红曲霉中麦角固醇的培养条件优化——无机盐

红曲霉中麦角固醇的培养条件优化——无机盐

摘要

红曲霉(monascus)是我国最早应用于食品加工的有益真菌之一，主要集中应用在传统酒曲、制醋、着色、防腐等领域，国外红曲霉主要应用于肉品加工及其他食品着色方面。红曲霉可产生淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、酯化酶、果胶酯酶、麦芽糖酶等酶类；其药理活性物质可抑制胆固醇活性、降血压物质——麦角固醇。

目前麦角固醇的生产主要采用微生物发酵法，关于碳源、氮源、初始pH值、培养时间、通气量等因素对细胞中麦角固醇的含量研究，有很多人在这方面进行了深入而透彻的研究。而无机盐对红曲霉菌产麦角固醇的影响国内外尚未见过报道（就目前而言；仅有惠丰立等人的《无机盐对酵母菌产麦角固醇的影响》[13]一文的发表。本文在原有工作的基础上，扩大了无机盐对红曲霉菌产麦角固醇的影响筛选范围。

其主要研究了Ca2+、Mg2+、Fe2+ 、K+和Na+ 对红曲霉细胞生长及麦角固醇合成的影响。结果表明：这几种无机盐在一定的浓度范围内均能促进或抑制红曲霉细胞生长。提高或降低生物量，对麦角固醇产量的影响明显的差别。当培养基中分别加入一定量的Ca2+、Mg2+、Fe2+ 、K+和Na+ 时，Ca2+、Mg2+刺激麦角固醇合成作用最强，其中Mg2+对麦角固醇单位产量影响最为显著高到21.75mg/g。又当接种量为10mL的种子液，培养温度30 0C 、转速为200r/min摇床培养120h。在此条件下，ZZ红曲霉菌株产麦角固醇单位含量达24.48mg/g 干菌体.麦角固醇总重46.52mg

关键词:红曲霉，麦角固醇（Ergosterol）, 液体发酵，无机源，紫外分光光度法。

ABSTRACT

The monascus is our country most early applies oneof to food processing beneficial fungi, mainly concentrates theapplication in traditional domain and so on liquor tune, systemvinegar, coloration, anticorrosion, the overseas red tune mildewmainly applies to the meat processing and other food colorationaspects. The monascus produces enzyme class and so on amylase,saccharification enzyme, proteinase, esterification enzyme, pectinesterase, maltose; Its pharmacology active material may suppress thecholesterol activeness, fall the blood pressure matter - ergosterol.

At present the ergosterol production mainly uses the microorganismzymotechnics，About the initial pH value, the raise time, passfactor and so on spirit to the cell in the ergosterol contentresearch, had very many people to conduct thorough and the thoroughresearch in this aspect. But the inorganic salt becomes lucky the tunemold domestic and foreign to produce the ergosterol the influence notyet to see the report (in the present case; Only has Huifengliperson "Inorganic salt To produce Ergosterol toSaccharomycetes Influence" [ 13 ] an article publication. This articlein the original work foundation, expanded the inorganic salt to becomelucky the tune mold to produce the ergosterol the influence screeningscope.

This article has mainly studied Ca2+, Mg2+, Fe2+, K+and Na+becomeslucky the tune mildew cell growth and the ergosterol synthesisinfluence. The result indicated that, These kind of inorganic salt canpromote or suppress the red tune mildew cell growth in the certaindensity scope. Enhances or reduces the biomass, to ergosterol outputinfluence obvious difference. When in the culture medium separatelyjoins a quota Ca2+, Mg2+, Fe2+, K+ and Na+, Ca2+, Mg2+ stimulate theergosterol resultant action strongly, Mg2+is most remarkable to theergosterol unit output influence as high as 31.75 m g/g. Vaccinates10% kind of age is the 44h seed fluid, 28 0C 200r/min 摇床raises120h. Under this condition, the ZZ red Qu Mei ergosterol unit contentreaches 24.48 m g/g to do the mycelium .

Key word: The red tune mildew, the ergosterol，theliquid ferments, inorganic source, ultraviolet spectrophotometricmethod.

