钙蛋白酶系统与肌肉增长及嫩度的关系

收稿日期：2002-05-16

作者简介：金海丽（1979-），女，浙江义乌人，浙江大学华家池校区饲料所在读硕士生，主要从事动物营养与饲料科学研究。

浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis 14（6）：354～359，2002

钙蛋白酶系统与肌肉增长及嫩度的关系

金海丽，许梓荣

（浙江大学饲料科学研究所，浙江杭州310029）

摘

要：钙蛋白酶系统主要由钙蛋白酶（μ-calpain ，m-calpain ）

及钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin ）组成，calpain 是存在于细胞质中的依赖于Ca 2+的中性蛋白酶，calpastatin 是钙蛋白酶的内源抑制蛋白。近年的研究表明，calpain 是细胞质中主要的蛋白水解酶，在肌原纤维蛋白降解中起着重要的作用。肌肉增长和宰后嫩度的变化与蛋白质水解程度密切相关。因此，钙蛋白酶系统的活性会影响畜禽肌肉增长和肉的嫩度。本文综述了钙蛋白酶系统各种酶的结构、作用、活性调节及与肉质的关系。关键词：钙蛋白酶系统；结构功能；活性调节；肌肉增长；嫩度中图分类号：S813.24

文献标识码：A

文章编号：1004-1524（2002）06-0354-06

The relationship between calpain system and muscle growth and meat tenderness ：JIN Hai-li ，XU Zi-rong （Feed Science Institute ，Zhejiang University ，Hangzhou 310029，China ）

Abstract ：Calpain system consists of μ-calpain ，m-calpain ，the calcium-dependent neutral proteases ，and their endogenous inhibitor ，calpastatin.Calpain system is probably the major proteolytic in protein degradation ，which plays an important role in myofibrillar protein degradation.The muscle growth and postmortem tenderiza-tion of meat are highly related to the degree of proteolysis ，so the activity of calpain system has an effect on muscle growth and meat tenderness.This paper reviews the structure ，function and regulation of calpain system and the relationship between calpain system and muscle growth and meat tenderness .

Key words ：calpain system ；structure and function ；activity regulation ；muscle growth ；tenderness

提高家畜瘦肉率和产出对畜牧业来说具有非常重要的经济意义。肌肉蛋白质的增加取决于肌肉蛋白合成速度和降解速度。研究发现，过量calpain 表达可引起成肌细胞肌原纤维的降解，而calpastatin 表达量的增加会抑制肌肉蛋白质水解。骨骼肌蛋白降解的途径有三条：溶酶体组织蛋白酶途径、依赖钙的蛋白酶途径和依赖ATP 的蛋白质途径。在肌

肉组织中，钙蛋白酶系统控制着肌纤维蛋白

的降解，是肌肉蛋白质降解的限速步骤［1］。

因此，钙蛋白酶系统有可能在肌肉发育中起着调控作用。

肉的嫩度是肉品质的一个重要方面。影响肌肉间肉嫩度的主要因素有肌节的长度、结缔组织的含量及肌肉结构蛋白的水解敏感

性

［2］

。目前研究主要集中在第3个因素，宰后肌肉嫩度与肌肉蛋白质的降解量密切相

关，具有水解蛋白的特性钙蛋白酶系统毫无疑问会影响宰后肉嫩化，除此之外嫩度还与畜禽的遗传因素和肉的种类等因素有关。研

究发现，钙蛋白酶系统在肉的嫩化，改善肉质中起着重要的作用［3］。

1钙蛋白酶系统的结构及功能

1.1钙蛋白酶结构

根据钙蛋白酶（calpain）表现半最高活性所需的Ca2+浓度的不同，可以将普遍存在的calpain分为两种，一种为μ-calpain（又称cal-painⅠ）激活所需Ca2+浓度为微摩尔级，另一种为m-calpain（又称calpainⅡ）激活所需Ca2+浓度为毫摩尔级。它们都由两个亚基组成，其中30kDa小亚基在两种calpain中是相同的，是单个基因的产物，而80kDa大亚基则是不同基因的产物。两种calpain都具有水解肌原纤维蛋白的活性。

1.2钙蛋白酶抑制蛋白的结构

钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）是胞内专一抑制calpain活性的蛋白质，它可以识别calpain与钙结合引起的构象变化并与之特异性结合。calpastatin共有5个结构域，其中4个是calpastatin的活性中心所在，具有相似的重复单位，重复区域具有相当保守的30个氨基酸序列，都包含有Thr-Ile-Pro-Pro-X-Tyr-Arg，因此它可能是calpastatin起作用的关腱部位。X则代表不同的氨基酸，其对calpas-tatin的活性也起着一定的作用［4］。

