学试剂以及在蛋白质中任何残留物的毒性。 蛋白质的磷酸化作用是无机磷酸(Pi) 与蛋白质上特定的氧原子(Ser 、Thr 、Tyr 的-OH) 或氮原子(Lys 的ε-氨基、His 咪唑环1 ,3 位N、Arg 的胍基末端N) 形成-C-O-Pi 或-C -N -Pi 的酯化反应。 蛋白质的磷酸化改性可通过化学方法或酶法予以实现。化学磷酸化试剂：磷酰氯(POCl3)、磷酸(H3PO4)、P2O5/ H3PO4、三聚磷酸钠(STP)。 用于蛋白质磷酸化的酶称为蛋白激酶. 蛋白激酶家族包括有约1001 种酶. 蛋白激酶能对蛋白质进行磷酸化修饰,是很有潜力和前途的食品蛋白质改性的工具。常用到的蛋白激酶有依赖于CAMP 激活的蛋白激酶(CAMPdPK)，酪蛋白激酶Ⅱ(CK- Ⅱ)。 磷酸化改性后的蛋白中,由于引进了大量的磷酸根基团,从而增加了蛋白质体系的电负性,提高了蛋白质分子之间的静电斥力,使之在食品体系中更易分散,相互排斥,因而提高了溶解度,聚结稳定性,降低了等电点,而且其净负电荷只有在相当低的pH 环境中才会被中和,故其可有效地拓宽在食品中的应用范围。用三聚磷酸钠改性大豆蛋白的实验结果充分验证了这一结论。但用磷酰氯改性蛋白时其蛋白溶解度反而下降,这是因为用磷酰氯作磷酸化试剂会导致蛋白质分子之间发生交联,这些交联键的存在是导致蛋白水溶解性降低的原因。但用磷酰氯改性蛋白可显著提高蛋白的粘度及胶凝性。磷酸化改性蛋白中由于负电荷的引入大大降低了乳化液的表面张力,使之更易形成乳状液滴,同时也增加了液滴之间的斥力,从而更易分散,因此改性蛋白的乳化能力及乳化稳定性都有较大改善。 从毒理学的观点看,因为没有一种生物可以合成磷酸根离子,而磷酸根离子为所有生物代谢所必需,必须由膳食中取得,所以蛋白质的磷酸化改性是一种较实用、有效的方法。 化学改性也存在很多的限制因素：(1)产品安全性，化学衍生化可定向地改变蛋白质的功能特性，然而这一技术在食品方面的应用却很少，毒性(或安全性)
彩虹130广谱蛋白marker说明书
彩虹130广谱蛋白marker说明书 货号：PR1950 规格：20T(100μL)/50T(250μL)/100T(250μL×2)/500T(250μL×10) 保存：-20℃保存，有效期至少2年。 产品特点： ●三色预染，颜色鲜亮，条带整齐，便于观察。 ●用量少，节约成本，仅5ul即可完美呈现（1.5mm，10孔梳）。 ●广谱多带，一支即可满足多种实验需求。 产品简介： 本产品包含9种彩色预染的已知分子量标准蛋白，分子量范围为15kD-130kD，每种蛋白含量约为 0.2-0.4mg/ml。预染marker可以用于直接观察蛋白质电泳状况以及清晰地判断Western Blot的转膜效果。经SDS-PAGE凝胶电泳或转移到PVDF或NC膜上可得到清晰的9条彩色蛋白条带，其中70kD条带为红色，25kD条带为绿色，其余条带为蓝色。 使用说明： 1.本产品是即用型液体，可直接上样电泳。上样前无需加热，稀释或添加还原剂。 2.上样5ul，SDS-PAGE电泳过程及转膜后可看见清晰的彩虹条带。 3.建议分离胶浓度为15%。 电泳示意图说明： 第1页，共2页
第2页，共2 页注意事项： 1.本产品含有较高浓度甘油，常规-20℃保存为液体状态，可直接使用。若冰箱温度不稳，导致结冰，可 适当分装后置于4℃保存，至少稳定6个月。 2.Marker分离效果与PAGE胶浓度相关，若分离胶浓度低于15%，25kD以下条带不易分离，但不影响绿色 （25KD）及以上条带。如果目的条带小于25KD，建议分离胶浓度大于或等于15%。 3.转膜效果与转膜时间有关，需根据客户目的条带大小而定，如果转膜后较大分子量条带有部分未转膜 成功，属于正常现象。
蛋白质的生物和化学改性
文章编号:1003 7969(2000)06 0181 05 蛋白质的生物和化学改性 周瑞宝1,周 兵2 (1 郑州工程学院食品科学与工程系,450052郑州市嵩山南路140号; 2 郑州油脂化学集团公司,450053郑州市黄河路;第一作者:男,59岁,教授) 摘要:生物酶或化学法改性食品蛋白质,是提高食品功能特性的重要途径。生物酶有酶源易于得到,应用更安全,并且可将蛋白质改性到所期望的功能值;化学法的乙酰化、磷酸化、糖基化、交联反应,在改变结构和功能性方面,对提高蛋白质功能特性比酶法更有效。 关键词:蛋白质;生物酶;化学法;改性 中图分类号:TQ645 9+9 文献标识码:A 1 蛋白质的酶法改性 蛋白质的改性就是用化学因素(如化学试剂、酶制剂等)或物理因素(如热、高频电场、射线、机械振荡等),使氨基酸残基和多钛链发生某种变化,引起蛋白大分子空间结构和理化性质改变,从而获得较好的功能性和营养特性。 