第一章绪论

1.1引言

红曲霉(Monascus)属于真菌界(Eumycophyta)、子囊菌门(Ascomycetes)、真子囊菌纲(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、红曲菌科(Monascaceae)、红曲霉属(Monascus)[1]。Monascu:是1884年法国学者van Tieghem分离到马铃薯培养基上的两株真菌Monascus ru ber(红色红曲霉)和Monascus mucoroides(毛霉状红曲霉)而建立的属，其字意为单子囊菌。后人发现其名称不确切，因其被子器(子囊壳)内含多个子囊。成熟后，子囊壁解体，子囊抱子就留在被子器中，误认为只有一个子囊，故名为Monascus。我国译名是根据用途而定为红曲霉菌[2]。红曲，是以大米为主要原料，经红曲霉(Monascus spp.)发酵而成的一种米曲，因其色赤红，故又名赤曲。

红曲霉在欧洲一度被视为一种腐败菌，但在东亚地区，红曲霉却是传统食品加工的神奇微生物[3]。作为东方国家的一种重要的“霉”，它在中国被发现和应用，已有上千年的历史，有考证上溯至汉代的[4]。在浩瀚的中国历史书籍中，我们祖先大量记录了红曲在酿酒、发酵食品、食品色素、中药等方面的广泛应用。汉末王集诗赋《七释》有“瓜州红曲，参揉相半，软滑膏润，入口流散”的记载，证明当时己有红曲并用它作红饭或腐乳了。红曲的药用记载，最早当数元代吴瑞撰写的《日用本草》一书:“红曲酿酒，破血行药势，杀山岚瘴气，治打扑伤损。”其后的药书如《饮善正要》、《本草衍义补遗》、《本草备要》、《本草纲目》等都有关于红曲药效的记载。我国近年出版的《中药大辞典》对红曲的功能有长达32字的叙述，将红曲的功能概括为“活血化癖，健脾消食，治产后恶露不净，癖滞腹痛，食积饱胀，赤白下痢及跌打损伤”。现代研究发现红曲霉所代谢的生理活性物质除Monacolin:外，尚有GAI3A、麦角固醇(麦角固醇)、多糖

(polysaccharide),不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid)等，均己引起国内外研究者的极大关注。

红曲霉菌(Monascus spp. )，这一先人留给后世的宝贵菌物资源，在千年之后已成为热门话题，其研究正方兴未艾，其必将成为生物科技的明日之星。

1.2红曲霉的形态特征

1.2.1红曲霉的形态

红曲霉为腐生真菌，其菌丝((hypha)具横隔系多细胞构造，具不规则的分枝，直径直径3～6μm，多核和多油滴，菌丝之间常有网结联合(anastomose)现象。细胞多核，幼时含有颗粒，老后含空泡及油滴(guttulate)。细胞壁光滑，但往往附有结晶的疵状物((crystalline encrustations)。菌丝体不产生与营养菌丝有区别的分生抱子梗，分生抱子着生在菌丝及其分枝顶端，单生或以基式生出，2～6个成链，属于内生型分生抱子(endothallic conidium )，且由上而下逐渐成熟。闭囊壳呈球形，有柄，柄长短不一。壳内多散生10多个子囊，子囊呈球形，含有8个子囊饱子，成熟后子囊壁解体，抱子留在薄壁的闭囊壳内。

1.2.2红曲霉的生活史

红曲霉具有无性世代(asexual generation)和有性世代(sexual generation)。无性生殖时，由菌丝生出分生饱子梗，分生抱子(conidia)着生在菌丝顶端或侧面小梗顶端，单生或以向基(basipetal)方式而形成2～6个成链状排列。分生抱子细胞具有平截的基部(basal truncation)，单细胞(unicellular)，多核((multinuclear)，含油滴倒梨形(obpyriform)或球形((globose)，壁光滑，通常透亮或含色素，可萌发成菌丝。有性生殖时，菌丝顶端或侧枝顶端首先形成一个多核的单细胞雄器(Antherildium)，随后在雄器下面的细胞又以单轴方式生出一个细胞，该细胞就是原始的雌性器官，即产囊器

(Ascogonium)之前身。雌性器官的生长和发育向下推压雄器，使雄器与柄托呈一定角度。这时雌性器官在顶部又产生一横隔膜，分成两个细胞，顶端的细胞为受精丝(trichogyne)，另一细胞即为产囊器(都含几个细胞核)。当受精丝尖端与雄器接触后，接触点的细胞壁解体产生一孔。雄器内的细胞质和核通过受精丝进入产囊器内进行质配，细胞核成对排列。与此同时，在两性器官下面生出许多菌丝将产囊器包围，形成初期的闭囊壳。壳内产囊器膨大，并长出许多产囊丝。每个产囊丝形成许多双核细胞，此时发生核配，经过核配的细胞即子囊母细胞。每个子囊母细胞中的核经3次分裂，形成8个核，每个核发育成一个单核的子囊抱子(ascospore)。子囊母细胞变成子囊，故每个子囊都含8个子囊抱子。这时闭囊壳已发育成熟，子囊壁消解，子囊抱子成堆留在壳内，似乎其中只有一个子囊。闭囊壳破裂后散出子囊抱子，子囊抱子萌发后又形成多核菌丝。

