细胞核的分离和鉴定

姓名：班级：学号：评价：

项目: 细胞核的分离和鉴定

原理：1、细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内其沉降速度也不同，因此，可以用差速离心法将细胞内各细胞器和组分分级分离出来。

2、分离细胞核的常用方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用特定的离心力进行离心、分离、分析鉴定。

3、匀浆是指在低温下，将组织快放入匀浆器，加入等剩匀浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液步骤：1、处死：断头处死小白鼠，手提尾部使腹内血液尽量流出

2、取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复

洗涤，取约1g的肝组织放在烧杯中

3、匀浆：加入8ml预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化

钙溶液于烧杯中，剪碎肝组织，将剪碎的肝组织倒入玻璃匀浆

器，使匀浆器下端寖如盛有冰块的器皿，将匀浆杆垂直插入管

中匀浆，直至看不见明显的组织块

4、过滤：用8层纱布过滤匀浆液于离心管中

5、离心：在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心15min,

取上清液于另一离心管中，大约剩1ml左右上清液。

6、涂片：取上清液制一张涂片（标记1）。将原离心管中剩

余上清液吹打沉淀成悬液，另制一张涂片（标记2），自然干燥。

7、染色：分别在涂片1、2上滴加甲苯胺蓝染液，染色5min

8、洗涤：冲去染液，晾干。

9、镜检：显微镜下观察分析。

注意事项：1、规范操作，防止试剂污染

2、细胞悬液的制作要轻柔

3、使用离心机应注意转速，转速从低到高

结果预测：低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，中央有两个或两个以上核仁

试剂表

仪器表

实验人员：王世尧（1120150724）刘宇（1120150716）付林梦（1120150723）杨凯（1120150731）郝倩（1120150725）李远林（1120150732）

实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定

实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定【实验目的】 1.掌握细胞核及细胞质的分离和纯化的一般原理和操作方法。 2.了解DNA在细胞中的分布和核酸鉴定的原理。 3.进一步掌握离心机的工作原理及正确使用方法。【实验原理】 1.DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。 2.细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各组分分级分离出来。肝组织破碎后，柠檬酸能抑制脱氧核糖核酸酶的活性，维持染色质的正常结构和活性。如将此种细胞核保存在等渗（0.25M）蔗糖溶液中（内含微量钙离子，防止核聚集和脆性），可以比较好地保存其完整的正常结构。在此条件下离心分离得到的是细胞核的粗制品，如离心时通过0.88M蔗糖的高渗溶液。适当调整离心力，可得到纯化的细胞核沉淀。

3.脱氧核糖核酸的鉴定：【操作步骤】 1、0.5g肝组织＋5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨 2、肝匀浆，倾入离心管，离心：3000r/min；15′ 3、离心结束后，上清液移入另外一个试管中备用（此为细胞质液） 4、沉淀中加入1ml的0.25mol/L 蔗糖-柠檬酸溶液，玻棒搅匀后，为核悬液。 5、另外取离心管一只，加9ml 的0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液。用滴管吸取核悬液。沿管壁缓慢铺于液面上。 6、离心：2000r/min；10′.上层液，弃去；沉淀为初步纯化的细胞核。 7、核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，10 ′白色沉淀为纯

化的细胞核。 8、加10ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核，即为待测的核液。 9、脱氧核糖核酸的鉴定（1）水解：取离心管二支，编号，按下表操作混合各管沸水浴(10’) 离心 3000r/min;5′ 上清液 (2)鉴定：取试管三支，编号，按下表操作: 混合各管沸水浴(15’) 冷却比较各管颜色(595nm) 编号 1 2 细胞质（ml） 2.0 - 核液（ml）- 2.0 1M过氯酸(ml） 2.0 2.0