用于水解大豆蛋白的酶,包括植物来源的木瓜酶(Papain)、微生物蛋白酶(Alcalase、Neutrase、Ther mitase)和动物蛋白酶(Pepsin、Chymotrypsin)等,都可以用于蛋白质的改性。 1 1 大豆蛋白的部分水解及其功能特性 大量文献列举了蛋白质水解对功能特性的影响,其中包括:植物蛋白的大豆蛋白[1]、蚕豆蛋白、小麦谷朊粉、玉米蛋白、燕麦粉(蛋白)、棉籽蛋白、葵花籽和菜籽蛋白;以及动物蛋白的酪蛋白,都可以进行蛋白酶水解,又称蛋白生物酶改性。 大豆蛋白酶改性[2],对于提高蛋白质的溶解性具有特殊重要性,甚至对于在水中难于分散的谷类蛋白,也是如此。只有使蛋白水解之后,才能显示它的改性意义。玉米蛋白是一种玉米储存蛋白,在pH2~5,具有很高的不溶性,当用胰蛋白酶处理水解使1 9%的肽键断裂时,在同样的pH范围内,溶解度可达30%~50%。而小麦谷朊粉用此法处理,在pH7时,达到9 8%水解度(D H)时,溶解度从7%增加到50%。燕麦粉经Alcalase 或Neutrase酶处理,在等电点(pH5.0)条件下溶解度提高3~4倍[3]。在一定的酶与底物比例条件下,增加水解度(3 8%~ 10 4%),溶解度也同时增加。用Alcalase在pH8,或Neutrase在pH7条件下,使大豆分离蛋白进行有限的蛋白酶水解,会改变它的pH值与溶解曲线图。用Thermitase酶处理蚕豆分离蛋白,使水解度达到8 3%时,在等电的pH值下,溶解度增加高达40%。用Ttaphyloc occus aureus V8蛋白酶水解酪蛋白,水解度达到2%和6 7%时,溶解度增加25%和50%。 大豆蛋白生物改性,可以提高水解蛋白的吸水和结合水的能力。这是由于蛋白水解过程中释放出氨基和羧基,离子基团数量增加。甚至大豆分离蛋白在84%的相对湿度的室温下,其吸水性随酶处理程度成比例增加。酸 沉大豆蛋白和11S大豆球蛋白,用菠萝蛋白酶进行有限蛋白水解后,吸水能力增加2~2 5倍。运用Alcalase或Teutrase处理燕麦粉,随水解度(DH)的升高,吸水能力增加。大豆蛋白质酶改性对蛋白质的乳化能力很敏感。使用木瓜蛋白酶对大豆蛋白进行短时水解,会增加乳化能力,然而,当继续水解时,乳化能力减少。有人发现大豆分离蛋白在水解度(DH)为5%时,乳化特性最佳。蛋白酶改性,也能改善花生蛋白的乳化特性。 用胰蛋白酶部分水解由大豆和蚕豆得到的11S 球蛋白,其中高分子量的水解产物大豆球蛋白 T 和豆球蛋白 T,分别对乳化能力和乳化稳定性,起着关键作用。随着豆蛋白 T的生成,其乳化能力和乳化稳定性增加,当豆蛋白 T被胰酶进一步水解时,乳化能力和乳化稳定性降低。 蛋白酶部分水解时,乳化能力和乳化稳定性的有益作用可能是由于暴露了分子内部掩蔽的疏水基团,改善亲水 疏水平衡,从而提高乳化能力。蛋白质表面失去亲水肽,导致表面疏水作用增加,而有利于表面吸附。过度消化的不利影响,使其失去球状 收稿日期:2000 09 15
包涵体的纯化和复性总结
板块一、大肠杆菌 （这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。） 一、关于菌体的量 大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。 二、关于是否包涵体表达 包涵体的定义我就不讲了。我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。看着没问题，实际上是有毛病的。关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？ 说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。
甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。 我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。 三、关于表达量 我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。我要说都是文章的作者在忽悠。不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。如用：很低、较低、中等、较高、很高等来描述。 有一个指标与表达量密切相关，那就是单位体积的菌体量。两者的乘积才是单位体积发酵液的目标蛋白产率。 与表达量相关的指标还有纯化倍数、纯化收率等，这些指标我们也常常在发表的文章中看到。同样，我也认为都是不准确的。除非你用的是活性测定的方法，用蛋白活性收率来表征。 纯化工艺的难易有时候也与表达量相关，表达量高时往往纯化也方便的多。所以，尽量提高你的目标蛋白表达量不只是基因工程上游和产量的问题，还是纯化工艺开发的问题。 四、菌体破碎
