基因操作原理

《基因操作原理》课程教学大纲

课程编码：13019课程名称：基因操作原理

课程英文名称：Princeples of Gene Manipulation

先修课程：生物化学、遗传学、

分子生物学等

适用专业：生物技术生物科学

总学时：56 讲课学时56 实验学时0 实习学时0总学分：3.5

一、课程性质、地位和任务

“基因操作原理”是伴随着生物学尤其是分子生物学的飞速发展而兴起的一门新学科。重点介绍基因操作中的工具酶及其种类、活性和用途；质粒载体、λ噬菌体载体和表达载体等的基本构成、种类和用途；重组DNA导入细菌和真核细胞的方法；DNA、RNA和蛋白质的分离及检测技术；定点诱变技术； PCR技术原理及其应用；cDNA文库和基因组文库的构建；分子杂交原理和技术； DNA序列分析的原理，通过Internet进行序列分析处理以及数据的获取。本门课程开设的指导思想在于使学生在掌握一般生物学以及分子生物学知识的基础上，掌握DNA重组，转移、表达和检测等技术的基本概念和基本原理，为日后从事基因工程和分子生物学研究打下技术操作方面的理论基础。”分子克隆技术”是与本课程配套的实验课程。

二、课程基本要求

能对以基因克隆和表达为主线的基因操作自行设计技术路线，要求学生随着科学研究和技术的发展，及时掌握新的知识和方法。

本课程涉及到生物学的一些重要课程，如：普通生物学、生物化学、微生物学、遗传学和分子生物学，因此要学生选修这些课程之后，再选修本课程。如果能做到理论与实验并至，将能巩固所学知识。重点要求学生掌握在核酸水平上进行研究的基本方法。

三、教学内容及安排

绪论：基因操作的理论基础（2学时）

本章重点与难点: 掌握与基因操作有关的基本概念

0.1基因的概念

0.1.1 什么是基因

0.1.2基因与其产物的共线性及非共线性

0.1.3 基因的重叠与可变性

0.2基因的结构组成

0.2.1启动子

0.2.2 SD序列

0.2.3 转录终止区

0.2.4 其它

0.3基因克隆的通用策略

0.3.1 基本步骤

0.3.2 亚克隆

第1章基因操作工具酶 (10学时)

本章重点与难点:要求掌握和了解限制酶与常用工具酶的种类\活性和用途, 让学生知道“基因操作原理”是靠什么“工具”来完成的。

1.1 限制酶

1.1.1限制酶的发现及其命名

1.1.1.1 现象

1.1.1.2 限制酶的发现及其命名

1.1.1.3 限制与修饰系统的种类

1.1.2限制酶识别的序列

1.1.

2.1长度

1.1.

2.2结构

1.1.

2.3切割位置

1.1.

2.4特殊系列

1.1.3 限制酶产生的末端

1.1.3.1粘性末端

1.1.3.2平端

1.1.3.3非对称突出端

1.1.3.4同裂酶

1.1.3.5同尾酶

1.1.4末端长度对切割的影响

1.1.5位点偏爱

1.1.5.1现象

1.1.5.2原因

1.1.6酶切反应条件

1.1.6.1缓冲液

1.1.6.2反应温度 / 时间

1.1.6.3反应终止

1.1.7星星活性

1.1.8单链DNA的切割

1.1.9酶切位点的引入(酶切水平)

1.1.9.1方式

1.1.9.2沉默突变

1.1.10 影响活性的因素

1.1.11 酶切位点在基因组中分布不均一性

1.2甲基化酶

1.2.1甲基化酶的种类

1.2.1.1dam/dcm甲基化酶

1.2.1.2Eco RI甲基化酶

1.2.1.3Sss I甲基化酶

1.2.1.4其它甲基化酶

1.2.2依赖于甲基化的限制系统

1.2.3甲基化对限制酶的酶切影响

1.2.3.1修饰酶切位点

1.2.3.2产生新的酶切位点

1.2.3.3甲基化位点的分布及对基因组作图的影响

1.3 DNA聚合酶

1.3.1大肠杆菌DNA聚合酶

1.3.2 Klenow 酶

1.3.3 T4噬菌体DNA聚合酶

1.3.4 T7噬菌体DNA聚合酶

1.3.5 耐热DNA聚合酶(第7章中详细介绍)

1.3.6反转录酶

1.3.7末端转移酶

1.4其它工具酶

1.4.1 RNA聚合酶

1.4.2 连接酶

1.4.

