钙蛋白酶系统研究进展_梅承君

钙蛋白酶系统研究进展

梅承君1,庞辉2,康相涛1*,孙桂荣1(1.河南农业大学,河南郑州450000;2.河南省公安厅,河南郑州450000)摘要阐述了钙蛋白酶系统的分类、结构,并且综述钙蛋白酶系统的一般生物学功能及影响因素。

关键词钙蛋白酶;钙蛋白酶抑制蛋白;钙蛋白酶激活蛋白;嫩度

中图分类号Q55文献标识码A文章编号0517-6611(2006)22-5774-03

Research Adva nce in C alpain System

MEI C heng-jun et al(Hen an Agricul tu ral University,Zhen gzh ou,Henan450000)

Abstract This paper revie wed th e classi ficati on and structu re of cal pain sys tem,the general biological function and its affecting factors. Key w ords C alp ain;Cal pas tatin;Calpain activator;Tenderness

钙蛋白酶是1964年由Guroff首次发现,1972年Bush等首先在骨骼肌中确认,1976年Da yton等对其进行纯化。钙蛋白酶被鉴定、纯化后,其名称有钙活化中性蛋白酶(Calcium a ctiva te d ne utra l prote ase,Calcium ac tiva ted ne utral SH prote ase, c alpain)简写为CANP(EC,3,4,22,17)、钙激活酶(Ca2+-a ctiva t-ed enzy me)、钙激活中性蛋白酶(Calcium a ctiv ate d ne utral pro-te ase)等。1983年Go ll等提出钙蛋白酶在骨骼肌肌丝蛋白降解过程中起关键作用[1]。目前,已证明它广泛地分布于绝大多数动物的细胞中。在一定浓度的钙离子作用下,钙蛋白酶主要作用于细胞骨架蛋白、蛋白激酶和磷酸酶,还参与细胞内的信号传递[2]。

1钙蛋白酶系统

1.1钙蛋白酶的分类Calpain中的Cal代表钙调蛋白(Ca-l moclulin),pain代表木瓜蛋白酶(Pa pain)。Calpain由钙调蛋白和木瓜蛋白酶两者以非共价键结合而成。钙蛋白酶系由多种同工酶构成。根据分布特点可将其分为组织特异性和非组织特异性蛋白酶两大类[3]。目前研究比较深入的是非组织特异性蛋白酶,已知的2种非组织特异性同工酶是Ca-l pain1和Ca lpain2。Ca lpain1可被L mol水平的钙离子激活,又称L-Calpain;Ca lpain2可被mmol水平的钙离子激活,又称m-Calpain。除活化时需要的钙离子浓度不同和结构略有差别以外,这2种同工酶生化和催化的性质几乎完全相同。红细胞内仅含有Calpain1,其余的哺乳动物细胞中均含有2种形式的钙蛋白酶。由于细胞内钙离子的波动在微摩尔(L mol)浓度水平以下,所以Ca lpain1很可能在正常生理条件下发挥功能,而Calpain2则可能在病理情况(细胞内钙超载条件)下才能激活[4]。

1.2钙蛋白酶系统的结构[5]

1.2.1钙蛋白酶的结构。钙蛋白酶系中L-Calpain和m-Ca-l pain由不均一的二聚体蛋白构成,其大、小亚基的分子量分别为80和30kD。Calpain3、8a、9、11、12和13也都分别由大、小2个亚基构成。大亚基具有催化活性,L-Ca lpain和m-Ca-l pain的大亚基分别由CANP1和CAN P2基因编码;小亚基具有调节功能。尽管L-Calpain和m-Calpain大亚基氨基酸

基金项目国家/8630计划资助项目(2002AA242021);河南省重大科技攻关项目(022*******,0322010600);河南省高校杰出科研人才

创新工程项目(2000KY CX005)。

作者简介梅承君(1979-),女,河南焦作人,硕士研究生,研究方向:家禽育种。*通讯作者。

收稿日期2006-08-09序列有明显差异,但是其高级结构基本相同,都由4个结构域组成,从N端起分别命名为?、ò、ó、?结构域。在大亚基中,结构域?由1~80位氨基酸残基组成,约占全部分子的10%,在蛋白酶激活的情况下很容易发生自溶,由此推测其可能起钙蛋白酶的活性调节作用,L-Calpain和m-Ca lpain仅在结构域?中不同;结构域ò含有81~330位氨基酸残基,约占全部分子的35%,是表现钙蛋白酶水解活性的关键部位,在未被激活的条件下含有2个次级区域[6];结构域ó由331~560位氨基酸残基组成,约占全部分子的35%,其功能为结合钙离子和磷脂,与蛋白酶调控亚基或其他调控蛋白有关;结构域?由561~705位氨基酸残基组成,占全部分子的20%,是结合钙离子的部位,含有4个钙结合蛋白所特有的EF-手型结构(1个EF-手型结构包含2个与钙离子结合环相连的氨基酸螺旋)[7]。L-Ca lpain、m-Calpain、Ca lpain9的小亚基含有2个结构域,这2个结构域由一段富含脯氨酸的序列相连,其中结构域ò与大亚基的结构域?相同,含有4个可以结合钙的EF-手型结构,故也具有结合钙的活性[8]。在其他钙蛋白酶中,如Calpain3、8a、11、12、13,尽管其大亚基也有结构域?,但其大、小亚基之间并没有相互联系。Ca lpain5、6、7、8b、10、15为非典型的钙蛋白酶,其部分结构域缺失或被取代,没有结构域?,因此推测其大、小亚基间也不存在联系。