1.3钙蛋白酶系统结构与活性关系

当calpain的大小亚基相结合时，其不具有活性。Yoshizawa等发现calpain经Ca2+激活后，其大小亚基分离，因此，认为小亚基有可能主要起调节的作用，大亚基起催化调节作用。calpain一旦发挥水解特性［5］，分离后30kDa小亚基则迅速降解为17kDa。80kDa 的calpain一般不具有活性，只有当其转化成78kDa再变成76kDa的自溶形式时方具有活性，尔后迅速降解而失去酶活性［6］。由于calpain在自溶后才表现活性，因此calpain可以看成是一个酶原，而calpain活性下降则表

明其在水解中起作用。

有关calpastatin的分子量大小的报道都不尽一致，但其在宰后肌肉中也会发生降解，且降解后的calpastatin同样具有抑制calpain 的活性［7］。

2钙蛋白酶系统对肌原纤维的作用最近的研究表明，calpain的作用可能仅在细胞内蛋白质的降解过程中起调节作用，而并非整个降解过程的直接参与者。体外试验表明，calpain能降解肌原纤维骨架蛋白，如结合蛋白（desmin）、丝蛋白（filamen）、C-蛋白、原肌球蛋白（tropomyosin）、肌原蛋白T（tro-ponin-T）、连接蛋白（titin）、nebulin、vinculin等，但不降解α-肌动蛋白（α-actin）、肌球蛋白（myosin）及α-辅肌动蛋白（α-actinin）［7］。因此，推测calpain可能通过对肌原纤维蛋白进行特异的局部降解而对其结构、功能进行调控［5］。calpain导致肌肉降解可分为两步：首先其攻击肌原纤维的肌节（两个相邻Z盘之间的一段肌原纤维）部位，释放肌丝使降解为小片段，然后被溶酶体所捕获而进一步降解。

calpain主要集中于Z盘，因此认为，降解从此处开始。但近期研究发现，calpain首先水解的是N2线，据报道N2线是titin和nebu-lin丝蛋白所在区域，它们分别连接粗肌丝和细肌丝，最终通过I带伸向Z盘。在降解N2线的同时也会降解一些骨架蛋白如desmin，使肌纤维释放肌丝［9］。细肌丝的肌原蛋白和原肌球蛋白及粗肌丝的C-蛋白降解，分别解离出肌球蛋白和肌动蛋白。释放出的粗肌丝和细肌丝可与母体或其它肌原纤维重新装配，也可被胞质蛋白酶或溶酶体降解。cal-pain参与骨架蛋白的降解是这蛋白质水解过程中的限速步骤。

3钙蛋白酶的活性调节

3.1钙蛋白酶的激活调节

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calpain是钙依赖蛋白，只有在Ca2+的存在情况下方有活性，在体现水解活性时其大

致发生以下4个过程的变化：（1）calpain大小亚基的分离；（2）小亚基的自溶；（3）大亚基自溶；（4）calpain构象发生变化而表现蛋白水解酶活性。Calpain受激活后最终呈自溶状态，而表现活性。calpain受Ca2+浓度调控，高Ca2+浓度能加速calpain的活化。

除了Ca2+浓度，calpain的活性还受离子强度、pH、底物等因素的影响。m-calpain和μ-calpain的水解活性随着离子强度增加而降低，但趋势并不明显，这可能是因为酶的聚合或Ca2+-calpain复合物稳定性降低；随着pH 值的增加，μ-calpain水解活性增加；底物存在时，calpain的活性下降的要慢，且不同底物作用下calpain的活性表现会有所不同［10］，其机理还不甚清楚，可能与calpain自溶状态的稳定性有关〔6〕。

3.2calpain的抑制调节

3.2.1不可逆抑制剂及作用原理这些抑制剂可以以共价腱的方式与酶的某些基团牢固结合，而使酶失去活性。calpain是一种含巯基的酶。因此，碘乙酸、碘乙酰胺、E-64等可对calpain发生不可逆抑制作用。

3.2.2过渡态类似物抑制剂及原理μ-cal-pain和m-calpain作用于底物的特异性切割位点基本是一致的，大量试验表明，calpain切割位点P

1

最佳为精氨酸、组氨酸、酪氨酸或

甲硫氨酸残基，P

2

最佳为亮氨酸或缬氨酸残

基，且P

2

被认为是决定位点。但切割位点是由多个因素决定的，如切割位点两端的氨基酸残基，离切割位点附近的氨基酸残基和底物的其他结构特征等［3］。李昭昭改变二肽P1位氨基酸残基、末端氨基保护基、酯基，发现这些改变都会引起抑制能力变化，进一步证实了前者的观点。