2.1 T4 DNA连接酶

1.4.

2.1大肠杆菌连接酶

1.4.

2.3Taq DNA连接酶

1.4.

2.4T4 RNA连接酶

1.4.3 T4多核苷酸酶

1.4.4碱性磷酸酶

1.4.5核酸酶

1.4.5.1 DNA酶

1.4.5.2 RNA酶

1.4.6 RNA酶抑制剂

1.4.7琼脂糖酶

1.4.8 DNA单链结合蛋白

1.4.9其它

第2章分子克隆载体(14学时)

本章重点与难点:重点掌握质粒、λ噬菌体、粘粒和M13噬菌体的组成结构和用作基因克隆的工作原理，了解其它克隆载体，表达载体和其它功能性载体的种类及其工作的基本原理。

2.1.质粒载体

2.1.1 质粒的基本特性

2.1.1.1 概念

2.1.1.2 质粒的复制和不相容性

2.1.1.3 转移性

2.1.2 标记基因

2.1.2.1选择标记

2.1.2.2α-互补

2.1.3 质粒载体的种类

2.1.

3.1克隆载体及其类群

2.1.

3.2其它载体

2.2λ噬菌体载体

2.2.1λ噬菌体的分子生物学

2.2.1.1发育调节

2.2.1.2可置换区

2.2.2λ噬菌体载体的选择标记

2.2.3 代表性λ噬菌体载体

2.2.

3.1插入型载体

2.2.

3.2置换型载体

2.3粘粒载体

2.3.1粘粒的结构特征

2.3.1.1概念

2.3.1.2组成与大小

2.3.2用作基因克隆的原理性步骤

2.3.3 用途

2.3.4 粘粒克隆载体

2.3.4.1单-cos位点粘粒载体

2.3.4.2双cos位点的粘粒载体

2.3.4.3[charomid]卡隆粒9载体系列

3.1.1克隆中常见的问题

2.4单链丝状噬菌体载体

2.4.1 M13噬菌体的生物学

2.4.1.1结构组成

2.4.1.2增殖过程和方式

2.4.2 M13噬菌体载体

2.4.2.1插入区域

2.4.2.2M13mp载体

2.4.2.3宿主菌

2.4.2.4用途

2.4.2.5克隆中常见的问题

2.4.3 噬菌粒

2.4.4 M13KO7

2.5高通量克隆载体

2.5.1 酵母生物学简介

2.5.2 酵母人工染色体

2.5.2.1复制的必需成份

2.5.2.2选择标记

2.5.2.3筛选模型

2.5.2.4工作原理

2.5.3 细菌人工染色体

2.5.

3.1 F质粒生物学

2.5.

3.2 载体的必需成分

2.5.

3.3 工作原理

2.5.

3.4 用pBeloBAC11构建苏云金芽胞杆菌YBT1520全基因组文库

2.5.4 PAC载体

2.5.4.1 P1噬菌体

2.5.4.2 P1载体和 PAC载体

2.6大肠杆菌表达载体

2.6.1非融合蛋白表达载体

2.6.1.1Lac启动子系列

2.6.1.2Trp/tac 启动子系列

2.6.1.3启动子

2.6.2融合蛋白表达载体

2.6.2.1GST 基因融合蛋白载体

2.6.2.2蛋白A融合蛋白载体

2.6.2.3 His融合蛋白载体

2.7其它功能性载体

2.7.1 穿梭载体

2.7.1.1 E.coli/gram+

2.7.1.2 E.coli/yeast

2.7.1.3 E.coli/plant cell

2.7.1.4 E.coli/Mammalian

2.7.2启动子克隆载体

2.7.3复制子克隆载体

2.7.4整合载体

2.7.4.1 无复制子整合载体

2.7.4.2 温度敏感复制子整合载体

2.7.4.3 转座子载体

2.7.5解离载体

第3章基因操作中的分离与分析技术(6学时)

本章重点与难点:重点掌握大肠杆菌质粒DNA分离纯化,琼脂糖凝胶电泳和DNA片段回收的方法性原理以及RNA分离纯化的注意事项和分离及电泳方法。要求掌握印迹分析的种类、原理和方法，特别要求掌握这些方法的运用对象，达到能灵活运用这些方法的目的。

3.1 DNA的分离

3.1.1质粒DNA的分离纯化

3.1.1.1小质粒的分离

3.1.1.2大质粒的分离

3.1.2单链DNA的分离纯化

3.1.3凝胶电泳分离DNA

3.1.3.1琼脂糖凝胶电泳

3.1.3.2聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.1.3..3脉冲电场电泳

3.1.4 DNA的回收

3.1.