1.2.2钙蛋白酶抑制蛋白的结构。钙蛋白酶抑制蛋白(Ca-l pastatin)是细胞内专一抑制钙蛋白酶活性的蛋白质。通过抑制钙蛋白酶活性,可抑制肌肉内蛋白质降解,参与肌肉生长过程中蛋白质的更新。在屠宰后的动物体内,它可抑制钙蛋白酶的活性,从而明显影响肉的嫩度。它可以识别钙蛋白酶与钙结合引起的构象变化,并与之特异性结合。钙蛋白酶抑制蛋白通过抑制钙蛋白酶的自溶作用而发挥作用,且该抑制作用不受pH值的影响。钙蛋白酶抑制蛋白共由5个部分(?、ò、ó、?、?)组成,其中4个是钙蛋白酶抑制蛋白的活性中心。当钙蛋白酶被钙离子激活后,如果附近有钙蛋白酶抑制蛋白存在,则将迅速与之结合而抑制蛋白酶活性,从而保证钙蛋白酶对底物只进行局部的特定位点的水解。

目前对钙蛋白酶抑制蛋白的生化性质了解的还不十分清楚。根据钙蛋白酶抑制蛋白在SDS电泳中的行为,可将其分为70和110kD两种类型。70kD类型主要存在于红细胞中,110kD类型存在于肝、心脏和其他组织中。虽然这2种钙蛋白酶抑制蛋白分子大小不同,但它们的功能性质相似。

安徽农业科学,Jou rnal of Anh ui Agri.S ci.2006,34(22):5774-5776责任编辑刘月娟责任校对孙能森

1.2.3钙蛋白酶激活蛋白。钙蛋白酶激活蛋白(Calpain act-i va to r)是钙蛋白酶系统的一个新成员,是细胞内存在的另一个钙蛋白酶调节因子。钙蛋白酶激活蛋白是由Ge or ge等首次发现的。Melloni等发现牛脑中钙蛋白酶激活蛋白的分子量为30kD,分子结构为二聚体,其氨基酸顺序与羊肝脏蛋白UK114几乎一样,与小鼠HR12蛋白相似。

钙蛋白酶激活蛋白是一种热稳定性蛋白质。从不同动物细胞中提取的激活蛋白对钙蛋白酶的激活作用不同。具体来说,钙蛋白酶激活蛋白可以明显提高钙蛋白酶的活性,降低钙蛋白酶激活所需的Ca2+浓度,减弱钙蛋白酶抑制蛋白的抑制作用,提高钙蛋白酶对膜的吸附性。

目前国外有关钙蛋白酶激活蛋白的研究正在兴起,但国内此类报道较少。常泓等利用PCR方法,根据Ir ma Colo mbo 等报道的UK114的cD NA序列克隆了钙蛋白酶激活蛋白cD-N A序列[9]。

2钙蛋白酶系统的一般生物学功能

2.1钙蛋白酶系统在骨骼肌生长中的作用提高畜禽瘦肉率对于畜牧业生产具有非常重要的经济意义。肌肉蛋白的增加取决于肌肉蛋白的合成速度和降解速度。研究表明,过量钙蛋白酶的表达可引起肌细胞肌原纤维的降解,而钙蛋白酶抑制蛋白的大量表达又会抑制肌细胞的分解。

哺乳动物骨骼肌肌原纤维呈圆柱状,直径1~3L m,高1~40mm,而溶酶体或胞质蛋白酶直径约16nm,高约11n m。因此,肌原纤维蛋白质降解的第1步是肌原纤维解装配成肌丝。大量研究表明,钙蛋白酶系统参与了这一解装配过程。钙蛋白酶主要集中于Z盘,因此降解从该处开始。首先,钙蛋白酶降解肌联蛋白(Titin)和伴肌动蛋白(Ne bulin),这2种蛋白具有将N、C末端分别与Z盘牢固连接的功能;同时,也降解一些肌原纤维骨架蛋白,如肌纤维蛋白(D esmin)和细丝蛋白(Fila min)等,使骨架蛋白肌纤维释放肌丝;然后,释放出的粗肌丝和细肌丝可与母体或其他肌原纤维重新装配,也可被胞质蛋白酶或溶酶体降解[10]。总之,钙蛋白酶参与骨架蛋白的降解,是蛋白质水解过程中的限速步骤。

