人源化小鼠模型在感染性疾病方面的研究及应用

人源化小鼠模型在感染性疾病方面的研究及应用摘要：研究人类疾病的发病机制需要理想的动物模型来进行大量的体内试验，但是动物种属差异使得某些病原微生物仅仅对人类具有特异的易感性及致病性，限制了人们对疾病发病机理的理解及预防治疗。因此，构建具有人类功能性基因、细胞或组织的人源化动物模型尤为重要。本文对人源化小鼠模型的研究概况及其在感染性疾病中的应用进行综述。

关键词：人源化小鼠；动物模型；感染性疾病

人源化小鼠模型是指带有功能性的人类基因、细胞或组织的小鼠模型。这种模型通常被用于人类疾病体内研究的活体替代模型[1]。由于种属差异，利用普通动物模型得到的实验结果有时在人体上不能适用。所以，利用转基因或同源重组的方法，将人类基因“放置”在小鼠模型上所制备的人源化小鼠模型，大大提高了其作为模拟某些人类疾病的有效性。当前，基因被修饰的人源化小鼠模型已经在癌症、传染病、人类退化性疾病、血液病等许多不同的研究领域有广泛的应用，成为有价值的科研工具。近几年，带有人类基因的人源化小鼠模型已经被证明在解码人类疾病奥秘中具有巨大的优势和广泛的应用前景[2]。

1人源化小鼠模型的发展

人源化小鼠模型研究的第一次突破性进展是1983年Bosma等成功培养出的T/B淋巴细胞缺陷的重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠。Bosma等于近交系C.B-17小鼠中发现位于第16号染色体的单个基因隐性突变可导致小鼠出现T/B淋巴细胞缺陷的重症联合免疫缺陷综合征（SCID），称为SCID小鼠。SCID小鼠表现为缺乏成熟的功能性T、B淋巴细胞及低免疫球蛋白血症。造成SCID小鼠出现严重免疫缺陷的最主要原因是纯合SCID基因突变导致淋巴细胞抗原受体基因VDJ编码顺序的重组酶活性异常，故不能有效地合成免疫球蛋白与T细胞受体。但是由于这种小鼠存在正常的自然杀伤(NK)细胞以及单核/巨噬细胞系统，应用这种小鼠产生的人源化小鼠模型效率不高[3]。NOD/SCID小鼠的发现和使用成为人源化小鼠模型发展过程中的又一里程碑式事件。为提高人类异种细胞移植的成功率，1995年Shultz等将SCID 突变基因导入到NOD小鼠身上获得非肥胖糖尿病(non-obese diabetic，NOD)/SCID小鼠模型[4]。较C.B-17 SCID小鼠而言，NOD/SCID小鼠的NK细胞功能更弱，因而人类的细胞和组织的移植成功率也大大增加，但由于NOD/SCID小鼠生命周期短，并且仍具有部分自然杀伤细胞活性，导致其作为人源化动物模型应用受限。IL-2Rγ缺陷小鼠的出现及运用，使得免疫系统人源化小鼠得到实质性的改良。2004年Traggiai等通过将脐带血来源的人造血干细胞注射到经过亚致死剂量照射的新生BALB/c-Rag2-/-IL2rg-/-小鼠的肝脏，成功的在小鼠

的胸腺、淋巴结及脾脏等器官中检测到人的T细胞，而且在小鼠体内检测到具有结构的初级和次级淋巴组织。尤为重要的是这种人源化小鼠产生的人的T细胞能够被EB病毒（EBV）所激活。但这些小鼠的胸腺很小，仅占免疫功能正常小鼠胸腺的1%，这说明这些小鼠的胸腺发育水平较低[5]。此外，尽管这种人源化小鼠可以对病毒产生免疫反应（如EBV），但大量证据显示，这种小鼠还未能够充分介导抗原特异性反应。用特异性抗原免疫之后，这种人源化小鼠还无法产生大量的T细胞依赖的抗体。

NOG(带有IL2rg剔除基因的NOD/ShiSCID)和NSG(带有IL2rg剔除基因的NOD/LtSz SCID)小鼠是由白细胞介素2受体γ链(interleukin 2 receptor gamma chain，IL-2Rγ)靶向突变形成的免疫缺陷小鼠，具有NOD品系的遗传背景，在Prkdc基因上有点突变，造成小鼠重度联合免疫缺陷（SCID，T、B淋巴细胞都缺陷），而且具有重要免疫调节功能的IL2受体的gamma链基因被敲除，NK细胞也失去功能。研究数据显示，NOG、NSG小鼠是目前可以接受人类细胞和组织移植的最优模型，这两种模型的移植成功率高于SCID和NOD/SCID小鼠模型[6]。该类小鼠适用于构建多种人源化小鼠模型，其应用领域包括肿瘤、血液系统疾病、感染性疾病、免疫性疾病及代谢性疾病等。