1.2.3 红曲应用的应用及发展前景

1.2.3.1 红曲的应用

由于Monacolin类物质降胆固醇、降血脂功效显著，安全性高，经过十几年的探索和临床研究，以Lovastatin和Mecato:为商品名的Moacolin药物于1987年被美国FDA 批准上市。之后Simvastatin, Pravastatin等多种药品相继上市。Monacolin K作为药物在日本也已投放市场，由于其见效快，服药4-8周后，可使LDL胆固醇降低43--45%[101]得到了消费者的一致认可。我国在1996年到1997年间，北京与成都的两家公司分别推出了“血脂康”与“脂必妥”两种降血脂药物并获得极大成功，其主要作用成分均为Monacolin K。[1.2.3]

我国是红曲的主要生产国，福建省是我国的主要产地。生产的红曲除供应我国及东南亚所需外，均用以生产红曲色素外销日本及欧美各地，出口量较大[5]。另外，北京、上海、广东、浙江、河北等地也有红曲生产，主要是作红曲色素，有的作为功能性食品

的原料。红曲应用广泛，由于人工合成色素逐渐被禁止用于食品，近年天然的红曲色素市场看好，一时涌现了许多家红曲色素厂，最终供大于求，商家竞相降价，有的甚至陪钱来卖或降低质量减少成本，造成红曲市场不景气[6]。此外红曲应用还有红曲酒，红糟制成的红糟肉、红糟鳗、叉烧肉、红糟蛋及红糟饭等传统食品[14]。在福建、浙江、河北等几处见有功能性红曲粉或红曲片生产，但此类保健食品在我国影响力小，所知甚微，销量并不很大。

而日本却有多家食品公司投入大量人力物力进行红曲保健食品的开发。该类产品以其具有多种功效，在日本深受欢迎。每年作为保健食品原料的红曲达100吨，仅原料销售额即达3亿日元，产品种类繁多，包括纯红曲及添加红曲抽提物的胶囊、红曲口服液等。此外，红曲还应用于制酒、醋、酱油、味增、红豆腐乳、肉制品、食品添加剂及饲料。其中添加红曲的香肠及火腿年销售额达40亿日元，红曲清酒年产15000打以上[5]。日本的红曲制品不仅自己销量较大，而且将低价购进的红曲原料制成成品以几倍甚至几十倍的价格出口到亚洲以至北美，获得很大利润。

1.2.3.2 红曲应用的发展前景

如今，红曲色素生产技术在我国已较为成熟，所以红曲色素研究进一步扩展的空间有限。而日木成功的经验说明红曲保健食品在我国会有很大发展潜力。另外，据卫生部统计，1998年我国已有约168. 5万人死于脑血管疾病，125. 4万人死于心脏病，脑血管疾病死亡人数占到总死亡人数的近4086。我国35岁以上人群冠心病的发病率为3%一5% [10]。王晓华对济南287名老知识分子调查表明体重过重和过胖者占44. 20k，高血脂者占54% ,冠心病者为34. 596 [7]。另据哈医大研究结果:健康青少年中存在发生动脉硬化的危险因素，其中单纯性肥胖者为19. 84% ,高血压者为11. 30% ,3一20岁健康人中高脂血症已存在。采取非药物性预防措施可使心脑血管疾病死亡率下降25%～50%[8]，所以说

对于各类疾病本着预防为主的现代化社会，我们非常需要为健康加长，食疗红曲正顺应了这种需求。实际上，国际市场更为广阔。据测定，欧美人的血清胆固醇水平平均为100mg/dl，明显高于动脉粥样硬化性心血管疾病发病率较低的一些农业国家。据统计，美国人每人侮天平均消耗胆固醇1OOOmg,正常应为300mg左右，所以西方高脂血症、冠心病等疾病发病率较高，也可见其市场潜力较大[9].