蛋白质复性方法
包涵体表达的蛋白的复性 摘要综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。 关键词包涵体蛋白质复性 Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules. Key words inclusion body , protein , renaturation 外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体： 包涵体的定义、组成与特性： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为，具有很高的密度（约ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR 等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1] 包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以
蛋白质改性研究与应用进度
蛋白质改性研究与应用进度 宋英皓江南大学食品与科学学院 摘要:介绍蛋白质的功能特性,以及物理、化学、摘要介绍蛋白质的功能特性, 以及物理、化学、酶法等各种改性方法及其对蛋白质功能特性和营养安全性的影响,展望蛋白质改性的应用前景. Abstract Various protein modification methods including physical chemical，enzymatic methods and the effect of modification to its functional properties Nutritional value and safety were studied. The prospect application was also predicted. Keyword Functional properties Modification Nutritional value Safety Application 蛋白质具有营养功能,添加到食品中可以有效地提高产品的营养价值,更重要的是蛋白质在食品中可以体现出不同的功能特性,影响食品的感官特性,而且对食品在制造、加工或保藏中的物理化学性质起着重要的作用。因此蛋白质广泛用于食品加工的各个领域。但是,不少天然蛋白质的这些特性尚不突出,不能满足现代食品开发与加工的需要,往往通过特定的方法来提高其功能特性,使其应用领域更广阔。 1蛋白质的功能特性 蛋白质的功能性质主要分三类:(l)水化性质,包括水吸收及保留、湿润性、溶胀、粘着性、分散性、溶解度和粘度。由蛋白质肤链骨架上的极性基团与水分子发生水化作用。(2)与蛋白质一蛋白质相互作用有关的性质,包括产生沉淀作用、凝胶作用和形成各种其它结构(如蛋白质面团和纤维)。蛋白质分子受热舒展,内部的疏水基团暴露出来,通过疏水作用(高温能提高此类作用)、静电作用(通过ca,·和其它二价离子桥接的)、氢键(冷却能提高此类作用)或二硫交联形 成空间网状结构。(3)表面活性,包括表面张力、乳化作用和泡沫特征。蛋白质结构中既有亲水基又有亲油基,能够吸附在油一水或空气一水界面上,一旦被界面吸附,蛋白质 形成一层膜,可阻止小液滴或气泡聚集,有 助于稳定乳化液和气泡。这些功能特性 在食品中常被应用。蛋白质的功能特性与其结构有关,即氨基酸组成、排列顺序、构象、分子的形状和大小、电荷分布以及分子内和分子间键的作用。高比例的极性残基影响肤链间相互作用、水化作用、溶解性和表面活性,疏水性相互作用在蛋白质三级折叠中相当重要,它影响乳化作用、起泡性和风味结合能力。带电氨基酸能增强静力相互作用,起到稳定球蛋白,结合水分的作用,以及水 化作用、溶解度、凝胶作用和表面活性。琉基(SH)能被氧化形成二硫键,硫醇和二硫化物的相互转化会影响流变性。共价键和非共价键的性质和数量决定了蛋白质的大小、形状、表面电荷“,。所有这些性质又受PH、温度等环境因素及加工处理的影响。 2蛋白质改性 2.1物理改性 改变蛋白质功能特性的物理方法有机械处理、挤压、冷冻等。蛋白质粉末或浓缩物彻底干磨后会产生小粒子和大表面的粉末,与未研磨的试样相比,水吸收、蛋白质的溶解度、脂肪吸收和起泡性质都得到了改进;在乳的均质过程中,蛋白质悬浊液受到强烈剪切力使蛋白质聚集体(胶束)碎裂成亚基, 从而提高蛋白质的乳化能力川。挤压处理时蛋白质在高温高压下受定向力的作用而定 向排烈压力的释放,水分的瞬时蒸发,形成 具有耐嚼性和良好口感的纤维状蛋白质。将蛋白质溶液以一定速率冷却,会产生垂直于冷却表面的冰晶,使蛋白质定向排列并在冰晶空隙中被浓缩,移去水分可得到结构完整的蛋白质。 2.2化学改性 2.2.1酸、碱、盐作用下的改性 蛋白质经酸、碱部分水解可改进其功能特性,如溶解性、乳化能力、起泡性等,并能钝化酶活力,破坏毒素、酶抑制剂和过敏原,但往往会造成营养价值下降。P-乳球蛋白和乳清蛋白在酸性或微碱性中热展开,提高了它的增稠、凝胶、起泡和乳化性质。在适当pH
