钙蛋白酶系统及其与肉质关系的研究
钙蛋白酶系统研究进展_梅承君
钙蛋白酶系统研究进展 梅承君1,庞辉2,康相涛1*,孙桂荣1(1.河南农业大学,河南郑州450000;2.河南省公安厅,河南郑州450000)摘要阐述了钙蛋白酶系统的分类、结构,并且综述钙蛋白酶系统的一般生物学功能及影响因素。 关键词钙蛋白酶;钙蛋白酶抑制蛋白;钙蛋白酶激活蛋白;嫩度 中图分类号Q55文献标识码A文章编号0517-6611(2006)22-5774-03 Research Adva nce in C alpain System MEI C heng-jun et al(Hen an Agricul tu ral University,Zhen gzh ou,Henan450000) Abstract This paper revie wed th e classi ficati on and structu re of cal pain sys tem,the general biological function and its affecting factors. Key w ords C alp ain;Cal pas tatin;Calpain activator;Tenderness 钙蛋白酶是1964年由Guroff首次发现,1972年Bush等首先在骨骼肌中确认,1976年Da yton等对其进行纯化。钙蛋白酶被鉴定、纯化后,其名称有钙活化中性蛋白酶(Calcium a ctiva te d ne utra l prote ase,Calcium ac tiva ted ne utral SH prote ase, c alpain)简写为CANP(EC,3,4,22,17)、钙激活酶(Ca2+-a ctiva t-ed enzy me)、钙激活中性蛋白酶(Calcium a ctiv ate d ne utral pro-te ase)等。1983年Go ll等提出钙蛋白酶在骨骼肌肌丝蛋白降解过程中起关键作用[1]。目前,已证明它广泛地分布于绝大多数动物的细胞中。在一定浓度的钙离子作用下,钙蛋白酶主要作用于细胞骨架蛋白、蛋白激酶和磷酸酶,还参与细胞内的信号传递[2]。 1钙蛋白酶系统 1.1钙蛋白酶的分类Calpain中的Cal代表钙调蛋白(Ca-l moclulin),pain代表木瓜蛋白酶(Pa pain)。Calpain由钙调蛋白和木瓜蛋白酶两者以非共价键结合而成。钙蛋白酶系由多种同工酶构成。根据分布特点可将其分为组织特异性和非组织特异性蛋白酶两大类[3]。目前研究比较深入的是非组织特异性蛋白酶,已知的2种非组织特异性同工酶是Ca-l pain1和Ca lpain2。Ca lpain1可被L mol水平的钙离子激活,又称L-Calpain;Ca lpain2可被mmol水平的钙离子激活,又称m-Calpain。除活化时需要的钙离子浓度不同和结构略有差别以外,这2种同工酶生化和催化的性质几乎完全相同。红细胞内仅含有Calpain1,其余的哺乳动物细胞中均含有2种形式的钙蛋白酶。由于细胞内钙离子的波动在微摩尔(L mol)浓度水平以下,所以Ca lpain1很可能在正常生理条件下发挥功能,而Calpain2则可能在病理情况(细胞内钙超载条件)下才能激活[4]。 1.2钙蛋白酶系统的结构[5] 1.2.1钙蛋白酶的结构。钙蛋白酶系中L-Calpain和m-Ca-l pain由不均一的二聚体蛋白构成,其大、小亚基的分子量分别为80和30kD。Calpain3、8a、9、11、12和13也都分别由大、小2个亚基构成。大亚基具有催化活性,L-Ca lpain和m-Ca-l pain的大亚基分别由CANP1和CAN P2基因编码;小亚基具有调节功能。尽管L-Calpain和m-Calpain大亚基氨基酸 基金项目国家/8630计划资助项目(2002AA242021);河南省重大科技攻关项目(022*******,0322010600);河南省高校杰出科研人才 创新工程项目(2000KY CX005)。 作者简介梅承君(1979-),女,河南焦作人,硕士研究生,研究方向:家禽育种。*通讯作者。 收稿日期2006-08-09序列有明显差异,但是其高级结构基本相同,都由4个结构域组成,从N端起分别命名为?、ò、ó、?结构域。在大亚基中,结构域?由1~80位氨基酸残基组成,约占全部分子的10%,在蛋白酶激活的情况下很容易发生自溶,由此推测其可能起钙蛋白酶的活性调节作用,L-Calpain和m-Ca lpain仅在结构域?中不同;结构域ò含有81~330位氨基酸残基,约占全部分子的35%,是表现钙蛋白酶水解活性的关键部位,在未被激活的条件下含有2个次级区域[6];结构域ó由331~560位氨基酸残基组成,约占全部分子的35%,其功能为结合钙离子和磷脂,与蛋白酶调控亚基或其他调控蛋白有关;结构域?由561~705位氨基酸残基组成,占全部分子的20%,是结合钙离子的部位,含有4个钙结合蛋白所特有的EF-手型结构(1个EF-手型结构包含2个与钙离子结合环相连的氨基酸螺旋)[7]。L-Ca lpain、m-Calpain、Ca lpain9的小亚基含有2个结构域,这2个结构域由一段富含脯氨酸的序列相连,其中结构域ò与大亚基的结构域?相同,含有4个可以结合钙的EF-手型结构,故也具有结合钙的活性[8]。在其他钙蛋白酶中,如Calpain3、8a、11、12、13,尽管其大亚基也有结构域?,但其大、小亚基之间并没有相互联系。