细胞质与细胞核测试题

第6讲细胞质与细胞核测试题 1．（2008广东理科基础）细胞内各细胞具有一定的结构和功能，对图8中结构①的叙述，正确的是A．在不同植物细胞内其数量基本相同 B．是植物合成蛋白质的主要细胞器 C．是植物进行光合作用产生有机物的细胞器 D．含有DNA和RNA，是决定植物遗传的基本单位 2、（06江苏）下列有关细胞结构和功能的叙述，错误．．的是 A、水稻主动吸收Si需要根细胞膜上的载体协助 B、甲状腺细胞能够接受促甲状腺激素的调节与其细胞膜上的糖蛋白有关 C、核糖体是细胞内蛋白质的“装配机器”，由蛋白质和mRNA组成 D、核孔是细胞核和细胞质之间进行物质交换的通道 3、（06江苏）（多选）右图为某高等植物叶肉细胞结构模式图，相关叙述正确的是 A、图中能产生ATP的结构有1、2、5 B、1中产生的一分子C02扩散出来进入2中被利用，穿过的磷脂双分子层的层数为4层 C、2与4中都含有叶绿素和类胡萝卜素等色素 D、3是遗传物质储存和复制的主要场所，是细胞遗传特性和细胞代谢活动的控制中心 4、（06广东）不．在内质网上合成或加工的生物分子是 A、抗体 B、胆固醇 C、维生素D D、核酸 5、下图表示真核生物细胞的结构与功能，下列与此相关的叙述，不正确的一项是 A、图中物质A表示蛋白质，物质B表示磷脂 B、E的结构特点是具有一定的流动性 C、图中①的场所是叶绿体，②的场所是线粒体 D、完成③、④、⑤、⑥功能的结构均具有单层膜结构 6. （2008高考广东生物）用高倍显微镜观察黑藻叶绿体时，可见叶绿体 A.具有双层膜 B.呈绿色带状 C.内部有许多基粒 D.呈绿色椭球形 7．（2008上海高考生物巻）（8分）下面是两类细胞的亚显微结构模式图，请据图回答：

痢疾杆菌分离与鉴定培训

痢疾杆菌的分离与鉴定濮阳市疾病预防控制中心许银怀第一节概述志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国

宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容：细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据；缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍；志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大；洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化；目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。第二节病原学一、抗原分类志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分

细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定

细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定医学细胞生物学设计型实验设计报告班级10级k-7班评分实验项目：细胞核的分离与鉴定实验原理：1、细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内其沉降速度也不同。所以，用差速离心法可将细胞内各种细胞器及组分分级分离出来。差速离心法也是用来研究亚细胞成分的化学组成，理化特性及其功能的主要手段。 2、分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆，在特定的条下进行离心分离，然后分析鉴定。 3、匀浆是指在低温条下，将组织放入匀浆器，加入等渗匀浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。实验步骤：1、处死：断头处死小白鼠，手提尾部使其学业尽量流出。 2、取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤，称取湿重约为1g的肝组织放在烧杯中。 3、匀浆：加油8ml预冷的0.25mol/L蔗糖0.003mol/L绿化高永夜于烧杯中，尽量剪碎肝组织，将剪碎的刚组织倒入玻璃匀

浆器，是匀浆器下端侵入盛有冰块的器皿（如冰盘）。左手握持匀浆器，右手将匀浆捣杆垂直插入管中匀浆，直至看不到明显的组织块。 4、过滤：用8层纱布（先用少量生理盐水或蔗糖液润湿纱布）过滤匀浆液于离心管中。 5、离心：在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心 15min，取上清液于另一离心管中。 6、涂片：取上清液制一张涂片（涂片1）。将原离心管中剩余上清液吹打成沉淀成悬液，另制一张涂片（涂片2），自然干燥。 7、染色：分别在涂片1和2上低价甲苯胺蓝染液，染色5到7分钟（即滴染）。 8、洗涤：冲去染液，晾干。 9、镜检：结合实验结果的描述，镜下观察分析。注意事项：1.操作规范，防止试剂污染。 2.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 3.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。预期结果：低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，圆形，中央有2到4个甚至更多个深蓝色的核仁。实验用品：材料：小白鼠肝脏。