彩虹245广谱蛋白marker使用说明
彩虹245广谱蛋白marker使用说明 货号：PR1920 规格：20T(100μ1)/50T(250μ1)/100T(250μ1×2)/500T(250μ1×10) 保存：-20℃保存，有效期至少2年。 产品特点： ●三色预染，颜色鲜亮，条带整齐，便于观察。 ●稳定性能突出，经检测4℃放置两年无明显降解。 ●用量少，节约成本，仅5ul即可完美呈现（1.5mm，10孔梳）。 ●广谱多带，一支即可满足多种实验需求。 产品简介： 彩虹245广谱蛋白marker包含12种彩色预染的已知分子量标准蛋白，分子量范围为 11kD-245kD，每种蛋白含量约为0.2-0.4mg/ml。预染marker可以用于直接观察蛋白质电泳状况以及清晰地判断Western Blot的转膜效果。经SDS-PAGE凝胶电泳或转移到PVDF或NC膜上可得到清晰的12条彩色蛋白条带，其中25kD为绿色条带，75kD为红色条带，其余10条是蓝色条带。 使用说明： 1.彩虹245广谱蛋白marker是即用型液体，可直接上样电泳。上样前无需加热，稀释或添加还原剂。 2.上样5ul，SDS-PAGE电泳过程及转膜后可看见清晰的彩虹条带。 3.建议分离胶浓度为15%。 电泳示意图说明：
彩虹245广谱蛋白marker经15%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至PVDF膜上。 注意事项： 1，本产品含有较高浓度甘油，常规-20℃保存为液体状态，可直接使用。若冰箱温度不稳，导致结冰，可适当分装后置于4℃保存，至少稳定6个月。 2，Marker分离效果与PAGE胶浓度相关，若分离胶浓度低于15%，25kD以下条带不易分离，但不影响绿色（25KD）及以上条带。如果目的条带小于25KD，建议分离胶浓度大于或等于15%。3，转膜效果与转膜时间有关，需根据客户目的条带大小而定，如果转膜后较大分子量条带有部分未转膜成功，属于正常现象。 相关试剂： P10154×蛋白上样缓冲液（含DTT） P1300-1SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 D106010×电泳转移缓冲液 PR1910彩虹180广谱蛋白marker
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体的纯化和复性总结 二、包涵体的洗涤? 1、包涵体的洗涤问题? 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。? 包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。 此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。? 2、如何得到比较纯的包涵体? 对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。 包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50?mM?NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3?mM。去垢剂如Triton?X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。? 对于尿素和盐酸胍的选择： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。? 包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。? 8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实
蛋白质介绍