Ca lpain5、6、7、8b、10、15为非典型的钙蛋白酶,其部分结构域缺失或被取代,没有结构域?,因此推测其大、小亚基间也不存在联系。 1.2.2钙蛋白酶抑制蛋白的结构。钙蛋白酶抑制蛋白(Ca-l pastatin)是细胞内专一抑制钙蛋白酶活性的蛋白质。通过抑制钙蛋白酶活性,可抑制肌肉内蛋白质降解,参与肌肉生长过程中蛋白质的更新。在屠宰后的动物体内,它可抑制钙蛋白酶的活性,从而明显影响肉的嫩度。它可以识别钙蛋白酶与钙结合引起的构象变化,并与之特异性结合。钙蛋白酶抑制蛋白通过抑制钙蛋白酶的自溶作用而发挥作用,且该抑制作用不受pH值的影响。钙蛋白酶抑制蛋白共由5个部分(?、ò、ó、?、?)组成,其中4个是钙蛋白酶抑制蛋白的活性中心。当钙蛋白酶被钙离子激活后,如果附近有钙蛋白酶抑制蛋白存在,则将迅速与之结合而抑制蛋白酶活性,从而保证钙蛋白酶对底物只进行局部的特定位点的水解。 目前对钙蛋白酶抑制蛋白的生化性质了解的还不十分清楚。根据钙蛋白酶抑制蛋白在SDS电泳中的行为,可将其分为70和110kD两种类型。70kD类型主要存在于红细胞中,110kD类型存在于肝、心脏和其他组织中。虽然这2种钙蛋白酶抑制蛋白分子大小不同,但它们的功能性质相似。 安徽农业科学,Jou rnal of Anh ui Agri.S ci.2006,34(22):5774-5776责任编辑刘月娟责任校对孙能森
钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)的研究进展
读书报告 钙蛋白酶抑制蛋白研究进展 汪超钟正泽杨飞云周晓蓉曹兰 （重庆市畜牧科学院重庆荣昌402460） 摘要：钙蛋白酶在宰后肉类成熟过程中通过降解肌肉蛋白质而提高肉嫩度，钙蛋白酶抑制蛋白是在细胞内广泛表达的、高效的、专一性抑制钙蛋白酶活性的蛋白质，因此引起了广大研究者的广泛关注。本文阐述了钙蛋白酶抑制蛋白的结构，生物学作用，营养等因素对钙蛋白酶抑制蛋白的影响及其活性测定方法。 关键词：钙蛋白酶抑制蛋白结构生物学作用活性测定 Research Progress of Calpastatin W ang chao, Zhong zhengzhe, Y ang feiyun, Zhou xiaorong ,Cao lan (Chongqing Academy of Animal Science,Rongchong 402460 ) Abstact: Calpain make a contribution to Meat Tenderization by degradation of protein in the postmortem meat tenderization process. Calpastatin , a special endogenous inhibitor expressed extensively in cell , has a special inhibition to calpain. Therefore ,This paper review the structure ,biologic function, influenced factors , separation and activity assay of calpastatin. Key words: Calpastatin. Structure , Biologic function, influenced factors , activity assay 钙蛋白酶(Calpain)是一种钙激活中性半胱氨酸内肽酶，分布于所有脊椎动物的肌细胞内部。钙蛋白酶家族包括μ-钙蛋白酶,m-钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin）等。钙蛋白酶在骨骼肌中通过涉及生肌细胞分化、激发肌原纤维蛋白周转来调控生长，同时在宰后肉类成熟过程中通过降解肌肉蛋白质而提高肉嫩度。钙蛋白酶被钙离子和钙蛋白酶抑制蛋白调控[1]。钙蛋白酶抑制蛋白是一种有着多种功能的内源抑制剂，它通过抑制钙蛋白酶而发挥作用。本文综述了钙蛋白酶抑制蛋白的结构、生物学作用、营养等因素对钙蛋白酶抑制蛋白的影响及其分离与活性检测方法等。 1 钙蛋白酶抑制蛋白的结构 肌肉组织中钙蛋白酶抑制蛋白的分子量为77 KDa，斯托克半径为6.8nm，含
跨膜丝氨酸蛋白酶研究进展
跨膜丝氨酸蛋白酶研究进展 郭晓强 (解放军白求恩军医学院生物化学教研室,石家庄050081) 摘要 跨膜丝氨酸蛋白酶(T MPRSSs),又名II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSPs)是一类定位于细胞膜上具有保守丝氨酸蛋白酶结构域的蛋白家族,哺乳动物中已发现二十多个成员。T MPRSSs基本结构类似,C端蛋白酶结构域在胞外,N端位于胞内,还拥有单跨膜结构域,差异之处在于主干区。T MPRSSs具有多种重要生理功能,功能异常可造成耳聋、癌症、贫血和高血压等多种疾病。本文对T MPRSSs基本特征、结构、生理功能及相关疾病进行综述。 关键词 跨膜丝氨酸蛋白酶;耳聋;癌症;贫血;高血压 中图分类号 Q55 蛋白酶是一类水解蛋白质的酶类,最早于上世纪初在胃液中发现(胃蛋白酶),至今已鉴定多个成员。最早认为蛋白酶主要通过非特异性水解蛋白质参与食物消化,然而一系列研究表明哺乳动物体内还存在一些具有底物选择性的蛋白酶,它们参与更为多样的生理过程,如细胞周期、形态建成、细胞增殖和迁移、排卵、血管生成和细胞凋亡等,功能异常可造成代谢性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、关节炎和癌症等的发生(Puente等.2003)。