综上所述，红曲霉发酵物以其降胆固醇、降血压、降血脂、营养丰富等多种显著功效，使用安全，副作用小等多种优势，可制成药物或保健食品，具有极为广阔的市场空间。尤其红曲保健食品的市场容量很大，从现今功能红曲所占的市场份额看，红曲保健食品的市场待进一步开发。

1.3 红曲霉产次级代谢产物—麦角固醇（Ergosterol）

我们发现红曲霉属Monascus中的许多菌株都能不同程度地产生麦角固醇。麦角固醇的含量与色素形成量不成正比，有个别菌株麦角固醇的产生量可占培养物的2%以上。1.3.1麦角固醇的应用及市场前景

、氢化可的松和激素黄麦角固醇是一种重要的医药和农药原料，主要用来生产VD

2

体酮等药物，还可以用来生产芸苔素内酯。VD

可促进人体对钙、磷的吸收和骨骼形成，

2

对防治儿童佝偻病、老年骨质疏松有重要作用，所以麦角固醇有广泛的应用前景。

我国每年抗生素厂产生的青霉素废菌丝体达10万t左右，对环境造成极大的危害。从资源和环境的一体化出发，利用废菌丝体提取麦角固醇技术将发酵工业废菌丝体变废为宝，为VD

的生产提供了新的原料来源，并为我国皮革、电镀行业含重金属离子的废水处

2

理提供了新型、价廉、高效的壳聚糖水处理剂。我国人口众多，儿童佝偻病发病率很高，老年骨质疏松病患者达6000多万人。21世纪，我国进入老年化社会，预防和治疗老年骨质疏松将成为我们的一项重要任务。据美国RDA(Recommended DailyAllowance)推荐，

若成年人摄人lOlg／天VD

2可明显降低老年患骨质疏松病的危险；儿童食用VD

2

400ml／天

(约1O0mg／天)，可防止软骨病和佝偻病的发生。据1995年中国医学会调查，仅儿童和

老年每年对VD

2的正常需求量为数10t。VD

2

作为饲料添加剂，能提高家禽的孵化率和产蛋

率。据统计我国每年食用、药用VD

2年需求量可达100t，若再加上饲料业对VD

2

的需求，

我国VD

2

的年需求量可达200t，若全部用麦角固醇生产，则年需用麦角固醇量约600t[11]。麦角固醇主要存在于植物和一些真菌的质膜上[17]。其中以酵母菌的含量最高，一般为细胞干重的0.03～1.6%[18]但在少数菌种如酿酒酵母、卡尔斯酵母、卵形酵母中其含量可高达7～10%c[19]所以一般都以酵一母作为麦角固醇的生产菌株[20] 发酵法生产麦角固醇在我国起步较晚，工业化生产规模小，大都是从酒精或啤酒生产下脚料及干酵母粉中提取。但麦角固醇含量低，为细胞干重的0.8～2.0g%，故生产成本高。因此.选育高产麦角固醇酵母菌株.对促进我国麦角固醇工业化生产具有非常重大的意义。

目前麦角固醇的生产主要采用微生物发酵法，所用菌种大多为酵母菌。国外对麦角固醇产生菌的菌株选育、合成代谢途径及其发酵条件等进行了比较深入的研究[12]。国内从20世纪50年代开始研究从酵母菌中提取麦角固醇，但普遍存在的问题是菌种麦角固醇含量较低。近年来有关单位对麦角固醇高产菌株选育及其发酵条件进行了研究。红曲霉菌中麦角固醇含量主要取决于菌株的遗传特性和培养条件。现已证明，碳源、氮源、初始pH值、培养时间、通气量等因素对细胞麦角固醇含量均有影响作用，而无机盐对红曲霉菌产麦角固醇的影响就目前国内外还没有报道。本文在原有工作的基础上，探讨了几种无机盐对酵母菌产麦角固醇的影响。此举，对促进我国麦角固醇工业化生产具有非常重大的意义。

1.3.2麦角固醇的结构和理化性质

麦角固醇英文名称为麦角固醇，其化学名称为：22-麦角-5,7,22-三烯-3β-醇，分

子式为C 28H 430H 。麦角固醇是脂溶性维生素D 2的前体，VD 2是一种具有广泛效应的激素载体，

与人体钙、磷的吸收有关，具有明显的抗癌功效[21]。此外有研究认为VD 2可刺激某些植物

根系的生成。由微生物发酵制得麦角固醇，再由麦角固醇经紫外线照射转化成维生素D 2，是维生素D 2的生产重要方法之一。在紫外光的照射下，B 环打开形成维生素D 2，可用于生产保健食品及药品。麦角固醇紫外光转化过程中主要产物的相互关系见图1.1 H 3C H 3C CH 3 CH 3