根据这些特性，研究人员通过人工合成一些多肽以抑制calpain的活性，如Leupeptin （丙酰基/乙酰基-L-leu-L-leu-L-arg）、三肽氯甲基酮（Leu-Leu-Phe/Lys/Tyr-CMK）二肽、三肽α-酮酸酯（Ph2CHCO-Leu-Abu-COOEt，2-NapCO-Leu-Leu-Abu-COOEt）。这些对calpain 的抑制能力都大于典型的氯甲基酮抑制剂如tosyl-Phe-CH2Cl。这可能是因为它们在P2位点都含有亮氨酸，说明P

2

位氨基酸残基是calpain重要的识别位点［3］。

3.2.3calpastatin的调节calpastatin是高效的，十分专一的calpain活性抑制蛋白。当calpain被Ca2+激活后，如果附近有calpastatin 存在，将迅速与之结合，而抑制calpain活性，从而保证calpain对底物只进行局部的特定位点的水解。这可能是因为calpastatin对μ-calpain的自溶稳定性的影响。80kDa亚基的μ-calpain首先转化为78kDa后为76kDa的自溶产物，再进一步自溶而失活，calpastatin 能抑制μ-calpain一系列的变化且成剂量依赖性关系。而自溶作用是钙蛋白酶表现活性的重要步骤，由此可见，calpastatin是通过抑制calpain的自溶作用而发挥作用的，且这种抑制作用并不受pH的影响［11］。

4钙蛋白酶系统与肉质的关系

4.1钙蛋白酶系统与肌肉增长的关系

众所周知，β-肾上腺素兴奋剂（β-兴奋剂）能够提高动物的生长性能和胴体组成。研究发现，饲喂β-兴奋剂（L-646，969）的羊其股二头肌中m-calpain，calpstatin的活性比对照组分别提高了24.6%，62.8%，而μ-calpain 活性并没有发生变化［12］。可见，促使蛋白质降解的减少，导致肌肉增长。

具有显型臀部丰满（callipyge）基因的羊，其饲料利用率和胴体的组成都要优于普通羊。就24周龄的Callipyge羊而言，其股二头肌、半膜肌、背最长肌和半腱肌重量都要比普通羊分别高出42.1%，38.3%，32.1%和26.4%，而岗下肌和岗上肌重量在两类型之

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金海丽等：钙蛋白酶系统与肌肉增长及嫩度的关系

间，重量并没有发生改变。与之相对应，钙蛋白酶系统中calpastatin的活性也随着肌肉质量的增加而升高。在股二头肌、半膜肌、背最长肌中calpastatin的活性比其在普通羊中的活性分别提高了124%，126%，106%，在岗下肌和岗上肌中其活性并没有什么不同。Cal-lipyge羊其肌肉重量与calpastatin活性的相关系数达0.96［13］。因此，可以认为蛋白质水解率的降低主要可能是钙蛋白酶内源性抑制蛋白酶calpastatin增高的结果。

4.2蛋白酶系统与嫩度的关系

宰后肉的嫩化现象是非常普遍的，cal-pain表达减少以及calpastatin表达量的增加都会导致肌肉蛋白水解率及宰后肉嫩度的下降，这表明calpain水解作用是导致肉的嫩化主要因素。μ-calpain和m-calpain都能水解肌原纤维，但在宰后成熟的过程中m-calpain的活性几乎不变，而μ-calpain的活性则显著下降。钙蛋白酶活性下降则是其发挥水解作用的体现，因此，更普遍的观点认为，是μ-cal-pain而不是m-calpain参与了肉的嫩化，这可能是因为活体中细胞内的Ca2+浓度太低（100μm）而不足以激活m-calpain［14］。

钙蛋白酶系统调节肌肉嫩化具体机制还不甚清楚，可能比较复杂。E.F.Delgado 等［13］研究发现肉的嫩化与calpastatin活性及降解速度有关，而与μ-calpain、m-calpain的活性及降解速度没有明显的关系。T.D.Pringle 等［16］用Angus（A）和Brahman（B）及其杂交牛为对象进行试验，发现μ-calpain的活性与嫩度具有相关性，而calpastatin活性与嫩度的相关性并不很明显，尽管calpastatin活性随着B 饲养型在杂交类型中比例的增加而增加，但剪切力并没有相同的趋势。该试验还表明，在钙蛋白酶系统中与嫩度最高度相关的就是calpastatin与μ-calpain的活性的比值。M.A. Ilian等［2］研究发现除了广泛表达μ-calpain 与肉嫩度有关外，肌肉组织特异表达p94对