[本次授课内容] 第6章蛋白质 6.4食品加工贮藏中蛋白质的变化与蛋白质的改性 ＃ 6.5食品蛋白质含量的测定 重点：加工对营养及功能特性的影响、改善营养及功能特性的方法 6.4 食品加工贮藏中蛋白质的变化 6.4.1 食品加工贮藏中蛋白质的变化 6.4.1.1 热处理中的变化 热处理是许多食品，尤其是蛋白食品的加工常用的杀菌方法，也是一些食品加工中所必须的工艺步骤。多数食品蛋白质只能在窄狭的温度范围内（60-90℃，1h或更短时间）才具有生物活性或功能性。 ○加热对蛋白质理化性质的直接影响：蛋白质结构变得松散、某些次级键的断裂、变性失活等。而加热的程度（温度、时间）及其它因素的协同作用、蛋白质的种类等又是蛋白质变性程度的决定因素，其中有些变化有利于营养、功能特性的提高，另一些变化则属于劣变。 （1）有利变化始终保持适度热处理，既不会破坏共价键也不至于形成新的共价键，不影响蛋白质的一级结构。从营养学的观点讲，蛋白质对温和热处理所产生的变化一般是有利的。 ①大多数蛋白质在加热后营养价值得到提高。因为适宜的加热使蛋白质变性后，原有的紧密结构变得松散、伸展，进入人体易为消化酶所水解，从而提高消化率，营养价值也相应提高。 ②某些植物蛋白所含的抗营养因子－蛋白酶抑制剂（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）、凝集素（致血红细胞凝集）等在加热中被钝化失活。从而提高蛋白质食品的安全性和营养价值，如豆科植物蛋白的热加工处理。 ③热处理是常用的杀菌方法。微生物的机体蛋白因热处理变性失活，达到杀菌目的，可防止微生物引起的食品腐败变质。 33
34 ④ 热处理还可钝化食品中存在的某些可能引起食品的色泽、质地、风味等发生非需宜改变的酶。如，酶促褐变、引起豆腥味的LOX ），从而保持良好的风味及外观品质。 （2）不利变化 A 、过度加热会导致氨基酸特别是必需氨基酸（蛋与胱、赖AA ）的损失。因蛋白质因热分解或聚合致使营养价值下降。 ① 脱硫：T-115℃～27h ，某些AA 残基（胱氨酸与蛋氨酸——含硫EAA ），会有一半以上的 胱氨酸发生脱硫化氢反应。既损害营养，也引起功能性质的改变； ② 脱酰胺：T>100℃，蛋白质中Gln ，Asn 残基脱除酰胺基-NH 2。尽管不损害营养，但环境 中-NH 2会导致蛋白质电荷和功能性质的改变； ③ 异构化：T>200℃，色氨酸发生异构化，生成环状衍生物。其中包括致突变物质，某些氨 基酸由L-型转变为D-型而失去营养价值，甚至具有毒性； ④ 交联反应：T>150℃，蛋白质中赖氨酸的ε－NH 2参与形成新的肽键-交联肽键。如Lys 与 Asp 、Glu 反应，失去赖氨酸的营养价值，新生成的肽链可能对人体有毒； NH CH CO (CH 2)4NH CO (CH )22CH CO ε-N （γ-谷氨酰基）-L-赖氨酰基 ⑤ 羰氨反应：当还原糖存在时，在普通条件下即可发生的羰氨反应，因加热可加速进行。色、 精、苏、组等均易发生，Lys 中ε－NH 2更易发生该反应，形成不易为酶消化水解的希夫碱，失去EAA 的营养价值并同时导致外观褐变，遇有蔗糖水解、脂肪氧化产物均可提供羰基发生该反应；当然，同时可对面粉焙烤食品起到需宜性的呈色效果。 ⑥ 热分解：T>200℃以上时（如烧烤食品表面温度），蛋白质发生热分解。可能产生诱变化合CH 3 2NH N N N N CH 3N N CH 3NH 23CH CH 32NH N N N
PH0302-超低分子量蛋白Marker II (3.4-100kD)使用手册
PH0302|超低分子量蛋白Marker II(3.4-100kD) Ultra Low Molecular Weight Protein Marker 货号：PH0302规格：?10T（50ul）保存：Store@-20℃ ◆产品简介 本产品包含5种多肽和3种低分子量蛋白质组成，分子量范围为3.4kD-100kD。可以用来判断SDS-PAGE上多肽和小蛋白的分子量。 ◆使用说明 第一次收到该产品，室温融化后，彻底混匀，离心快甩将溶液完全收集到管底，根据需要适量分装成小管，-20℃贮存，每次取一小管使用；本产品为即用型，融化后既能使用，不能95℃加热处理。 一.制胶： I配制分离胶 1．按照表一将不同体积的双蒸水、40%PAA（19:1）、凝胶缓冲液和乙二醇加入到小烧杯中混合。 2．加入10%APS和TEMED，立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。 3．在凝胶模具中迅速灌入适量分离胶溶液，然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3cm的水层，使凝胶表面保持平整。4．静置30-60分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。 