2人源化小鼠模型在感染性疾病方面的研究进展

感染性疾病是由病原微生物造成的，但许多传染病，如获得性免疫缺陷综合征、疟疾、丝虫病以及登革出血热等的病原体并不能感染小鼠等实验室动物，因此限制了通过动物模型进行的活体研究。人源化小鼠模型的出现为研究这类疾病及开展疫苗测试提供了一个有效平台。随着新型的人源化小鼠模型的出现，一系列用于研究传染病的动物模型陆续构建成功，包括用于研究人类免疫缺陷病毒、登革热病毒、EB病毒、丙型肝炎病毒、结核分枝杆菌等的模型。

2.1人免疫缺陷病毒的研究人免疫缺陷病毒(HIV)感染人体后，主要感染CD4+T细胞，引起T细胞明显减少，最终患者死于获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。经过几十年的研究，HIV 感染导致AIDS的详细机制仍未完全明晰，一个重要原因就是由于HIV感染特异性导致没有理想的动物疾病模型以供研究[7]。免疫系统人源化小鼠模型的发展为HIV感染的病理研究及治疗提供了新的有效的途径。应用免疫系统人源化小鼠模型，HIV病毒可以在小鼠体内持续病毒复制，导致小鼠体内人来源的CD4+T细胞显著减少，当前研究发现在T细胞及巨噬细胞中均有病毒抗原表达。更重要的是，HIV感染可以引起人源化小鼠体内T细胞的活化，而这种慢性长期的免疫激活是引起HIV最终导致AIDS的最重要因素。除了HIV感染病理机制的研究，由于HuBLT-SCID模型支持人细胞在小鼠粘膜组织重构，因此，免疫系统人源化小鼠

在HIV粘膜感染的预防及治疗方面的研究也有应用前景。最近的研究发现，HIV感染的人源化小鼠可以诱导神经系统免疫应答，包括白细胞的浸润、小胶质细胞的活化，以及脑膜炎及脑炎症状。这提示免疫系统人源化小鼠在AIDS发病期神经系统退行性病变研究中也有应用价值。

2.2疟疾的研究疟疾是经按蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染疟原虫所引起的一种高致死率传染病，由于感染人类的疟原虫对人类有高度特异性，有效的抗疟疾疫苗及药物的研发受到限制。疟原虫主要经肝脏致病，有报道显示，将人的肝脏实质细胞注射入肝脏受损的免疫缺陷小鼠体内，人的肝细胞就可替代小鼠的肝细胞存活。应用Hu-PBL-SCID模型可以建立疟原虫入血后的炎症模型，不过应用此模型的主要问题在于人来源的红细胞很难在小鼠体内维持一个高水平状态，红细胞会被小鼠巨噬细胞及NK细胞快速清除。因此，需每天经小鼠腹膜注入人的红细胞，使得红细胞维持在一个高水平状态，观察疟原虫在肝内的增殖情况，从而可以成功建立疟原虫入血后的炎症模型，寄生虫可以在人源化小鼠体内生长繁殖，并可对抗疟疾药物发生反应，因此可以检测药物的治疗效果[8]。

2.3丙型肝炎病毒的研究HCV属于黄病毒科肝炎病毒属，是RNA病毒，约80%的感染者可形成慢性肝炎，部分病人可发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。慢性HCV感染与CD4+和CD8+T细胞功能受损有关。黑猩猩是公认的最好的HCV感染实验动物，但其成本高昂，又是濒危动物，同时其慢性感染率低且不会发生肝纤维化。因此，一个成本低廉并能发生相应免疫应答的小动物模型对HCV的研究将大有帮助。在过去的10年中，已经有多种人类肝细胞嵌合体小鼠模型被开发出来，包括可被人体肝细胞定植的Alb-uPA-SCID（Alb-urokinase plasminogen activa tor-SCID）小鼠和Fah-RG（Fah-/-Rag2-/-IL-2Rγc-/-）小鼠[9]。但这些模型缺少人类免疫系统功能，阻碍了免疫发病机理的研究。具有人类肝脏系统功能的免疫活性人源化小鼠克服了这一困难，该模型使用具有RG小鼠背景的AFC8转基因小鼠构建，AFC8小鼠表达细胞凋亡蛋白酶-8和FK506结合蛋白（FK506 binding protein，FKBP）活性。人类肝脏祖细胞和造血干细胞联合植入AFC8转基因小鼠肝脏中，再用二聚化因子诱导小鼠肝细胞凋亡，可选择性地使人类肝细胞生长，人类造血干细胞定植可使人类免疫细胞群发育，形成AFC8-hu HSC/Hep小鼠（简称Hu-Liver-HSC小鼠）[10]，该模型中定植的人类肝细胞感染HCV并发生特异性T细胞反应。HCV血症可在uPA和Fah小鼠模型（支持>50%肝细胞移植）中见到，但在AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型中不能发现，这是因为其肝细胞定植水平较低（约15%），因此该模型仍须改进。