4.1低熔点琼脂糖

3.1.

4.2透析袋

3.1.

4.3 Glass milk

3.1.

4.4 Qiagen 柱

3.1.

4.5其它

3.2 RNA的分离

3.2.1 RNA的分离纯化

3.2.1.1注意事项

3.2.2.2分离方法

3.3 染色体DNA的分离

3.4 探针制备

3.5 印迹分析（杂交）

3.5.1 Southern杂交

3.5.1.1目标DNA的转移

3.5.1.2杂交和检测

3.5.2 Northern 杂交

3.5.2.1 RNA的提取和电泳

3.5.2.2目标RNA的转移

3.5.2.3杂交和检测

3.5.3 Western“杂交”

3.5.3.1 SDS-PAGE

3.5.3.2 蛋白质转移至固相支持体

3.5.3.3 靶蛋白的检测

3.6 基因芯片

3.6.1基因芯片

3.6.1.1基因芯片的定义

3.6.1.2基因芯片分析流程

3.6.1.3基因芯片技术的发展史

3.6.1.4基因芯片技术的特点

3.6.2基因芯片的分类

3.6.2.1 Array

3.6.2.2 Microarray

3.6.2.3 DNA chip

3.6.2.4 Lab on a chip

3.6.3基因芯片技术的理论基础

3.6.3.1 DNA分子在刚性表面的固定

3.6.3.2 探针的标记

3.6.3.3 杂交

3.6.4基因芯片的制作

3.6.

4.1基因的分析与选择

3.6.

4.2点样

3.6.

4.3固定

3.6.5 DNA芯片的应用

3.6.5.1 RNA 表达分析

3.6.5.2比较基因组分析

3.6.5.3单核苷酸多态性（SNP）分析

3.6.5.4临床检验

第4章PCR技术及应用(6学时)

本章重点与难点: 要求重点掌握PCR技术的基本原理、基本操作程序以及引物设计方法，了解利用PCR技术原理所衍生出来的技术方法的种类和工作原理，达到能够自觉合理地利用PCR技术为研究和应用服务。

4.1 PCR的基本原理

4.1.1 PCR运行的基本原理

4.1.2 热稳定DNA聚合酶的种类和用途

4.1.2.1 Taq DNA聚合酶

4.1.2.2保真热稳定DNA聚合酶

4.1.2.3其它热稳定DNA聚合酶

4.1.3 引物的设计

4.1.3.1 长短

4.1.3.2 Tm值

4.1.3.3 其它

4.1.4 运行程序

4.1.4.1 温度

4.1.4.2 时间

4.1.4.3 平台效应

4.2 PCR技术的应用

4.2.1 PCR克隆

4.2.1.1 AT克隆

4. 2.1.2 平末端克隆

4.2.1.3 反向PCR

4.2.2 反转录相关PCR

4.2.2.1 反转录PCR

4.2.2.2 5’RACE

4.2.2.3 3’RACE

4.2.3 PCR鉴定和多态性

4.2.3.1 PCR鉴定

4.2.3.2 RAPD

4.2.3.3 AFLP

4.2.4实时定量PCR

4.2.4.1 实时荧光定量PCR原理

4.2.4.2 检测模式

4.2.5其它PCR方式（略）

4.2.

5.1 PCR介导的诱变 (详见后文)

4.2.

