第十五章体细胞胚胎发生和人工种子
第十五章体细胞胚胎发生和人工种子
一、愈伤组织与体细胞胚胎发生
愈伤组织原来是指植物受损伤时在愈合伤口处长出的一团瘤状突起，突起内的细胞已发生脱分化的变化。
培养中的愈伤组织是指从外植体的内部或切口表面形成的一团没有分化的均匀一致、无序生长的薄壁细胞团。这种组织具有再分化的能力。
1、愈伤组织的诱导
愈伤组织的形成大致要经过起动期、分裂期和形成期三个阶段。
1）起动期 当外植体已分化的活细胞在外源植物生长物质的作用下，通过脱分化起动而进入分裂时期，进而形成愈伤组织。此期的细胞大小无明显变化，胞内RNA含量迅速明显增加，细胞核变大。
2）分裂期 是指细胞通过一分为二的方式不断增生子细胞的过程。外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始细胞分裂，使细胞脱分化。此期细胞分裂快、结构疏松、缺少组织结构。
3）形成期 是指外植体细胞经过诱导、分裂形成了无序结构的愈伤组织时期。此期细胞大而不规则、高度液泡化、无次生细胞壁和胞间连丝，整个组织结构较松散；表面以下约5~10个细胞是细胞生长的中心，分生中心的细胞明显小些，出现了胞间连丝和果胶质，这些中心是愈伤组织的主要生长部位。
2、愈伤组织器官的发生
愈伤组织在某些条件下可以通过器官发生的再分化途径产生不定芽和根或胚状体，然后再发育成苗或完整的小植株。
A 不定芽方式
不定芽方式是指愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株。这是愈伤组织培养中常见的器官发生方式。愈伤组织通过不定芽方式再分化形成再生植株的方式主要有四种。
愈伤组织上分别形成无根的芽或无芽的根；
愈伤组织上先形成芽，待芽伸长后再在其茎的基部形成根；
愈伤组织上先形成根，再在根基部分化形成芽；
先愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后两者接形成植株。
B 胚状体形成的方式
胚状体形成是指从培养的组织或细胞中直接或间接形成胚胎的生长方式。直接形成胚胎是指在外植体上直接分化出胚状体；间接形成胚是指在外植体上先分化出胚性愈伤组织，然后由胚性愈伤组织再分化形成胚状体。
二、人工种子
人工种子是指植物离体培养产生的体细胞胚包埋在含有营养成分和保护功能的物质中，在适宜条件下发芽出苗。人工种子包括：
1）体细胞胚 是最里面一层；
2）人工胚乳 是中间层，含有培养物（即胚状体）所需的营养成分和某些植物激素；
3）人工种皮 是最外一层为有机的薄膜包裹，以
保护水分免于丧失和防止外部物理力量的冲击。
图15.3 人工种子的结构
1 、人工种子的制备
A、体细胞胚的制备
体细胞胚的发生方式
体细胞胚胎（胚状体）可由表皮细胞、愈伤组织、悬浮细胞、花粉、原生质体等发生：
1） 来源于外植体的表皮细胞，如石龙芮、刺五加、芹菜等；
2） 来源于愈伤组织细胞，如玉米、西洋参桃等；
3）悬浮培养中由单细胞来源的胚状体，如胡萝卜、芹菜等；
4）由花药花粉培养产生的单倍体胚状体，如曼陀罗、烟草、青椒等；
5）来源于原生质体的胚状体，如玉米、黄瓜。
体细胞胚胎发生的同步控制
在培养中体细胞胚胎的发生一般是不同步的。控制胚状体的同步发育是人工种子的重要条件。
现在常用以下几种方法对体细胞胚的发生进行同步控制。
1）同步脱分化促进细胞的同步分裂 细胞培养初期加入DNA合成抑制剂（如五氨基脲嘧啶），使细胞DNA合成暂时停止。一旦除去DNA抑制剂，细胞开始进入同步分裂。
2）不同的温度处理 低温处理抑制细胞分裂，然后再把温度提高到正常培养温度，也能使胚性细胞达到同步分裂的目的。
3）利用渗透压控制胚的同步生长 不同发育阶段的胚具有不同的渗透压要求。可用调节渗透压的方法来控制胚的发育，使其停留在某一阶段，然后同步发育。
4）分离过筛 用不同孔径的尼龙网过滤或者采用密度离心法来选择不同发育阶段的胚，然后再转入适宜它们发育的培养基上，使幼胚继续发育。
5）在悬浮培养中控制通气 乙烯的产生与细胞分裂有着密切关系。在细胞分裂达到高峰前，有一个乙烯合成高峰。
B、人工种皮的制备
用于人工种皮的材料
人工种皮需要满足下列要求：
1）一定得透气性，不能影响胚状体的呼吸；
2）一定的硬度；
3）播种后易于降解；
4）含有其他有利于胚状体存活、生长的成分，对特殊植物还需加入共生微生物以利共生发芽。
体细胞胚包裹的材料
许多凝胶可以作为体细胞胚的包裹材料，如琼脂、琼脂糖、藻酸盐-明胶、淀粉、动物胶、角叉胶等。
人工种子包裹方法
1）干燥包埋法 将胚状体置于23℃，相对湿度为79%，在黑暗条件下逐渐干燥，然后用聚氧乙烯包裹后贮藏。干燥包埋的体细胞有3%存活下来并发芽生长。
2）凝胶包埋法 将胚状体悬浮在一种黏滞的流体胶中，直接播入土壤。
3）水凝胶法 用褐藻酸钙水性胶囊包埋胚状体，用以生产人工单胚种子称为水凝胶法。
C、人工胚乳的制备
人工胚乳的成分
人工胚乳的基本成分仍是各种培养基的成分，只是根据使用者的目的，可以自
由地向人工胚乳基质中加入各种不同物质，赋予人工种子比自然种子更加优越的特性。
人工胚乳的制作
1）直接法
凝胶囊中直接加入大量元素、碳水化合物及防病用抗生素。
2）微型包裹法
首先将碳水化合物和大量元素包裹在微型胶囊内，然后再把微型胶囊和种胚一起包裹在褐藻酸钙（人工种子）中。目的是使人工胚乳的营养成分在人工种子内缓慢地释放，提高种子的存活时间。
2、人工种子的研究现状
人工种子具备了组培试管苗的全部优点，具有巨大的应用潜力：
1）便于运输；
2）真正达到了快速繁殖的要求；
3）处理后，可抵抗外来病毒和微生物的侵袭；
4）对生育周期长的多年生植物、育性不良的且难于有性繁殖的植物可用人工种子技术进行繁殖；
5）不受季节限制；
6）具有坚硬的种皮，也适于机械化播种。