表一（一块0.75mm mini胶用量） 分离胶浓缩胶 18％T,5%C/6.0ml5％T,3.3%C/2ml 40%PAA（19:1） 2.7ml/ 40%PAA(29:1)/0.25ml 4×凝胶缓冲液 1.5ml0.5ml 乙二醇（电泳级） 1.8ml/ ddH2O/ 1.25ml 10％APS50-65μl20μl TEMED6μl2μl 注：如非必须，不要使用1.0mm和1.5mm的凝胶，尽量使用厚度0.75mm的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。 II配制浓缩胶 去除覆盖在分离胶上的水层，用滤纸将残留的水吸去。 1．按照表一将不同体积的双蒸水、40%PAA（29:1）和凝胶缓冲液加入到小烧杯中混合。
包涵体复性注意事项和常见问题解析
活性蛋白整体方案包涵体复性注意事项和常见问题解析 包涵体复性注意事项 1)最适pH值范围为8.0-9.0之间； 2)温度适宜选择4℃； 3)复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL； 4)复性时间一般为24-36小时； 5)低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在 非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解； 6)首先要获得较高纯度的包涵体； 7)包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施； 8)透析前后均要离心； 9)包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100； 10)包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性； 11)复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h； 12)复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定 13)TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。用Triton洗涤有些包涵体 效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。 14)复性时的蛋白浓度一般为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白 在低浓度时不稳定，很容易变性。 包涵体复性常见问题分析 包涵体复性原则 低浓度，平缓梯度，低温。n(O5~0q8D; 怎样洗涤包涵体？ 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。 对于尿素和盐酸胍该怎么选择 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度
次高分子量蛋白质 Marker (43kD-200kD)使用说明
次高分子量蛋白质Marker(43kD-200kD)使用说明 货号：PR1500 规格：10T 保存：-20℃可保存至少六个月。避免反复冻融，建议分装保存。 产品简介： 次高分子量蛋白质Marker包含5种蛋白质混合物，分子量范围为43kD-200kD，每种蛋白的含量约为20ug。经SDS-PAGE电泳，用考马斯亮蓝染色后可以得到分布均匀密度相近的5条带。可以用来判断SDS-PAGE电泳后蛋白质的分子量。 本产品配有一支蛋白上样缓冲液（150ul）。 使用说明： 将两支试剂开启，取110ul蛋白上样缓冲液加入蛋白Marker干粉中，混匀，取出液体，置于 1.5ml离心管中，100℃沸水浴加热5分钟，冷却后根据需要分装成小管，建议每管分装10μl，-20℃贮存，每次取一管使用。 注：如长期贮存后使用，使用前最好取分装后的小管99℃预热3分钟后再上样电泳。 用考马斯亮蓝G-250染色后可见5条蛋白带（见下示意图）。
注意事项： 1.建议分离胶浓度7%，浓缩胶浓度4%，制胶时先配制分离胶，聚合后再配制浓缩胶。电泳时，80v电压大约跑1小时后，待指示剂沿到达分离胶上沿时，将电压调至120v，直到电泳结束。整个电泳过程大约需3-4个小时。 2.电泳之后可将胶进行染色观察，如果使用配方进行染色时效果不好或考虑其毒性，可以选择考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液，具有染色快，无毒，灵敏性高等特点，是常规染色液的替代品。 相关试剂： P10154×蛋白上样缓冲液（含DTT） T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 P1300-1SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 P1300-500考马斯亮蓝快速染色液