CH 3 CH 3

H

HO 麦角固醇(Ergostero )

H 3C H 3C CH 3 hv H 3C CH 3 CH 3 CH 3

CH 3 HO CH3 CH 3 Heat hv H 3C CH 3 CH 3 CH 2 HO CH 3 HO hv

维生素D 2

CH 3 HO

H 3C CH 3

CH 3

OH

CH 3 CH 3 速固醇（Tachyster)

H

HO

光固醇（Lumistem)

“图1.1”麦角固醇紫外光转化示意图[9]

麦角固醇主要存在于菌物体内，与动物体内的胆固醇，植物体内的谷甾醇结构十分

相似，如图1.2所示。

“图1.2”麦角固醇、胆固醇及谷甾醇的结构比较[22]

25(水)≥1200，麦角固醇为白色晶体，密度1.04，熔点(Melting Range) 150-1700C , [a]

D

[23]不溶于水，溶于乙醚、氯仿、丙酮，乙醇等有机溶剂。

1.3.3麦角固醇生物合成机理

麦角固醇是真菌细胞膜的重要组成成分，它在确保膜结构的完整性、与膜结合酶的活性、膜的流动性，细胞活力以及物质运输等方面起着重要作用，麦角固醇生物合成途径中的几个关键环节还是杭真菌药物的作用靶位，对其生物合成的研究将为抗真菌药物的筛选及其作用机制的研究提供重要的理论基础[24]。

在麦角固醇合成的代谢途径中（如图1.3)，HMG-COA还原酶是控制麦角固醇合成的限速酶，其活性受终产物麦角固醇强烈的反馈抑制。

2NADP

2NADPH

2

乙酰辅酶羟甲基戊二酰辅酶A二羟甲基戊酸法呢

(HMG-CoA) HMG-CoA还原酶

NADP 反馈抑制

NADPH

2

焦磷酸醋鲨烯羊毛甾醇酵母泌醇麦角固醇

鲨烯合成

3O2 3CO2

“图1.3”麦角固醇的代谢途径[25]

麦角固醇的合成是一个多酶参与的复杂代谢过程,已有不少学者对此进行了系统

研究[26.27]。归纳起来，可分为四个步骤:甲羟戊酸的生物合成;甲羟戊酸转化为角鲨烯;角鲨烯环化形成羊毛甾醇;羊毛甾醇转化为麦角固醉.在此代谢过程中，由羊毛甾醇向麦角固醇的转化存在多条途径.参与此过程的酶的作用顺序还不清楚.研究比较透彻的是转化的第一步，即由羊毛甾醇脱甲基酶催化的羊毛甾醉的氧化脱甲基作用.缺乏此酶的红曲霉菌不能形成麦角固醇，而积累羊毛甾醇，成为麦角固醇营养缺陷型菌株.所以脱甲基酶是红曲细胞生长所必需的.Kalb等利用麦角固醉营养缺陷型突变株及制霉菌素扰性突变株，通过麦角固醇合成前体物的积累，确定了部分酶与基间的对应关系.如能打断该反馈抑制路线，麦角固醇合成的抑制作用可得以解除，从而获得高产量的麦角固醇。应用这一原理，筛选抗固醇结构类似物突变株，可望获得高产麦角固醇菌株。

第二章红曲霉菌株中麦角固醇分析方法的建立

2.1引言

目前，已有人对红曲霉产麦角固醇( Ergosterol)进行了研究[28.29]其中有紫外分光光度法、HPLC、质谱等方法对酵母中的麦角固醇含量进行过测定。而Ergosterol作为红曲霉重要的次级代谢产物之一，是一种重要的医药化工原料，可用于生产维生素D2“可的松”、“激素黄酮体”等重要的医药保健品。因此建立简便、准确、可靠的红曲霉所产次级代谢产物Ergosterol的测定方法，对研究高含量麦角固醇菌株的发酵生产工艺，及研究从菌种中提取麦角固醇的生产工艺具有十分重要的意义。同时也是为本文下一步测定无机源培养基中麦角固醇含量工作建立可靠、准确的方法。

2.2仪器与试剂

2.2.1仪器：TU-1901双紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）、离心机(北京医用离心机厂)，1140-A分光广度计、吸收池等。

2.2.2试剂：麦角固醇标准样品((BR)、无水乙醇(AR)、乙醚(AR)、甲醇KOH(AR)、96%

乙醇(AR)、贵州大学中试基地提供的蒸馏水.