嫩度影响也很大，其mRNA水平与肌肉的相对嫩度具有高度相关性〔r（bovine）=0.522，r （ovine）=0.706〕。而T.Parr等结果表明，p94与猪背最长肌的嫩度并没有直接的联系。

综上所述，钙蛋白酶系统的确在肉的嫩化过程中起着至关重要的作用，但究竟是哪个酶在这过程中起决定性作用，不同研究者的结果并不一致。可能的原因是：1）钙蛋白酶系统是一个复杂的、高度调控的蛋白降解体系；2）所用的实验方法的不一致；3）各酶的不稳定性，在提取过程中活性降低。

4.3与calpain活性有关几种物质对肉嫩度

的影响

4.3.1CaCl2对肉嫩度的影响calpain受Ca2+浓度的激活，而活体细胞内的Ca2+浓度一般不能激活m-calpain。CaCl

2

能使肉变嫩的原理可能是其能够同时快速激活肌肉中μ-calpain和m-calpain的活性，且克服了cal-pastatin抑制作用，研究发现钙能降低calpain 系统中各种酶的活性。μ-calpain和m-calpain 的活性降低说明其对肌原纤维的水解增加，calpastatin活性降低则说明其抑制calpain的能力下降。Whipple等［14］认为这有可能是因为在钙浓度足够高的情况下能激活m-cal-pain，增加calpastatin的水解从而使calpastatin 的调节能力降低。

T.D.Pringle等［16］在肌肉中注射CaCl2以

研究其改善肉嫩度的情况，结果表明CaCl

2能同时降低calpain系统中3种酶的活性，μ-calpain，m-calpain和calpastatin的活性分别降低了75%，77%和34%，而相应的肉的剪切力也都明显的下降。因此，可以认为，钙能激活钙蛋白酶系统从而改善肉质。

4.3.2Vitamin D3对肉嫩度的影响Swanek

等［18］研究发现VD

3

能够明显改善宰后牛背最长肌的嫩度，屠宰前7天添加5×106IU的VD3的牛与对照组相比其背最长肌的剪切力

下降了0.58kg。这有可能是因为VD

3

能够

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动员骨骼中的钙、刺激小肠中钙的吸收以及促进肾小管重吸收钙，从而使血清中Ca2+的浓度增加。且VD

3

还能通过激活Ca2+的通道，增加Ca2+在骨骼肌中的流量最终使骨骼肌中钙的浓度升高约0.53mmol/L。此时Ca2+的浓度足可以激活钙蛋白酶系中的cal-pain导致肉嫩度的增加［17，18］。

4.3.3焦磷酸钠（NaPPi）对肉嫩度的影响NaPPi含有多个阴离子，具有很强的缓冲能力（pH6.5～9.0），其能缓和肉中pH值降低的趋势提高肉成熟过程中的pH值。Lee S.等［19］发现在宰后的肉中注射NaPPi能显著改善肉的嫩度，与其提高肉的pH值密切相关。且NaPPi还能提高离子强度和降低肉的温度有关，这些都能增进calpain的激活，提高水解蛋白的能力从而提高肉的嫩度［19，20］。5结论与展望

β-兴奋剂虽然能显著的提高畜禽的瘦肉率，但因为其在畜禽体中残留，会危害消费者的健康，我国已禁用。但是提高家畜瘦肉率和产出对畜牧业来说具有非常重要的经济意义，因此迫切需要寻找一种新的能改善瘦肉率的添加剂。许多研究表明，calpain在肌原纤维蛋白的降解，特别是在早期肌肉转化过程中起着重要的调节作用，控制抑制其活性有可能可以抑制蛋白质的降解从而提高肌肉生长。但是现有的抑制剂除抑制calpain的活性外还或多或少的抑制其它蛋白酶的活性，缺乏专一性。而calpastatin是高效的，十分专一的calpain活性抑制蛋白，我们可以通过基因调控技术提高其在肌肉组织中的表达来抑制calpain的活性，从而达到提高肌肉生长的目的。

而且肉的嫩化与calpain的活性有关，因此可以通过激活calpain或降低calpastatin活性的方式提高肉的嫩度，改善肉质。但总的来说钙蛋白酶系统的具体调控机理还不很清

楚，还需要利用分子生物学等技术手段进行深入的研究，以便为新型、安全、有效改善肉质的添加剂开发提供理论依据。

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