蛋白质的改性论文
蛋白质的改性 摘要：介绍蛋白质的功能特性，以及物理、化学、摘要介绍蛋白质的功能特性，以及物理、化学、酶法等各种改性方法及其对蛋白质功能特性和营养安全性的影响，展望蛋白质改性的应用前景。 0 前言 蛋白质具有营养功能，添加到食品中可以有效地提高产品的营养价值，更重要的是蛋白质在食品中可以体现出不同的功能特性，影响食品的感官特性，而且对食品在制造、加工或保藏中的物理化学性质起着重要的作用。因此蛋白质广泛用于食品加工的各个领域。但是，不少天然蛋白质的这些特性尚不突出，不能满足现代食品开发与加工的需要，往往通过特定的方法来提高其功能特性，使其应用领域更广阔。 1 蛋白质的功能特性 蛋白质的功能性质主要分三类: (l)水化性质，包括水吸收及保留、湿润性、溶胀、粘着性、分散性、溶解度和粘度。由蛋白质肤链骨架上的极性基团与水分子发生水化作用。 (2)与蛋白质一蛋白质相互作用有关的性质，包括产生沉淀作用、凝胶作用和形成各种其它结构(如蛋白质面团和纤维)。蛋白质分子受热舒展，内部的疏水基团暴露出来，通过疏水作用(高温能提高此类作用)、静电作用(通过ca和其它二价离子桥接的)、氢键(冷却能提高此类作用)或二硫交联形成空间网状结构。 (3)表面活性，包括表面张力、乳化作用和泡沫特征。蛋白质结构中既有亲水基又有亲油基，能够吸附在油一水或空气一水界面上，一旦被界面吸附，蛋白质形成一层膜，可阻止小液滴或气泡聚集，有助于稳定乳化液和气泡。这些功能特性在食品中常被应用。 (4)蛋白质的功能特性与其结构有关，即氨基酸组成、排列顺序、构象、分子的形状和大小、电荷分布以及分子内和分子间键的作用。高比例的极性残基影响肤链间相互作用、水化作用、溶解性和表面活性，疏水性相互作用在蛋白质三级折叠中相当重要，它影响乳化作用、起泡性和风味结合能力。带电氨基酸能增强静力相互作用，起到稳定球蛋白，结合水分的作用，以及水化作用、溶解度、凝胶作用和表面活性。琉基(SH)能被氧化形成二硫键，硫醇和二硫化物的相互转化会影响流变性。共价键和非共价键的性质和数量决定了蛋白质的大小、形状、表面电荷。所有这些性质又受PH、温度等环境因素及加工处理的影响。 2蛋白质改性 2.1物理改性 所谓蛋白质物理改性是指利用热、机械振荡、电磁场、射线等物理作用形式改变蛋白质的高级结构和分子间的聚集方式, 一般不涉及蛋白质的一级结构。如蒸煮、搅打等均属于物理改性技术。
蛋白标准品(Marker)知识汇总
蛋白Marker可分为：一、未预染的Marker即宽分子量蛋白标准、高分子量蛋白标准以及低分子量蛋白标准;二、预染的Marker即单色预染和多色预染。 在western blot 过程中，分子量Marker就像个螺丝钉一样没虽然是个小细节，然而就是这样一个小细节对实验结果有着不可忽视的作用。这个Western Blot 参照家族的一员的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用，所以选择正确的蛋白Marker也是western blot实验成功的必要条件之一。 总体来说，蛋白分子量标准可以分成未染蛋白分子量标准、预染蛋白分子量标准二个级别。以下是关于蛋白分子量标准的小叙： 一. 未染色(pre mixed)蛋白分子量标准 未染色的蛋白分子量标准是最简单，也是最准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精确判断蛋白大小必须的。现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指示，因为混合的条带越多，越不好记，谁知道哪条是那条!数到眼都花了。所以当看到特别浓的那几条标志带就记得是哪里了。不过要记得，小带通常都不那么容易看清楚的。在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。如果你的蛋白不幸在两条跨度较大Marker条带之间，选别的Marker吧。预混的Marker 使用上不如预染Marker(pre-stained)好用，因为电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色才―开蛊‖，无法对实验起预示参照作用。完全属于―后知后觉‖型的，当然还是比―不知不觉‖不做对照的要好。 ①宽分子量蛋白标准