相对于传统水溶性蛋白酶,新近发现一类特殊蛋白酶———具有单跨膜结构域的丝氨酸蛋白酶,并且C端位于胞外,因此被称为II型跨膜丝氨酸蛋白酶(type II trans me mbrane serine p r oteases,TTSPs)(Hooper等. 2001),又称跨膜丝氨酸蛋白酶(trans me mbrane p r o2 tease serines,T MPRSSs),这些新成员的发现和深入研究使人们对蛋白酶有了全新的认识[1]。 一、T M PRSS结构与基本特征 自1988年发现第一个跨膜丝氨酸蛋白酶T M2 PRSS1(hep sin)(Leytus等.1988)以来,至今已在人、小鼠和大鼠中发现二十多个成员,仅人类就有十几种(表1)。T MPRSS表达具有明显组织特异性,T M2 PRSS6主要在胎儿和成年肝脏中表达(Velasco等. 2002),而T MPRSS10主要存在于心脏(Yan等. 1999),这种表达模式说明不同T MPRSS参与不同生理过程。T MPRSS家族成员在分子量上差别巨大,如人T MPRSS1包含417个氨基酸残基,而T M2 PRSS10由1042个氨基酸构成,两者相差1倍以上,但基本结构却高度相似,均含四部分,从N端到C 端依次为短细胞质结构域、跨膜结构域、主干区和丝氨酸蛋白酶结构域,后两者位于胞外,不同成员区别主要集中于主干区。 根据主干区不同,T MPRSS可被进一步分为四个亚家族:HAT/DESC、hep sin/T MPRSS、matri p tase 和corin[1]。HAT/DESC亚家族包括T MPRSS11d (HAT)和T MPRSS11e(DESC1),它们结构最为简单,主干区仅由单一SE A(sea urchin s per m p r otein, enter opep tidase,agrin)结构域构成[2](图1)。hep2 sin/T MPRSS亚家族包括T MPRSS1～5和T MPRSS13等,是包含种类最多的一个亚家族,主干区包含清道夫受体富含半胱氨酸(scavenger recep t or cys2rich, SRCR)结构域和低密度脂蛋白A类受体(l ow densi2 ty li pop r otein recep t or class A,LDLa)结构域。matri p tase亚家族包括T MPRSS14(matri p tase21)、T MPRSS6(matri p tase22)和T MPRSS7(matri p tase23),其主干区除含有SEA结构域外,还包含2个CUB (comp le ment p r otein subcomponents C1r/C1s,urchin e mbryonic gr owth fact or and bone mor phogenetic p r o2 tein1)结构域及3到4个串联重复LDLa结构域。corin亚家族目前只发现一个成员T MPRSS10(cor2 in),其结构最为复杂,主干区包含8个LDLa结构域,2个frizzled结构域和1个SRCR结构域。 图1 几个典型T MPRSS结构特点[1]
钙离子处理对肌细胞组织特异性钙激活中性蛋白酶calpain3的影响
钙离子处理对肌细胞组织特异性钙激活中性蛋白酶 calpain3的影响 朱燕1，2 童敏1 罗欣1，2徐幸莲1 周光宏1? （1南京农业大学农业部农产品加工重点开放实验室210095， 2山东农业大学食品科学与工程学院271018） 摘 要：本研究利用RT-PCR和Western blot方法研究钙离子处理对成肌细胞L6形态、分化的影响以及calpain3基因mRNA水平表达和蛋白水平降解的调控。结果表明，成肌细胞L6的细胞分化程度随着钙离子浓度的增加而增大，且死亡细胞明显增多。RT-PCR和Western blot结果表明钙离子处理后calpain3mRNA个样品之间的表达无明显差别，但是免疫印迹图谱却发现，钙离子处理组与对照组相比，94kDa处的条带颜色稍有降低，55kDa处的条带颜色加深，说明有更多的小片段生成，且钙离子浓度大于200μM时94kDa处的条带消失。 关键词：RT-PCR L6成肌细胞 Western blot 骨骼肌特异性钙激活中性蛋白酶，P94是calpain超家族的一员，虽然其在活体中的功能不详，但可能对骨骼肌功能的发挥起到必不可少的作用[1]（Sorimachi 2000）。Calpain3蛋白分子由四个结构域组成，这与Calpain1 和Calpain2的大亚基有较高的同源性[2]。除此以外，Calpain3还具有3个特异性的结构，分别是N-端延伸亚基（NS）和两个插入序列：结构域Ⅱ内的插入序列IS1和结构域Ⅲ和Ⅳ之间的插入序列IS2，而IS2与核转导信号具有相似序列。 由于研究发现Calpain3的mRNA表达水平大约是Calpain1 和Calpain2的十倍之多，因而calpain3对于肌肉功能的作用引起人们的极大兴趣。Richard[3]（1995）发现calpain3基因突变可以导致2A型肌营养不良症（LGMD2A）的产生，从基因水平证实了起初科学家对于calpain3功能的猜想。自动降解性是Calpain3最主要的性质[45][46],在低或无钙离子存在的情况下Calpain3的半寿期（half live）小于10min。