2.3 实验用培养基：

2.3.1 PDA斜面培养基[30]：马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖25g，琼脂20g，水补足1 OOO.mI , pH自然。

2.3.2 菌丝生长培养基(Sabouraud培养基)：葡萄糖20g，麦芽糖5g，蛋白陈lOg，酵母膏5g，琼脂20g水1000m1, pH自然。

2.3.3 抱子活化培养基[31]：蔗糖3%，蛋白胨0.2%, NaN03 0.2%, K2HP04 0.1%, KCl 0.05%, MgS04.7H20 0.05%, FeS04 0.001 % pH 5.0

2.3.4 液体种子培养基[33]：甘油7%，葡萄糖3%，牛肉膏3%，蛋白陈0.8%，硝酸钠0.8%，硫酸镁0.1%，加水至1000m1, pH自然。

2.3.5 固体发酵培养基[32]：取大米40克，放入罐头瓶(400m1)中浸泡12h。所有培养基均在121℃，灭菌30min。

2.4 绘制麦角固醇标准曲线。

2.4.1 实验方法

2..4.1.1紫外分光光度法

麦角固醇标准曲线的绘制：精确称取麦角固醇标准样品5mg(精确至0.0001 g)，用甲醇稀释定容到50mL浓度为0.1 mg/mL做为母液，然后分别吸取1 mL, 2mL 3mL 4mL, 5mL，再用甲醇分别定容到10mL，这时，标准的最终浓度分别为0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 (mg/mL )。

TU-1901双紫外可见分光光度计在波长282nm处，分别测定其吸光度，然后以浓度为横坐标，吸收值为纵坐标，绘制麦角固醇含量的标准曲线。

2.4.1.2样品预处理

准确称取经过滤干燥后的红曲霉液态发酵的菌体，置于250m1圆底回流瓶中，加入40m1KOH和20m1无水乙醇，85-90℃水浴；中回流皂化2.5h后，冷却至室温，经25m1乙醚萃取后，待测

2.4.2结果与讨论

2.4.2.1实验数据及讨论

1、麦角固醇标准曲线的绘制，见表2.1及图2.1。

“表2.1”麦角固醇标准溶液的吸光值

T able 2.1 The 吸光values of ergosterol standard solution

麦角固醇标准溶液浓度(mg/ml) 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05

吸光度E值0.23 0.484 0.657 0.885 1.119

1.2

吸1.0

光0. 8

度0. 6

E 0. 4

0.2

0 0.01 0. 02 0.30 0. 04 0. 05 0. 06 麦角固醇C(mglml)

“图2.1”麦角固醇标准曲线

Fig.2.1 The criterion curve of ergosterol solution

2、用1140-A分光光度计对红曲霉发酵样品中的麦角固醇吸光度与标样吸收值进行比较，结果见表2.2及图2.2 。

“表2.2”1140-A测得不同波长下麦角固醇吸光度

Table 2.2 The absorbency of ergosterol in different wavelengthsby1140-A 波长(nm) 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300

(0.1 mg/ml)麦角

固醇BZ溶液0.333 0.359 0.534 0.659 0.831 0.852 0.998 0.8013 0.583 0.553 0.132 吸光度E

红曲霉液态发

酵菌体中提取0.178 0.146 0.315 0.528 0.711 0.764 0.820 0.732 0.318 0.340 0.070 麦角固醇吸光

度E

1

0. 9

0. 8

0.7

0. 6

0.5

0. 4 (曲线I )

0. 3 (曲线II )

0. 2

0.1

0 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300 305

“图2.2”不同波长下麦角固醇标准溶液(曲线I)与红曲霉

液态发酵菌体中提取麦角固醇的紫外吸收曲线(曲线II)

Fig.2.2 *The UV absorbency curves of ergostero) standard solution and ergosterolin

mycelium by liquid fermentation ofMonascus spp. in different wavelengths

从紫外吸收曲线图可以看出，红曲霉发酵样品中的麦角固醇吸光值和标样的吸光度值一致，其最大吸收峰均在280nm左右。

2.4.2.2紫外分光光度法总结

麦角固醇吸收紫外光的能力很强，在波长282.5nm处有最大的吸收峰[34.35] 。对于红

曲霉的发酵液中麦角固醇含量的测定，若是用提纯方法计算红曲霉菌体中麦角固醇含量。因为在提纯过程中，将在不同程度上给麦角固醇带来不可避免的损失，因此很难定量出红曲霉菌株中麦角固醇的准确含量。为此，本试验根据麦角固醇对紫外吸收较强的特性，红曲霉菌丝体在碱性甲醇溶液中皂化后用乙醚萃取的方法，可直接测得酵母菌体中麦角固醇的含量。

1、红曲霉试样经皂化用乙醚萃取后，吸取过滤后的上层清液于1cm石英比色皿中，于282.5nm(狭缝0.16),定其吸光度E,

2、计算:在红曲霉吸光度—麦角固醇含量标准曲线上查出对应吸光度E的值，根据计算公式，可以计算出红曲霉中麦角固醇的百分含量.