2.2钙蛋白酶系统与肉质嫩度的关系

2.2.1肉质的嫩化。嫩度是肉品质的重要指标,同时也是肉最重要的感官特征。导致肉质嫩度不同的主要因素有肌节的长度、肌肉脂肪结缔组织的含量及肌肉结构蛋白的水解敏感性[11]。贮藏期,骨骼肌发生一系列变化,导致组织完整性丧失,嫩度提高。变化过程包括Z盘弱化,肌动蛋白和肌球蛋白间的僵直联结弱化,肌联蛋白(Co nnec tin)细丝断裂,伴肌动蛋白(Ne bulin)细丝断裂。

2.2.2钙蛋白酶嫩化机理。研究发现,在肌肉组织中钙蛋白酶系统控制着肌纤维蛋白的降解,是肌肉蛋白质降解的限速步骤。因此,钙蛋白酶系统在肉的嫩化中起着重要作用。

动物活体内大部分钙离子贮存在肌浆网内,游离钙离子浓度仅为0.2L mol/L,但宰杀后体内A TP逐渐耗尽,肌浆网失去保留钙离子的能力,使钙离子外泄,肌浆中钙离子的浓度升高,钙蛋白酶被激活。在整个成熟过程中,m-Calpain的活性几乎没有发生变化,而L-Calpain的活性则显著增加,因此L-Ca lpain被认为是肉质嫩度的候选基因[12]。同时,作为钙蛋白酶的内源抑制剂,钙蛋白酶抑制蛋白也参与了肌肉嫩化过程。

参与蛋白降解过程的酶有多种,如溶酶体组织蛋白酶、多催化蛋白酶复合体(MCP)和钙蛋白酶。所以,虽然肉质嫩化过程中的蛋白降解理论已被多数人接受,但究竟何种酶在蛋白降解中发挥主要作用仍处于争议中。尽管钙蛋白酶系统调节肌肉嫩化的具体机制还不是很清楚,但大量研究证明钙蛋白酶是重要的蛋白降解酶体系,它在肉的成熟嫩化中发挥决定性作用。动物宰杀后,细胞中钙离子浓度提高,钙蛋白酶活性加强;钙离子对MCP的活性不起作用;钙离子不仅不激活组织蛋白酶,反而钝化其活性。

2.2.3钙蛋白酶抑制蛋白对肉质嫩度的影响。钙蛋白酶作为影响嫩度的候选基因参与宰后肌肉降解过程。钙蛋白酶抑制蛋白基因通过抑制钙蛋白酶的活性而影响嫩度性状。前人对钙蛋白酶系统的研究主要集中在钙蛋白酶抑制蛋白基因c DN A序列克隆、部分内含子的酶切及其与肉质性状关系等方面。钙蛋白酶抑制蛋白基因参与肌肉生长过程中蛋白质的代谢更新,从而影响肌肉的嫩度。Jolanta等对钙蛋白质抑制蛋白基因在猪种中的多态性进行了分析,并对该基因多态性与屠体性状的相关性进行了研究。国内学者的研究主要集中于钙蛋白质抑制蛋白基因多态性与肉质性状尤其是嫩度的相关[13]。

2.3钙蛋白酶系统的病理激活机制

2.3.1理论基础。钙蛋白酶不仅参与正常细胞内级联信号转导,而且与局部缺血、老年性痴呆症、白内障、肌肉萎缩、脓毒、炎症、关节炎等疾病相关联[14]。

国际学术界十分重视钙蛋白酶及其抑制剂的生物学特性、可能的生理功能、作用与病理生理机制等研究。钙离子作为细胞内的第二信使,在其介导的各种基本细胞活动中起重要作用,而钙蛋白酶在生物学体系中是钙离子信号的特异受体。在实验性脑外伤、脑缺血、脊髓损伤等神经元的退变过程中,细胞内钙离子内稳态被破坏,导致钙超载,从而激活钙蛋白酶,产生不可逆地降解底物,细胞骨架蛋白降解和丢失,引起细胞的调亡、坏死。因此,细胞内钙离子超载是造成细胞不可逆损伤的最终通路,是引发脑外伤、脑缺血等继发性损伤的主要原因之一[15]。钙蛋白酶的病理性激活在神经组织中产生严重的兴奋性氨基酸毒性作用,诱发一系列病理过程,加剧了继发性脑损伤的危险性,是神经元死亡的重要病理过程。