迅速的自动降解性，使得人们几乎无法在离体条件下研究calpain3的用，进而人们把研究方向转向对calpain3表达调控的研究。有的学者利用反义RNA技术对calpain3的mRNA干扰，导致细胞中缺乏含有弥漫α-actitin 的成熟Z盘[4]（Poussard et al， 1996）。此外，研究表明大多数情况下缺乏calpain3的活性会导致肌肉的病理反应[5]（Kihbara 1998）。 Calpain3作为钙激活中性蛋白酶超家族一员，结构中也含有EF手型这种钙调控结构，表明钙离子也可能是这种蛋白酶的一个重要的调控因子。且在钙离子对calpain3降解的影响上还存在较大争议。本研究利用L6为研究对象，探讨钙离子处理对活体肌细胞中calpain3表达的影响。 1材料与方法 1.1 成肌细胞培养、分化和Ca2+处理 大鼠L6成肌细胞系（购于中国科学院上海细胞库，源自ATCC）按照1.5×105的密度 基金项目：教育部博士点基金（20020307006），国家自然科学基金资助项目（30371016） 作者简介：朱燕（1974-），博士研究生，讲师，主要研究方向：肉品质量控制。*通讯作者Corresponding author：周光宏(1960-)，Email:ghzhou@https://www.360docs.net/doc/cf11106448.html,
钙蛋白酶系统与肌肉增长及嫩度的关系
收稿日期：2002-05-16 作者简介：金海丽（1979-），女，浙江义乌人，浙江大学华家池校区饲料所在读硕士生，主要从事动物营养与饲料科学研究。 浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis 14（6）：354～359，2002 钙蛋白酶系统与肌肉增长及嫩度的关系 金海丽，许梓荣 （浙江大学饲料科学研究所，浙江杭州310029） 摘 要：钙蛋白酶系统主要由钙蛋白酶（μ-calpain ，m-calpain ） 及钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin ）组成，calpain 是存在于细胞质中的依赖于Ca 2+的中性蛋白酶，calpastatin 是钙蛋白酶的内源抑制蛋白。近年的研究表明，calpain 是细胞质中主要的蛋白水解酶，在肌原纤维蛋白降解中起着重要的作用。肌肉增长和宰后嫩度的变化与蛋白质水解程度密切相关。因此，钙蛋白酶系统的活性会影响畜禽肌肉增长和肉的嫩度。本文综述了钙蛋白酶系统各种酶的结构、作用、活性调节及与肉质的关系。关键词：钙蛋白酶系统；结构功能；活性调节；肌肉增长；嫩度中图分类号：S813.24 文献标识码：A 文章编号：1004-1524（2002）06-0354-06 The relationship between calpain system and muscle growth and meat tenderness ：JIN Hai-li ，XU Zi-rong （Feed Science Institute ，Zhejiang University ，Hangzhou 310029，China ） Abstract ：Calpain system consists of μ-calpain ，m-calpain ，the calcium-dependent neutral proteases ，and their endogenous inhibitor ，calpastatin.Calpain system is probably the major proteolytic in protein degradation ，which plays an important role in myofibrillar protein degradation.The muscle growth and postmortem tenderiza-tion of meat are highly related to the degree of proteolysis ，so the activity of calpain system has an effect on muscle growth and meat tenderness.This paper reviews the structure ，function and regulation of calpain system and the relationship between calpain system and muscle growth and meat tenderness . Key words ：calpain system ；structure and function ；activity regulation ；muscle growth ；tenderness 提高家畜瘦肉率和产出对畜牧业来说具有非常重要的经济意义。肌肉蛋白质的增加取决于肌肉蛋白合成速度和降解速度。研究发现，过量calpain 表达可引起成肌细胞肌原纤维的降解，而calpastatin 表达量的增加会抑制肌肉蛋白质水解。骨骼肌蛋白降解的途径有三条：溶酶体组织蛋白酶途径、依赖钙的蛋白酶途径和依赖ATP 的蛋白质途径。在肌 肉组织中，钙蛋白酶系统控制着肌纤维蛋白 的降解，是肌肉蛋白质降解的限速步骤［1］。 因此，钙蛋白酶系统有可能在肌肉发育中起着调控作用。 肉的嫩度是肉品质的一个重要方面。影响肌肉间肉嫩度的主要因素有肌节的长度、结缔组织的含量及肌肉结构蛋白的水解敏感 性 ［2］ 。目前研究主要集中在第3个因素，宰后肌肉嫩度与肌肉蛋白质的降解量密切相 关，具有水解蛋白的特性钙蛋白酶系统毫无疑问会影响宰后肉嫩化，除此之外嫩度还与畜禽的遗传因素和肉的种类等因素有关。研