2.4登革病毒的研究DENV属于黄病毒科RNA病毒，包括4种血清型，即DEN-1~DEN-4。

所有血清型的DENV都可以感染人类，造成从亚临床感染到急性发热性登革热的一系列严重疾病，甚至是致命的登革出血热/登革休克综合征（DHF/DSS）。人类细胞比小鼠细胞更容易感染登革病毒，所以建立人源化小鼠。移植肿瘤细胞到SCID小鼠体内很容易，但是由于其固有免疫反应，包括能阻止移植造血组织的NK细胞，所以移植人类组织入小鼠是很困难的。可将SCID小鼠先与NOD小鼠回交，再与敲除了IL2Rγ的KO小鼠回交。其中NOD小鼠的NK 细胞功能缺陷，以及因C5缺乏导致的溶血补体反应缺陷。这种天生缺陷与改良免疫反应的结合让人类的各种细胞和组织可更好地移植到小鼠体内。NOD／SCID／IL2RγKO小鼠和人类CD+43祖细胞的重组使人类不同的细胞可以在小鼠体内生长，包括登革病毒感染的主要靶细胞树突细胞。登革病毒可在不同的小鼠组织中感染人类细胞，包括脾、骨髓、肝及所有与登革病毒感染临床体征相关的组织。在感染登革病毒后，小鼠出现登革热的临床症状，包括发热、红疹和血小板减少，但还没有出现更严重的症状[11]。这些小鼠提供了研究人体内免疫机制的可能性。目前要产生稳定足量的抗体还很困难，难以将抗体产品化，但小鼠通常都能产生针对登革病毒特有的Ｔ细胞反应，使其成为研究在持续感染中Ｔ细胞交叉反应的重要模型。最近，有一种新的BLT-NSG小鼠模型，它是移植有脐带血造血干细胞的人源化NOD-scidIL2R γnull小鼠，同时移植了人类胎儿的甲状腺和肝组织。研究发现在BLT-NSG小鼠的血清中登革病毒特异抗体滴度增加。另外，在急性期和记忆期由BLT-NSG小鼠的脾细胞产生的Ｂ淋巴细胞分泌出DNNV特异性具有中和能力的IgM抗体。BLT-NSG小鼠中的人源性Ｔ细胞分泌包括DENV肽池和HLA-A２限制肽的IFN-γ[12]。

3结语

人源化小鼠模型作为研究疾病的活体替代模型，在阐明发病机制、药物筛选等方面具有巨大的优势和广泛的应用前景。各种人体细胞和组织移植到不同品系的免疫缺陷小鼠体内创建出不同类型的人源化小鼠模型，它们有各自的优缺点，根据实验需要筛选出更符合构建人源化小鼠模型需要的免疫缺陷小鼠，是提高人源化动物模型应用的关键，因此仍需进行更为深入的研究。结合现有的人源化小鼠模型构建技术，模拟人体的生理、病理变化，可以为临床应用提供新的途径，从而更好地服务于人类。

参考文献

［1］Brehm MA，Shultz LD，Greiner DL．Humanized mouse models to study human disease［J］．Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2010，17(2):120-125．［2］ItoＲ，Takahashi T，Katano I，et al．Current advances in humanized mouse models［J］．Cell Mol Immunol，2012，9(3):208-214．

［2］ Ito Ｒ，Takahashi T，Katano I，et al．Current advances in humanized mouse models［J］．Cell

Mol Immunol，2012，9(3):208-214．

［3］Zhang B，Duan Z，Zhao Y．Mouse models with human immunity and their application in biomedical research［J］．J Cell Mol Med，2009，13:1043-1058．

［4］Melkus M W,Estes J D,Padgett-Thomas A,etal.Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1［J］.Nat Med,2006,12:1316-1322.

［5］Mold JE,Venkatasubrahmanyam S,Burt TD,et al.Fetal and adult hematopoietic stem cells give rise to distinct T cell lineages in humans［J］.Science,2010,330:1695-1699.

［6］Brehm MA，Cuthbert A，Yang C，et al．Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity:analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null)mutation［J］．Clin Immunol，2010，135(1):84-98．

［7］Zhang L，Su L．HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models［J］．Cell Mol Immunol，2012，9:237-244．

［8］Angulo-Barturen I，Jimenez-Diaz M B，Mulet T，et al．A murine model of falciparum-malaria by in vivo selection of competent strains in non-myelodepleted mice engrafted with human erythrocytes［J］．PLoS One，2008，3:e2252．

[9] Hasegawa M,Kawai K，Mitsui T，et a1．The reconstituted‘humanized liver’in TK-NOG mice is mature and functional[J].Bioehem Biophys Res Commun．2011，405(3)：405-410.Bioehem Biophys Res Commun．2011，405(3)：405-410．

[10]Washburn M L,Bility M T,Zhang L,et al.A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection,immune re sponse,and liver disease[J].Gastroenterology,2011,140(4):1334-1344. ［11］Yen YT，Chen HC，Lin YD，et al.Enhancement by tumor necrosis factor alpha of dengue virus-induced endothelial cell production of reactive nitrogen and oxygen species is key to hemorrhage development[J].J Virol,2008,82:12312-12324.

[12] Cassetti MC，Durbin A，Harris E，et al. Report of an NIAID workshop on dengue animal models ［J］.Vaccine，2010，28（26）：4229-4234.