蛋白质、包涵体复性
目录 一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用 二、包涵体变复性 三、包涵体洗涤纯化——7~10 四、包涵体提出、纯化和复性
一、
二、包涵体变复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。 基本信息 中文名称 包涵体变复性 复性方法 稀释复性 原因 基因工程菌的表达产率过高 包涵体变性 破菌洗涤溶解 目录 1包涵体 2包涵体变性 3包涵体复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。 包涵体的形成原因 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
包涵体复性(课堂参照)
我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么 处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧! 我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么 处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧! 首先，可以再多加一点透析液看看能否将之溶掉，这样可以减少由于免疫共沉淀的原因而与杂质一起沉淀的蛋白。 再次如果你的蛋白已经复性，并且能很好的溶解的话，那么沉淀要么是杂质，要么是不能复性的蛋白，我认为可以离心去除。 出现絮状沉淀是很正常的现象，因为透析本身就是一个复性的过程，那些出现絮状的沉淀就是一些不能够复性成为天然结构的一些目的蛋白和一些杂蛋白，而这些都是我们所不需要的。所以说出现絮状沉淀是正常的也是我们希望看到的。 至于出现沉淀的原因不外乎条件变化太剧烈了，建议不要让透析的条件变化太剧烈了，主要是PH的浓度的变化和样品中一些其他东西如尿素的浓度变化。 如果楼主透析样品中出现太多的沉淀，甚至于跑胶中基本没有带了，那么建议楼主换一种透析液来用，如用TGE也就是传说中的万金油来试试，我一直用的是这种透析液，效果很不错。TGE配法如下： 50mM Tris 0.5mM EDTA 50mM Nacl 5%或10％甘油 如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。 沉淀可以拿来重溶，但是重溶的可行性不大，也就是重新溶解的可能性不大 谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题? 如透析液用TGE的话,一次透析,还是也要分步,要不要调PH或是浓度? 046 wrote: 谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题? 先过柱後复性。 蛋白浓度较低可以浓缩一下，浓缩方法有很多，简单一点的可以用PEG包埋，就是将蛋白
蛋白质变性机理
蛋白质变性机理 1、蛋白质介绍 2、蛋白质变性结果 1)活性丧失 蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只要轻微变化即可引起生物活性的丧失。 2）某些理化性质的改变 蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来, 分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低 蛋白质分子凝聚从溶液中析出
3）生物化学性质的改变 蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。 4）致变因素 引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两类。物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在临床医学上，变性因素常被应用于消毒及灭菌。 反之，注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂。蛋白质的变性很复杂，要判断变性是物理变化还是化学变化，要视是物理变化 加热、紫外线照射、剧烈振荡等物理方法使蛋白质变性，主要是破坏蛋白质分子中的氢键，在变化过程中也没有化学键的断裂和生成，没有新物质生成，因此是物理变化。 否则，鸡蛋煮熟后就不是蛋白质了。而我们知道，熟鸡蛋依然有营养价值，其中的蛋白质反而更易为人体消化系统所分解吸收。 5）复性