细胞质包括细胞核外的所有物质

细胞质包括细胞核外的所有物质，被细胞膜包裹着。在细胞中起着运输的作用，细胞质包含着：线粒体，很小，有着香肠一般的外形。像小型的能量工厂，通过有氧条件下燃烧营养物质产生能量。这个化学反应，被称为分解代谢，复杂结构的营养物质被分解成结构更加简单的物质。细胞中糖类和脂肪的代谢需要能量。内质网是细胞中一种网状管道结构，这些管道是一个细胞的运输系统——加工细胞可用蛋白质的地方。这些构造生成复杂物质的过程，比如蛋白质。通过合成代谢，小条的蛋白质通过匹配组合到一起像连成一条链子一样组成更长的蛋白质。这两个过程，合成和分解，被称为新陈代谢。新陈代谢可概括为细胞中发生的所有化学反应。如果一个人拥有快速的新陈代谢，那么对于营养物质，比如糖类和脂肪，将会很快用光，能量将被释放。如果一个人拥有缓慢的新陈代谢，营养物质将会消耗的很慢，脂肪将储存在细胞中。细胞间的差异。细胞是不同的，或者说成作用分工不同，自始至终细胞都在分泌他们的特有产物，比如，肌肉细胞是细长的，组成肌肉纤维，帮助（人体）收缩和舒张。神经细胞体型细长有着向四周伸展的神经纤维，帮助他们传递神经冲动。脂肪细胞包含一个用于储脂的大的，空荡的空间。这些仅仅是人体中多种多样的细胞类型中的凤毛麟角。组织组织是一群相同的细胞一起聚集在一起进行专项工作，组织学家是一名专门从事组织研究的科学家。组织类型分为：上皮组织，位于身体各处。如内部器官的内层结构，覆盖身体表面的皮肤，它也联系着内分泌和外分泌腺。这个术语最初用来简称内部器官的表面。肌肉组织。随意肌——位于手臂，腿部，身体各部位的肌肉处于有意识的运动下。不随意肌——位于心脏和消化系统，以及其他器官，在无意识中运动。心肌是一种特殊的肌肉类型，只存在于胸腔上方的心脏处。Now it describes all tissue that covers the outside of the body and lines the ind can be seen beating in a 6-week-old fetus.（这句真不懂）结缔组织。比如脂肪，软骨和血液。神经组织。神经组织控制着人体内各处的神经冲动。

细胞质和细胞核知识讲解

细胞的结构：细胞质和细胞核【学习目标】 1、理解几种细胞器的结构和功能 2、理解细胞器之间的协调配合，共同完成生命活动 3、理解细胞核的功能，明确细胞核在控制细胞代谢和遗传中的作用。 4、重点：几种重要细胞器的结构和功能、细胞膜系统、细胞核的结构和功能 5、难点：细胞器之间的协调配合、观察叶绿体和线粒体。【要点梳理】要点一、细胞质的结构和功能 1、细胞质（细胞质基质+细胞器）（1）细胞质基质状态：透明、黏稠、流动的液体物质：水、无机盐、糖类、氨基酸等作用：活细胞新陈代谢的主要场所（2）细胞器：分离细胞中各结构的方法——差速离心法 2、细胞器：线粒体和叶绿体（1）植物叶片内叶绿体分布不均匀，栅栏组织中含有的叶绿体多，便于接受光照，进行光合作用（2）线粒体在不同细胞中的数量是不同的，代谢旺盛的细胞，线粒体数量较多。 3、其他几种细胞器（1）内质网的结构和功能内质网是由一层膜形成的囊状、泡状和管状结构，并形成一个连续的网膜系统。根据内质网上是否附有核糖体，将内质网分为两类，即粗面内质网和光面内质网。粗面内质网多呈大的扁平膜泡，排列整齐。它是核糖体和内质网共同组成的复合结构，普遍存在于细胞中，特别是合成分泌蛋白的细胞。在结构上，粗面内质网与细胞核的外层膜相连。无核糖体附着的内质网称为光面内质网，通常为小的管状和小的泡状，广泛存在于各种类型的细胞中。光面内质网是脂质合成的重要场所。内质网可通过出芽方式，将合成的蛋白质或脂质转运到高尔基体。（2）高尔基体的结构和功能高尔基体是普遍存在于真核细胞中的一种细胞器。在电镜下观察到，高尔基体是由一些排列较为整齐的扁平膜囊堆叠在一起，构成了高尔基体的立体结构。扁平膜囊多呈弓形，也有的呈半球形，均由光滑的膜围绕而成。在扁平膜囊外还包括一些小的膜泡。整个高尔基体结构分为形成面和成熟面，来自内质网的蛋白质和脂质从形成面逐渐向成熟面转运。高尔基体与细胞的分泌功能有关，能够收集和排出内质网所合成的物质，它也是聚集某些酶原的场所，参与糖蛋白和黏多糖的合成。高尔基体还与溶酶体的形成有关，并参与细胞的胞吞和胞吐作用。