CAST(钙蛋白酶抑制蛋白酶)功能缺失(LOF)的突变,导致皮肤缺损白甲病、肢体末端点状角质化口唇炎指关节垫
CAST（钙蛋白酶抑制蛋白酶）功能缺失(LOF)的突变，导致皮肤缺损、白甲病、肢体末端点状角质化、口唇炎、指关 节垫 一：研究背景 皮肤剥落综合征(PSS)一种皮肤角质层持续的脱落症状，从婴幼儿时发病持续终生，皮肤脱落可伴有红斑、水泡和其它外胚层组织病变，比如脱发、异常指甲。PSS可分为两种临床类型：肢端PSS(APSS)和广泛性PSS(GPSS)。APSS患者发生在手足部位的手掌面、足底、背面，和谷氨酰胺转氨酶-5突变有关。此外，导致常染色隐性遗传病鱼鳞病的半胱氨酸蛋白酶抑制酶-A(CSTA)的基因突变也和APSS有关；GPSS个体和角膜黏连蛋白突变(CDSN)有关；山姆综合征(一种严重皮炎)和桥粒心黏连蛋白-1(GSD1)突变有关;Exampl…….。然而，一些APSS 病人的遗传机制尚不清楚。 CSAT基因突变为常染色隐性遗传，大量APSS患者该突变基因型为纯合子，临床表现白甲、肢体末端点状角质化、口唇炎、指关节垫，疾病缩写“PLACK”。通过显子测序和Sanger测序，证实了在三个互相隔离的家庭成员PLACK患者中，不同的纯合子的CSAT功能缺失。 二：研究目的 验证CSAT在表皮稳态中的作用。
3.1 样本采集：一个28岁的PLACK中国女性患者(individual1)、一个尼泊尔PLACK儿童患者(individual2)、两个欧洲先天性厚甲症患者(individual3、4)的血液和唾液样本； 3.2 Sanger测序：排除其它皮肤炎症遗传病中TGM5, CSTA, CDSN, 和CHST8基因突变； 3.3 individual-1 和individual 2全外显子测序，外显子捕获先通过罗氏NimbleGen SeqCap EZ Library外显子捕获系统富集，然后Illumina HiSeq2000测序； 3.4 individual-1 和individual 2突变通过dbSNP137、1000 G、HapMap和BGI内部数据库过滤； 3.5 RT-PCR对individual 1皮肤中CAST的mRNA表达进行定量，设定阴性对照； 3.6 individual 1胫前皮肤CAST抗体免疫组化染色，individual 2左大腿皮肤
胶原蛋白酶的研究进展
胶原蛋白酶的研究进展 摘要：胶原蛋白特有的三股螺旋结构使其难于被人体吸收，将胶原蛋白水解为胶原多肽后，可显著提高其营养及生理功能，胶原蛋白酶是一种价值很高的蛋白酶种。本文介绍了胶原蛋白酶的定义、选择、影响因素。作用机理等，并展望其研究方向。 关键词：胶原蛋白酶，作用机理，影响因素 Abstrac t: The nutritional and physiological function of collagen protein can be significantly improved via chemical or enzymatichydrolysis，as the collagen protein was difficult to be absorbed by human body due to the triple helical characteristic molecules structure. Collagen protease is a kind of high value of protease. In this paper, introduces the definition of collagen enzyme, selection, influence factors, mechanism etc. The future development direction it was also prospected. Key words: collagen protease, mechanism, influence factors 胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广泛的蛋白质，是一种与组织和器官功能密切相关的功能性蛋白。胶原蛋白的低免疫原性、生物相容性、生物降解性［1 － 3］和生物活性等特性，被愈来愈多的消费者所认识。胶原蛋白制品已被广泛应用于食品、保健食品、化妆品、医药等领域，市场需求急剧增加［4］。天然胶原蛋白经蛋白酶水解后，可得到具有抗氧化、降血压、降血脂、免疫调节、激素调节、抗疲劳等生理调节功能的小肽，是极具发展前景的功能因子，也是当前医药、食品界最热门的研究课题之一[5-6]。 胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构，三条链相互平行而且由链间氢键相连，具有十分稳定的性质，一般的加工温度及短时间加热都难使其分解，因此难被人体吸收，食用利用率较低[7]。将胶原蛋白水解为胶原多肽后，其营养及生理功能可显著提高：蛋白质消化吸收率几乎达100％，能保护胃黏膜以及抗溃疡，促进皮肤胶原代谢，抑制血压上升，对关节炎等胶原病具有很好的预防及治疗作用，能促进钙吸收和降低血清中胆固醇含量等[8]。寻找一种高效的降解胶原蛋白的酶也成为了当今的一个热门课题。 