2.3.2钙蛋白酶抑制剂及其在疾病治疗中的作用。钙蛋白酶内源和外源抑制剂超过50种,包括存在于细胞内或细胞外的蛋白质和药物,如碘醋酸盐、碘乙酰胺和N-乙基-顺丁烯二酰亚胺等,是半胱氨酸蛋白酶的抑制剂。细胞内钙蛋白酶抑制蛋白的水平与钙蛋白酶的活性直接相关。钙蛋白酶抑制蛋白与已被激活的钙蛋白酶的亲和力强于其与酶原的亲和力[16]。钙蛋白酶抑制蛋白的抑制效率及其在细胞内的水平对预防由钙蛋白酶引起的损伤起重要的作用,同时骨骼肌和细胞内钙蛋白酶抑制蛋白的磷酸化将改变其抑制效率和抑制特性。该抑制剂可能对由钙蛋白酶引起的疾病有治疗作用[17]。

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34卷22期梅承君等钙蛋白酶系统研究进展

在治疗由钙蛋白酶引起的疾病时,钙蛋白酶抑制剂可发挥以下作用:1钙蛋白酶抑制剂可以抑制钙蛋白酶的激活,为神经组织损伤后的神经元作用提供一个较长的治疗时间窗,为临床救治争取到宝贵的时间;o钙蛋白酶抑制剂可以明显提高治疗效果,减少脑缺血损伤动物模型中细胞骨架蛋白降解和缺失,对于兴奋毒性作用引起的神经功能破坏有明显的保护作用。

3影响钙蛋白酶系统的因素

3.1温度与p H值钙蛋白酶有很宽的p H和温度作用范围,最佳温度为25e,最佳p H值为7.5。即使在5e,pH分别为5.5和5.8的条件下,钙蛋白酶还分别具有最佳活力的24%和28%[18]。

3.2化学因素

3.2.1Ca2+。钙蛋白酶的激活需要一定的钙离子浓度。为了充分激活钙蛋白酶,可采用动脉注射或肌肉注射CaCl

2

溶液的办法以提高肉中钙离子浓度,从而激活钙蛋白酶,加速肉的成熟过程。

3.2.2Z n2+。Zn2+可以抑制钙蛋白酶的活性。离体试验发现,50L mol/L Z nCl2对钙蛋白酶的抑制率为100%。但是, Zn2+对钙蛋白酶活性的抑制是可逆的。用透析法除去Zn2+后,钙蛋白酶可恢复原有活性。

3.2.3B-肾上腺素。B-兴奋剂会增加肌肉生长速度,并伴随着钙蛋白酶抑制蛋白活性的显著增加。该现象表明,钙蛋白酶抑制蛋白的增加会导致钙蛋白酶抑制作用的增加和肌肉蛋白更新的减少。

3.2.4磷脂。激活钙蛋白酶所需的钙离子浓度大于10-6 mol/L,而正常情况下细胞内钙离子在10-6mol/L以下,不足以激活钙蛋白酶。研究表明,磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇能降低钙蛋白酶自溶所需要的钙离子浓度。因此,细胞膜对该酶有激活作用[19]。

3.3高压钙蛋白酶系统的支持酶是钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白。在高压下,这些蛋白质可能会发生某些分子构象变化。这些变化有的是可逆的,在压力解除后可以恢复;有些则可能是不可逆的,引起酶活性的变化,表现为被激活或者失活。靳烨等研究表明,钙蛋白酶对250MPa以下的压力有一定的耐受性,而钙蛋白酶抑制蛋白在100MPa以上的压力条件下就有较大的失活[20]。由于钙蛋白酶抑制蛋白的压力失活速度远大于钙蛋白酶的失活速度,因此高压处理并不降低钙蛋白酶的总体活性和降解蛋白质的能力。试验结果也证明了高压处理对钙蛋白酶本身活性没有激活作用。4展望

肌肉蛋白质的增加是一个动态平衡的过程。钙蛋白酶系统在蛋白质降解方面起着重要的作用,控制蛋白质降解就可以提高肌肉生长速度。所以,利用分子生物学手段,筛选出控制钙蛋白酶系统的基因,并且通过育种手段培育出肌肉蛋白沉积快、肉品质高的畜禽品种,以更好地满足市场需要。另外,对钙蛋白酶系统的进一步研究可以提供更多治疗与该系统有关疾病的方法。

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科技论文写作规范)))材料与方法

清楚地交代出试验设计、研究对象及研究方法等。研究对象如品种、肥料、农药、土壤、病虫害等名称应交代清楚;还应交代试验必要的范围、重复次数及样本大小。对一般的研究方法注明出处即可,如采用@@@方法[2]([2]为在参考文献中的序号)。对于有所改进或新的方法要详细叙述,以便他人重复。

5776安徽农业科学2006年