细胞核的分离

实验四细胞核的分离 [实验目的] 1. 为了研究细胞核及其组分。 2. 定量分析细胞核的生化组分及其它一些特殊成分。 [实验原理] 1956年由chauveau等人提出，用高密度介质来分离细胞核。由于细胞核的密度较大，在高密度介质中，在高速离心条件下沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开来的目的。chauveau 的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/l蔗糖溶液中匀浆，然后高速离心40 000g 1小时，细胞核沉淀到底部，线粒体和完整细胞，包括红血球漂浮在液面，通过一步操作即可分离得到细胞核。其后又有不少研究者对此方法进行了改进，例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等改变分离介质的渗透压；选择介质的ph以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。这样减少了细胞核的脆性，防止聚集，维持恒定的ph，就能保持细胞核的精细结构。虽然这一方法比较简单，能得到较高纯度的细胞核，也已被广泛采用，但实验需要高速离心机，这在一般实验室不能进行，此方法要用高浓度的蔗糖，如果要分离大量的细胞核，也很不经济。目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核，在柠檬酸介质中分离细胞核可以显著地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。由于柠檬酸降低了溶液的ph值，这样可以减少细胞核的破碎率，并能分离得到较高分子质量的核酸，可能是由于核糖核酸（一种酸溶性蛋白）被柠檬酸除去，以及二价阳离子被柠檬酸螯合所致。柠檬酸的浓度对分离细胞核的质量有较大影响。通常在较低的ph值时，可以得到较高的细胞核。但在过酸条件下，可能引起细胞核成分的改变和酶的失活。为了研究细胞内核酸，一般常在ph值为4，甚至在ph值为2.5时分离细胞核。如为了分离细胞核的酶，则需要较温和的条件，此时可以在ph值为6～6.2的极稀柠檬酸溶液中分离细胞核。

细胞质与细胞核的结构与功能教案

细胞质与细胞核的结构与功能教学目的: 1,掌握各种细胞器的分布,结构,主要功能 2,掌握细胞核的主要结构与功能 3,掌握线粒体与叶绿体的功能与生物新陈代谢的相互关系 4,理解细胞质的结构与功能教学重点: 1,线粒体与叶绿体的结构与功能 2,细胞核的结构与功能教学难点: 1,线粒体与叶绿体结构与功能 2,染色体与染色质的关系教学准备:多媒体课件教学过程: 一,内容全解 (一). 细胞质的结构和功能 1, 细胞质：______态, ___________________场所 2.无膜结构的细胞器：细胞质

(二)、真核细胞的细胞核的主要结构和功能1,细胞核的主要结构

(1) 核膜：结构：由两层膜构成，核膜上有核孔，是细胞核和细胞质之间进行物质交换的孔道。核膜上有大量的多种的酶主要功能：有利于各种化学反应的顺利进行 (2) 核仁：物理特性：核仁的折光性较强，与细胞的其他结构很容易区分形态：匀质的球形小体生理变化：在细胞有丝分裂过程中，核仁周期性的消失和重建 (3) 染色体：特点：容易被碱性染料染成深色化学组成：主要由DNA和蛋白质组成存在形式：丝状的染色质高度螺旋、缩短变粗圆柱状或杆状的染色体染色质和染色体的关系：细胞中同一种物质在不同时期的两种形态 2、细胞核的主要功能：是遗传物质储存和复制的场所，是细胞遗传特性和细胞代谢活动的控制中心 (三)小结 (1)具有双层膜的细胞器有_______________，有单层膜的细胞器有____________，无膜结构的细胞器有_________________。 (2) 含有少量遗传物质的细胞器有______________________。 (3) 与能量转换有关的细胞器有________________________。 (4) 代谢过程中有水生成的细胞器有_____________________。 (5) 动、植物细胞都有但功能不同的细胞器有__________________。 (6) 与动物细胞分裂有关的细胞器有________________________________。与植物细胞分裂有关的细胞器有_____________________________________。二、能力提升技巧从结构与功能的统一上理解细胞各结构间的关系，以各细胞器的特定功能分析各种类型细胞的特点： 1.细胞要完成一定的功能需要各细胞器的配合。 2.线粒体和叶绿体在能量转化过程中的重要性与其结构有密切关系。 3.内质网、高尔基体与扩大细胞内膜面积、为化学反应提供场所有关。 4.物质出入细胞膜的方式与分子本身的特点及细胞膜上的载体有密切关系，浓度差异并不是判断通过膜方式的唯一标准。例1, 在适当的条件下，研磨绿色植物的叶肉细胞，放入离心管中离心(如图所示)分别得到上清液S1 、、S2 、、S3、S4和沉淀物P1、P2、P3、P4。根据P1、P2、P3、P4所含有的成分回答下列问题：