2.4.3 小结

1.红曲霉中麦角固醇的测定方法在国内尚未见过报道，本试验根据试验室的实际情况，采用紫外分光光度计法来测定，方法简便，结果稳定，这在一般工厂中测定是可以接受的.

2.本测定方法的建立，就目前国内尚未建立统一测定方法来说，对生产厂和检测机构尚有参考价值并有现实意义。

3.采用上海试剂二厂提供的试剂级标准麦角固醇样品所作的紫外吸收曲线与红曲霉菌体内麦角固醇紫外吸收曲线完全一致。

第三章红曲霉产麦角固醇液体发酵工艺的研究——无机盐的培养条

件研究

3.1引言

固态和液体培养是红曲的两大生产方式，东方国家往往以固态发酵为传统的

生产方式。但国内20世纪80年代中期就开始采用液体发酵方式生产红曲红色素，

至今已有一定的生产规模。

目前麦角固醇的生产主要采用微生物发酵法，所用菌种大多为酵母菌[12]。国外对麦角固醇产生菌的菌株选育、合成代谢途径及其发酵条件等进行了比较深人的研究[38.41]。国内从20世纪50年代开始研究从酵母菌中提取麦角固醉，但普遍存在的问题是菌种麦角固醉含量较低[39 ,40]。近年来有关单位对麦角固醇高产菌株选育及其发醉条件进行了研究。红曲霉麦角固醉含量主要取决于菌株的遗传特性和培养条件。现已证明，碳源、氮源、初始pH值、培养时间、通气量等因素对细胞麦角固醇含量均有影响作用[12.40]，而无机盐对红曲霉产麦角固醇的影响国内尚未见详细报道。本文在原有工作的基础上，探讨了6种无机盐对红曲霉产麦角固醇的影响。