1 胶原蛋白酶的定义和选择 1.1 定义 胶原蛋白酶(Collgaenolytci protease)定义为在适当的pH 和温度下，只切割活性胶原螺旋区或明胶而不作用于其他蛋白底物的酶类[9-10]。 1.2 酶的选择 能使胶原蛋白酶解的酶类较多。按照作用位点可以分为内切酶和外切酶；从来源上可分为植物蛋白酶(如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、动物蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）、微生物蛋白酶(如枯草杆菌1.398、放线菌166 等)；此外，较常用于水解的蛋白酶还有风味复合酶等。在实际应用中，酶的选取通常要考虑三个方面：一是酶对胶原蛋白作用的强度；二是酶的价格；三是水解产物的要求。如果酶对胶原的作用太弱，则无法得到高的胶原水解率，而酶的纯度直接影响酶的价格，纯度较高的酶与工业用酶的价格往往相差甚远。因此开发的产品如没有特殊要求，一般可以考虑选择用已完全工业化的酶。除此之外，还必须考虑酶对胶原的作用位点，因为这直接影响最后水解产物分子量的分布，是决定能否得到目标产物的一个关键因素[12-13]。细菌胶原酶可分泌到胞外，通过发酵可大量获得，微生物来源的胶原酶在应用方面具有更广的应用范围[11]。
中性蛋白酶
1.1中性蛋白酶的来源 蛋白酶是一类催化蛋白质肽键，生成蛋白胨、蛋白肽及氨基酸等产物的水解酶，其广泛分布于自然界的植物、动物和微生物中。例如木瓜蛋白酶主要来自于植物木瓜，胰蛋白酶来自动物的胰腺，来自微生物的蛋白酶没有特定名称，例如有来自AS1.398枯草芽孢杆菌的蛋白酶，有来自宇佐美曲霉的蛋白酶等等，其中微生物来源的蛋白酶数量与种类最多，也最具研究、开发与生产价值。随着水解条件之一的pH值的升高，蛋白酶分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，这也同时划分了它们应用的领域有所不同。 1.2中性蛋白酶的研究现状 对于中性蛋白酶的研究主要集中于以下几个方面： 一是继续研究发现新的蛋白酶品种，为蛋白酶家族添加新成员，尽管此项工作的难度越来越大，但其意义不容否认。 二是对现有蛋白酶进行修饰、改性，延长和强化其功能，期望在降低应用成本的同时，减少酶本身的一些缺陷对其应用的限制。 三是通过生物技术手段提高酶产量，降低酶生产成本。现代生物技术不仅发达而且发展很快，技术应用的可选择范围也很广，例如物理或化学诱变技术、细胞质融合技术、转基因技术以及克隆技术等等。可以肯定和确认的是：上述技术的应用都取得了不同程度的效果；同时这些技术各有优势，所以并存至今。 四是提取和纯化技术方面，朱建星利用萃取技术使酶液浓度提高到发酵酶液的3.6倍多。刘东旺等应用盐析、层析和凝胶过滤等技术，纯化后的酶活力超过纯化前的19倍之多等等。此外，在纯化倍数提高的同时往往伴随着提取率的提高。 1.3中性蛋白酶的生产现状 中性蛋白酶的生产水平随着研究水平的提高而提高。总体上发达国家高于国内，而国内厂家之间也参差不齐，以微生物发酵来源的中性蛋白酶为例，报道说的范围从数百至一万多（u/ml）都有。导致这种差别的原因可能是不同类的菌种，不同来源的同类菌种，不同的菌株改良程度，不同的发酵工艺优化水平等等。 1.4中性蛋白酶的应用 蛋白酶在工业化应用酶中占的比例很大（超过50%），而中性蛋白酶在蛋白酶中占的比例也很大。占比大的原因之一是应用范围大而广。以中性蛋白酶为例，它可用于皮革业提高皮革的质量；可用于牙膏帮助清除牙渍；可用于饲料以提高消化吸收率；用于食品加工最为广泛，加入待焙烤的面团中可以调节面团筋力，加入肉类中可以使肉制品嫩化、改善口感，加入牛奶中可以加速凝乳，加入以蛋白质为主的废弃料中可以制取多种水解产品。 在蛋白酶应用中有些问题令人困惑不解值得重视，例如不同来源的蛋白酶水解蛋白质的主要位点有差别，所以即使使用同一种蛋白质原料，不同来源蛋白酶的水解产物和水解率也会有所区别；如果混合食用不同来源的蛋白酶，假如总酶量与单一蛋白酶相同，由于水解的主要位点增加，也有可能提高水解率和水解程度。 另外用于食品水解的蛋白酶还有一层要求就是风味和口味，目前主要问题是口味即苦味。尽管“风味蛋白酶”的诞生在一定程度上降低了疏水基团的外露，很大程度上减少了水解产物的苦味，不过因其高昂的价格和苦味的残留依然不能得心应手地应用。 1.5本课题的研究目的与意义 从上述内容可知，虽然蛋白酶的研究、生产与应用已相对成熟，但是还有一些问题值得研究和解决，包括为提高产酶量而进行的菌种特性的改善、发酵工艺的优化、发酵酶液的浓缩与纯化等等。其中最基础的就是菌种产酶能力的提高。 尽管前面提到各种改善菌种的现代生物技术，包括物理或化学诱变技术、细胞质融合技术、转基因技术以及克隆技术等等，有的已经相当先进。但是从成本性、发酵副产物的安全性与稳定性、实用技术的可推广性等方面考虑，对菌种进行诱变不失为行之有效和有研究价值的研究。虽然诱变
胶原蛋白酶的研究进展