细胞核的分离与鉴定设计型实验设计报告_(2)

实验项目：细胞核的分离与鉴定实验原理：分离细胞核的可用方法有吸出法、原生质体破裂法、差速离心法排和排除法。差速离心法是根据细胞内各种细胞结构的比重和大小不同，因而在同一离心场内的沉降速率不同从而将细胞内的结构分级分离出来。本实验就采用差速离心法。细胞核的鉴定，因为细胞核中主要含DNA，而DNA是碱性蛋白，可用甲苯胺蓝染液可使细胞核内碱性蛋白呈现出来。实验器材：显微镜，普通离心机，离心管，滴管，玻璃漏斗，纱布，烧杯，解剖剪，镊子，玻璃匀浆器，载玻片/盖玻片，染色盘架，小白鼠肝脏。实验试剂：甲苯胺蓝染液，蒸馏水，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，生理盐水实验步骤：（1）、用颈椎脱臼法处死小白鼠，迅速解开其腹腔取出肝脏，去出结缔组织，剪成小块，尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中。反复洗涤尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。（2）、将湿重为1g的肝组织放入烧杯中，用量筒取8ml预冷的0.25mol/L 蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，先加少量溶液于烧杯中，尽量剪碎肝组织后全部加入。（3）、将剪碎的肝组织导入匀浆管中，使匀浆器下端侵入盛有冰块的器血

中，左手持，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3-5次。用3层纱布过滤于匀浆管中，然后制备一张涂片①，自然干燥。（4）、将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机以2500r/min离心15min,弃去上清液。（5）、用6mol 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液悬浮沉淀物，以2500r/min离心15min 弃去上清液，将残留液体用气管吹成悬液，滴一滴于干净的载盖玻片上，制成涂片②，自然干燥。（6）在①·②上滴加甲苯胺蓝染液，染色5-7min，洗涤干燥后镜检。 ⑺记录观察结果注意事项：（1）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。（2）将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。（3）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太厚。（4）染色后的洗涤要注意时间，不可过长，避免将染色洗去，观察不到细胞核。（5）开腹取出肝后，用生理盐水反复冲洗，避免血细胞对食盐的影响。预期结果：在低、高倍镜下，可以观察到经.0.1%碱性固绿染色的小白鼠肝细胞的细胞核体被染成绿色。说明这是碱性蛋白，即细胞核已游离出来。涂片在高倍镜下可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色、圆形、中央有

细胞膜、细胞质和细胞核的结构和功能

细胞膜、细胞质和细胞核的结构和功能【本章知识框架】【疑难精讲】 1．细胞膜生理功能细胞膜是具有许多重要功能的结构，这些功能可以归纳成两大方面：一是具有保护功能，包括保护、支持、识别、免疫；二是具有控制物质进出细胞的功能，包括吸收、分泌、排泄。我们常说的新陈代谢是指生物体与外界进行物质交换和能量交换，以及生物体内的物质和能量的转化。细胞膜控制物质进出细胞就是一种新陈代谢现象，所以，细胞膜的这一功能是其最重要的功能。细胞膜控制物质进出的方式很多，有自由扩散、协助扩散、主动运输、内吞作用、外排作用等，其中常见的、最重要的方式是自由扩散和主动运输。自由扩散这种物质运输方式是根据物理扩散作用的原理，从高浓度一侧到低浓度的一侧，按浓度梯度的高低进行，这种运输方式不需要消耗新陈代谢产生的能量。属于自由扩散方式运输的物质有氧气、二氧化碳、甘油、胆固醇、乙醇等物质。主动运输是细胞运输物质的重要方式，被选择的物质从低浓度一侧转运到高浓度一侧，在转运的过程中，需要消耗细胞新陈代谢产生的能量，同时还需要载体蛋白的协助。载体蛋白是细胞膜上的一种蛋白质，它具有特异性，一种载体蛋白只能协助一种被选择的物质转运。在细胞的生命活动过程中，主动运输起到了重要作用，它使细胞能主动地从外界吸收被选择的物质，供生命活动需要用。例如，海水中碘的含