3.2材料与试剂

3.2.1 红曲霉菌株：

Monascus sp. ZZ：分离自福建省漳州所得到的红曲米；

Monasus rubber. ZK：购自中科院微生物所菌种保藏中心；

Monasus purpureus. GX：来自广西师范大学；

Monasus sp. XM：来自厦门酒厂。

均保存于贵大真菌资源研究所。

3.2.2仪器

GMSX-280手提试压力蒸汽消毒锅北京市水光明医疗仪器厂

TU-1901双紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司

GZX-9140MBE电热恒温干燥箱上海博实业有限公司医疗设备厂

HZQ-F160A型高低温震荡培养箱上海一恒科技有限公司

冰箱广东科龙电器有限公司

D4H4-4781电热恒温培养箱湖北省黄石市医疗器械厂无菌操作台上海锦科学仪器有限公司RE-52A真空旋转蒸发仪上海市亚荣生化仪器厂

电子恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司

3.2.3试剂

NaNO3；AR 重庆州江化学试剂厂

NaH2PO4 AR 天津市化学试剂六厂三分厂K2HPO4 AR 重庆州江化学试剂厂

CaCL2 AR 广东台山化工厂

KH2PO4；AR 北京红星化工厂

FeSO4 AR 重庆州江化学试剂厂

MgSO4；AR 天津市化学试剂六厂三分厂KOH；AR 遵义市高等师专化学试剂厂

无水乙醇；AR 遵义市高等师专化学试剂厂

乙醚；AR 上海试一化学试剂有限公司

甲醇；AR 遵义市高等师专化学试剂厂

氯仿；AR 重庆州江化学试剂厂

95%乙醇AR 成都金山化学试剂有限公司3.3方法

3.3.1 红曲霉中麦角固醇分离纯化工艺路线

湿菌体洗涤2遍称取菌丝体1g KOH/甲醇发酵过滤后滤纸吸干置于回流瓶中加85～90℃加50mL乙醚

入碱性甲醇皂化2.5h 冷却至室温振荡10min

水浴中回流

静置2.5h 取上层（弃下层）得麦角固醇95%溶解被用（成品）转入分液漏斗

3.3.2红曲霉的菌体培养方法

3.3.2.1 菌丝生长培养基（Sabouraud培养基）

葡萄糖20g；麦芽糖5g；蛋白胨10g；酵母膏5g；琼脂20g；水1000mL；pH自然制成斜面培养基，用于活化菌株。

3.3.2.2 活化菌株

①打开超净工作台灭菌消毒；

②关闭紫外灯，打开照明灯，将需要转接的菌株和培养基放入超净工作台；

③用酒精搽净双手，准备接种。

④将红曲霉菌株转接于Sabouraud培养基上，30℃培养7天。取用其中活化的一

部份，其他低温保存。

3.3.2.3种子培养

①0.05%吐温80洗活化好的菌株斜面，分别装入无菌的三角瓶中（瓶内装玻璃

珠，铺满瓶底）；

②振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成浓度为106个/ml的孢子悬

液；

③按10％（V/V）接种于Sabouraud培养基中，30℃、200r/min振荡培养5天。

④根据上述红曲霉中麦角固醇分离醇化工艺路线分别提取麦角固醇和第2章中麦角固醇的测定方法，用紫外分光光度法测定其含量。

3.4结果与讨论

3.4.1菌种的选择

Monascus sp. ZZ 、Monasus rubber. ZK、Monasus purpureus. GX、Monasus sp. XM、按照3.3.2.3中所述培养方法进行液体发酵。菌体的生长状况及麦角固醇的产生情况，见表3.1

“表3.1”不同红曲霉菌株的生长状况和麦角固醇的产量

Table（1-12）The yield of ergosterol and the growth condition of different Monascusstrains

菌种菌株生长状况的肉眼观察麦角固醇含量c（μg/ml） ABS

GX 菌体呈絮状，发酵液呈深红色。 1.4790 0.100

ZZ 发酵液呈深红色,菌体呈细丝状 2.6760 0.160

均匀分布在发酵液

ZK 瓶壁有一圈很浓密的白色菌体 1.4990 0.101

发酵液呈浅紫红色。

XM 瓶壁有一圈白色菌体， 1.5980 0.106

发酵液呈紫红色。

由表3.1可见，实验所用红曲霉菌株产麦角固醇能力存在差异，这可能跟菌株本身特性有关。实验所用Monascus sp. ZZ、ZK、XM、GX、菌株产麦角固醇的含量是乎高低差别相对较大，而Monascus sp. ZZ菌株产麦角固醇能力相对较高。当实验采用Monascus sp. ZZ菌株时，麦角固醇含量为2.676μg/mL，且有较高的生物量。故以下选用Monascus sp. ZZ为实验菌株。

3.5培养条件的优化

3.5.1无机源的选择

3.5.1.1菌种和培养基

1、菌种红曲霉Monascus sp. ZZ由本实验筛选产生

2、液体种子培养基①基础培养基、葡萄糖25g、蛋白胨15g 水、PH自然

②发酵培养基:根据需要，在上述基础培养基中添加一定浓度的无机盐即成。

3、菌种活化见本章3.3.2.2

4、液体种子制备见本章3.3.2.3

5、生物量的测定（视培养基的生长情况分别有下2种方法测定生物量）以下若不作说明均用第2种方法测定其生物量；

①取50 ml发酵液，4000 r/min离心15 min，用蒸馏水洗涤沉淀2一3次，所得红曲霉在45℃一500C的条件下烘干至恒重后，称重，换算成1000 ml发酵液的菌体量，即为细胞生物量。

②将培养好的液体种子培养基用脱脂棉过虑，吸干后称重，即为细胞生物量。

准确称取经过滤干燥后的红曲霉液态发酵的菌体1.000g ，置于250m1圆底回流瓶中，加碱性甲醇（300g/LKOH：40%乙醇体积比=2：1），85-90℃水浴中回流皂化 2.5h 后，冷却至室温，经25m1乙醚萃取（用保鲜膜密封后）振荡10-20分，静置2.5小时，分层要上层，定溶（95%乙醇定溶到50mL）待测（此步参照本章3.2的工艺）在TU-1901双紫外可见分光光度计测定吸光度，波长281.5 nm。按公式计算麦角固醇含量。

麦角固醇（％）＝（CV/W）×100

式中，C：试样中麦角固醇浓度；

V：萃取溶液50mL ×稀释倍数；

W：菌体干重（g），湿菌体需换算。