胶原蛋白酶的研究进展三亿文库 设为首页收藏本站 首页考试资料幻灯片工程技术公务员考试小学教学中学教学大学教学外语资料 36胶原蛋白酶的研究进展 胶原蛋白酶的研究进展；摘要：胶原蛋白特有的三股螺旋结构使其难于被人体吸；关键词：胶原蛋白酶，作用机理，影响因素；Abstract:Thenutritionala； Keywords:collagenproteas；胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广泛的蛋白质，是；加［4］［1－3］和生物活性等特性，被愈来愈多的；[5-6]抗疲劳等生理调节功能的小肽，是极具发展 胶原蛋白酶的研究进展 摘要：胶原蛋白特有的三股螺旋结构使其难于被人体吸收，将胶原蛋白水解为胶原多肽后，可显著提高其营养及生理功能，胶原蛋白酶是一种价值很高的蛋白酶种。本文介绍了胶原蛋白酶的定义、选择、影响因素。作用机理等，并展望其研究方向。 关键词：胶原蛋白酶，作用机理，影响因素 Abstract: The nutritional and physiological function of collagen protein can be significantly improved via chemical or enzymatichydrolysis，as the collagen protein was difficult to be absorbed by human body due to the triple helical characteristic molecules structure. Collagen protease is a kind of high value of protease. In this paper, introduces the definition of collagen enzyme, selection, influence factors, mechanism etc. The future development direction it was also prospected. Key words: collagen protease, mechanism, influence factors 胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广泛的蛋白质，是一种与组织和器官功能密切相关的功能性蛋白。胶原蛋白的低免疫原性、生物相容性、生物降解性 加［4］［1 － 3］和生物活性等特性，被愈来愈多的消费者所认识。胶原蛋白制品已被广泛应用于食品、保健食品、化妆品、医药等领域，市场需求急剧增。天然胶原蛋白经蛋白酶水解后，可得到具有抗氧化、降血压、降血脂、免疫调节、激素调节、 [5-6]抗疲劳等生理调节功能的小肽，是极具发展前景的功能因子，也是当前医药、食品界最热门的研究课题之一。 胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构，三条链相互平行而且由链间氢键相连，具有十分稳定的性质，一般的加工温度及短时间加热都难使其分解，因此难被人体吸收，食用利用率较低[7]。将胶原蛋白水解为胶原多肽后，其营养及生理功能可显著提高：蛋白质消化吸收率几乎达100％，能保护胃黏膜以及抗溃疡，促进皮肤胶原代谢，抑制血压上升，对关节炎等胶原病具有很好的预防及治疗作用，能促进钙吸收和降低血清中胆固醇含量等[8]。寻找一种高效的降解胶原蛋白的酶也成为了当今的一个热门课题。 1 胶原蛋白酶的定义和选择 1.1 定义 胶原蛋白酶(Collgaenolytci protease)定义为在适当的pH 和温度下，只切割活性胶原螺旋区或明胶而不作用于其他蛋白底物的酶类 1.2 酶的选择 能使胶原蛋白酶解的酶类较多。按照作用位点可以分为内切酶和外切酶；从来源上可分为植物蛋白酶(如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、动物蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）、微生物蛋白酶(如枯草杆菌1.398、放线菌166 等)；此外，较常用于水解的蛋白酶还有风味复合酶等。在实际应用中，酶的选取通常要考虑三个方面：一是酶对胶原蛋白作用的强度；二是酶的价格；三是水解产物的要求。如果酶对胶原的作用太弱，则无法得到高的胶原水解率，而酶的纯度直接影响酶的价格，纯度较高的酶与工业用酶的价格往往相差甚远。因此开发的产品如没有特殊要求，一般可以考虑选择用已完全工业化的酶。除此之
中性蛋白酶活性测定试剂盒使用说明
中性蛋白酶活性测定试剂盒使用说明 分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC2290 规格：50T/24S 产品内容： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加10mL蒸馏水溶解。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入10mL试剂一，沸水溶解。 试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加50mL蒸馏水溶解。 试剂五：液体×1瓶，4℃保存。 标准品：液体×1支，0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。 自备仪器和用品： 可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、1.5mL EP管和蒸馏水。 产品说明： NP在一定的温度和中性pH条件下，催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点，中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。 中性条件下，NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在680nm有特征吸收峰。 