量比海带细胞中碘的含量要低得多，但海带细胞能不断从海水中吸收碘。同样，细胞也能利用主动运输把新陈代谢产物排出细胞外。总之，只有主动运输才能保证细胞生命活动的需要。摄取、积累物质以及不断排出代谢废物，从而保证细胞内和细胞器组成成分的动态稳定，保证生命活动的正常进行。 2．细胞器悬浮在细胞质基质中，它们具有特定的结构，有一定的生理功能（1）线粒体是动、植物细胞中都有的一种细胞器，大都呈椭球形。线粒体由两层膜组成，内膜向内腔折叠形成嵴，这样就大大增大了内膜的面积。在嵴的四周是线粒体的基质，在基质、基粒和内膜上含有许多与有氧呼吸有关的酶。因此，线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，生命活动所需的能量，绝大部分是由线粒体产生供给的，如主动运输所需的能量就是由线粒体提供的，人们称线粒体为“动力工厂”。对于线粒体的化学成分，它的内、外膜的结构和细胞膜一样，所以线粒体的结构中有蛋白质分子和磷脂分子，还有酶及少量的DNA 分子。不同的细胞中线粒体的数量不同，在生命活动旺盛的细胞中，线粒体的数量多。例如，人的心肌细胞中线粒体数量比人体腹肌细胞的线粒体多，这是因为心肌细胞不断进行收缩和舒张运动，需消耗较多的能量，故线粒体的数量多。再如，肾小管以主动运输的方式重吸收原尿中的全部葡萄糖和部分无机盐，需线粒体提供较多的能量，所以肾小管管壁细胞中的线粒体比肾小囊囊壁细胞中的线粒体多得多。（2）叶绿体是植物细胞所特有的细胞器，但并不是所有的植物细胞中都有，如茎深层的细胞、植物不见光部位的细胞中就没有叶绿体。叶绿体在细胞内比线粒体稍大，呈球形或扁平椭圆形。叶绿体也具双层膜结构。叶绿体内有几个到几十个由囊状结构垛叠成的基粒，在基粒与基粒之间充满了基质。在基粒和基质中含有进行光合作用所需要的酶。从成分上看，组成叶绿体的化合物有蛋白质、磷脂、酶、色素和少量的DNA。叶绿体是绿色植物光合作用的场所，由于光合作用能产生有机物，所以叶绿体被比喻为“养料制造工厂”。在光合作用过程中，把光能转变成化学能储藏在有机物中，故叶绿体又被称为“能量转换站”。 3．染色质

学考细胞概述、细胞膜和细胞壁细胞质与细胞核

细胞概述、细胞膜和细胞壁考点一细胞学说与原核细胞 1.连线细胞学说的建立过程(加试) 2.细胞学说的内容 (1)所有的生物都是由一个或多个细胞组成的。(2)细胞是所有生物的结构和功能的单位。(3)所有的细胞必定是由已存在的细胞产生的。 3.细胞的大小、数目和种类 (1)细胞的大小：最小的细胞是支原体，最大的细胞是鸵鸟蛋的卵黄。一般来说，细胞的大小以微米(单位)计。若细胞的体积越小，其表面积与体积之比相对越大，越有利于细胞与外界进行物质交换和信息交流。 (2)细胞的数目：多细胞生物体的长大，主要是由于细胞数目的增多。 (3)细胞的种类：根据有无由核膜包被的细胞核，将细胞分为真核细胞和原核细胞。 4.原核细胞 (1)下面为模式化的原核细胞，填出标号所指的结构名称。 (2)细菌和蓝细菌的拟核及相关细胞器与真核细胞相比，细菌和蓝细菌等原核生物没有由核膜包被的细胞核，也没有染色体，但有一环状的DNA分子，位于无明显边界的区域，这个区域叫做拟核，只有核糖体一种细胞器。质膜是好氧细菌进行需氧呼吸的场所，质膜向内折叠成好几层形成光合膜，是蓝细菌中光合色素分布和光合作用进行的场所。思考讨论 1.细胞学说揭示了怎样的问题？提示通过对动植物细胞的研究，揭示了细胞的统一性和生物体结构的统一性。