5.2 PCR介导的DNA序列测定(详见后文)

第5章DNA序列分析(4学时)

本章重点与难点:要求掌握DNA序列分析的基本原理和基本步骤, 能够做到自行设计和按排测序工作；同时要求能对所测得的序列进行常规分析, 了解如何利用因特网进行数据处理和分析。

5.1 Maxam-Gilbert 化学降解法

5.1.1 基本原理

5.1.2 优缺点

5.2 Sanger双脱氧终止法

5.2.1 测序策略

5.2.1.1 亚克隆

5.2.1.2 嵌套缺失克隆

5.2.1.3 “引物步进”

5.2.2 基本原理和步骤

5.2.2.1 原理

5.2.2.2 步骤

5.2.2.3 双链模板

5.2.3 PCR自动测序

5.2.3.1 PCR反应

5.2.3.2 自动测序和分析

5.3 DNA序列的数据分析

5.3.1 目标序列的特征分析

5.3.1.1 酶切位点

5.3.1.2 ORF查找/ORF的特征

5.3.1.3 其它(二级结构, 启动子, SD序列等)

5.3.2 目标序列的网络分析

5.3.2.1 同源性分析

5.3.2.2 注册登记

5.3.2.3 已知基因序列的获得

5.3.2.4 两个或多个序列的同源性比较

(5.3将采用多媒体网络化演示教学)

第6章DNA文库的构建（5学时）

本章重点与难点：要求结合前面所学的内容，重点掌握基因文库构建的基本原理和步骤，并由此掌握基因文库构建的方法和类型，可自行设计和选择构建基因文库的步骤和方法。

6.1 基因文库

6.1.1 概念

6.1.2 重组子数

6.1.3 注意的问题

6.2 cDNA文库

6.2.1 cDNA克隆的策略

6.2.2 cDNA第一链的合成

6.2.3 cDNA第二链的合成

6.2.3.1自引导法

6.2.3.2第二链的置换合成法

6.3.3.3第二链的引导合成

6.2.4 双链cDNA的分子克隆

6.2.4.1同聚物加尾

6.2.4.2合成的DNA接头和衔接头

6.2.4.3其它克隆cDNA的方法

6.2.5 DNA克隆的λ噬菌体载体

6.2.5.1λgt10和λgt11

6.2.5.2其它

6.3 基因组文库

6.3.1鸟枪克隆

6.3.1.1靶DNA的处理

6.3.1.2载体的选择

6.3.2定向克隆

6.3.2.1Southern分析

6.3.2.2文库构建

6.3.3其它克隆方法

6.3.3.1精简基因组文库

6.3.3.2精简cDNA文库

6.4 基因文库的筛选

6.4.1 菌落(噬斑)杂交

6.4.2 筛选的策略

6.4.3 文库的保存

第7章DNA定点诱变(4学时)

本章重点与难点:要求学生掌握对DNA进行定点诱变所使用的方法和种类及其用途, 重点掌握利用寡核苷酸进行定点诱变的方法和原理。

7.1 缺失与插入的形式

7.1.1 简单的缺失或插入

7.1.2 系统缺失和插入

7.1.2.1 插入接头的诱变

7.1.2.2 若干套嵌套的缺失突变体的产生

7.1.2.3 接头分区诱变

7.2 寡核苷酸介导的诱变

7.2.1 诱变寡核苷酸的设计和挑选

7.2.2 诱变方法

7.2.2.1 双引物诱变法

7.2.2.2 Kunke法

7.2.2.3 PCR法

7.2.3 通过诱变研究蛋白质

7.2.3.1 在编码区插入六聚体接头

7.2.3.2 在特定区域上产生许多突变

第8章重组DNA导入宿主细胞的方式（2学时）

本章重点与难点:掌握大肠杆菌的转化方法以及电转化的原理及应用对象,了解DNA导入宿主细胞的方式。

8.1. 大肠杆菌的转化

8.1.1 常规转化方法(CaCl2法)

8.1.2 电转化法

8.1.3 其它方法

8.2 芽胞杆菌的转化

8.2.1 原生质体融合

8.2.2 电转化法

8.2.3接合转移

8.2.4转导

8.2.5转染

8.3真核生物细胞的转化

8.3.1 酵母

8.3.2 植物细胞

8.3.3 哺乳动物细胞

课程综合报告（2学时）

报告目的：通过对科学研究实例的分析，细化学生对概念的认识，深化学生对理论的理解。让学生在这种实战模拟中逐步锻炼自己的科研思维，形成自己的实践观念。

四、教学方式及课程考核办法

教学方式：多媒体演示讲述

课程考核办法：检查课后思考题，闭卷笔试

五、主要参考资料

1、“Molecular Cloning”（3rd edition 2001年）

2、“Princeples of Gene Manipulation” (6th edition, 2002)

3、最新版的分子生物学试剂产品目录和Internet最新信息

撰稿人：孙明

审稿人：