操作过程： 一、粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。 2.血清或培养液：直接测定。 3.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 二、测定操作： 1.分光光度计预热30min，调节波长到680nm，蒸馏水调零。 2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。 3.对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂二，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂三，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm 测定光吸收，记为A对照管。 4.测定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂三，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂二，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm 测定光吸收，记为A测定管。（注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二） 5.空白管：取EP管，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A空白管。 6.标准管：取EP管，加入200μL标准品，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A标准管。注意：空白管和标准管只需要测定一次。 三、计算公式： 1.按照样本蛋白浓度计算 NP活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
常见蛋白酶抑制剂
当前位置：生物帮 > 实验技巧 > 生物化学技术 > 正文 蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全 日期：2012-06-13 来源：互联网 标签： 相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展 摘要: 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度 恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 蛋白酶抑制剂 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。 常用抑制剂 PMSF 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 2)10mg/ml溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; 4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA 1)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5mol/L水溶液，pH8~9;
木瓜蛋白酶研究进展
食品酶学课程论文 题目木瓜蛋白酶研究进展 姓名孟超学号2010309110045 专业食品科学评分 中国·武汉
二○一○年一月 木瓜蛋白酶研究进展 摘要：木瓜蛋白酶是一类巯基蛋白酶，大量存在于木瓜乳汁中。对其组成成分、结构、制备、固定化、在非水介质中的特性及在医药上的用途等方面的研究进展进行了综述。 关键词：木瓜蛋白酶；固定化；医药用途 Abstract: Papain is a sulfhydry lprotease from the latex of the papaya fruit. The paper summarized the research development abou t it’s composition,structure, processing, immobilization, properties in non-aqueous medium and uasage in medicine. Keywords: Papain; Immobilization; Uasage in medicine 前言 木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。 1.木瓜蛋白酶的组分 工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶[EC 3.4.22.2](papain)、木瓜凝乳蛋白酶[EC 3.4.22.6](chymopapain)、木瓜蛋白酶Ω[EC 3.4.22.30](papaya proteinaseΩ，也称papaya peptidase A、papaya proteinase Ⅲ、earieain)、木瓜凝乳蛋白酶M [EC3．4．22．25](chymopapain M也称glycylendopeptidase、papaya