2.填写生物界的常见生物类群的划分 1.原核细胞与真核细胞的比较 2.原核生物和真核生物的判断技巧 (1)“菌”类的判断：凡“菌”字前面有“杆”“球”“弧”及“螺旋”等字的都是细菌，属于原核生物，而酵母菌、霉菌及食用菌等则为真核生物。 (2)“藻”类的判断：藻类的种类很多，常见的藻类有蓝藻即蓝细菌(如念珠藻、颤藻、螺旋藻、发菜等)，红藻(如紫菜、石花菜等)，褐藻(如海带、裙带菜等)，绿藻(如衣藻、水绵、小球藻、团藻等)。其中蓝藻为原核生物，其他藻类为真核生物。题型一细胞学说 1.细胞学说与达尔文的进化论及孟德尔的遗传定律被认为是现代生物学的三大基石。下列有关细胞学说的叙述正确的是() A.细胞学说认为细胞分为原核细胞与真核细胞 B.施莱登和施万是细胞的发现者和命名者

实验设计-细胞核的提取与鉴定

医学细胞生物学设计型实验设计报告姓名：李飘班级：K—10班学号：1020151004 评分【实验项目】：动物细胞细胞核的分离与鉴定【实验原理】：核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的细胞核。因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核，因此,我们只能制备含有少量细胞质的核体，核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法等。在本实验中我们采用排除法来制备核体。排除法制备核体是通过细胞松弛素和高速离心的作用使细胞核排出，然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。细胞核的鉴定因为细胞核中主要含DNA，是碱性蛋白。因此将分离出的核体经三氯醋酸处理,抽提掉核酸后，用碱性固绿溶液染色，可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。【实验步骤】： 1．细胞培养：将欲分离微核体和细胞质的动物接种于脱核塑料圆板上，使适宜的培养基中于37 ℃的条件下培养，使细胞固定在脱核塑料圆板上，脱核塑料圆板的直径应稍小于离心管的直径，使用前先用水洗干净再经过乙醇杀菌处理。 2．秋水仙碱处理：细胞培养一段时间以后，加入0.1ug/ml的秋水仙碱，处理细胞48～60h 滤纸，使细胞形成多个大小不同的核体。 3．细胞松弛素处理：在离心管内加入5ml预热至37 ℃的细胞松弛素B溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内，固定圆板位置后，再加入10ml37 ℃的CB溶液。 4．离心：在1000～15000r/min核体从细胞排出。 5．收集核体：由于核体的贴附力弱，可以从离心管底部的沉淀中收集。 6．固定：将收集的核体涂于玻片上制成涂片，滴加15%乙醇于涂片上，固定5min，室温晾干。 7．三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在90 ℃的三氯醋酸溶液中处理20min，细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。 8．染色：将制作好的涂片放入0.1%碱性固绿染液中染色10～15min，细流水冲去多余染液，晾干，镜检。【注意事项】： 1．在离心管内加入的5ml细胞核松弛素B溶液要预热到37 ℃，因为只有这样才接近动物的最佳体温37 ℃。 2．涂片在用三氯醋酸处理时，时间不宜过长或过短，过长会使核膜裂解，过短使抽提的核酸不够。 3．在染色时，时间一定要足够，否则染色不完全，得不到理想的实验结果。 4．因去掉胞质的核体贴附能力弱，因注意在固定、三氯醋酸处理、染色时、尽量避免胞核的脱落。【预期结果】：经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色，说明这是碱性蛋白，即细胞核。

病毒的分离与鉴定

病毒的分离与鉴定（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细

细菌鉴定学习

现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你怎样运传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。实验十肠杆菌科肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。一、大肠埃希菌大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。（一）形态与培养特性【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征培养基菌落特征普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色中国蓝平板呈蓝色伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽（二）生化反应【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。【结果】

实验二细胞核与线粒体的分离与观察

实验二细胞核与线粒体的分离与观察一、实验目的 1．了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。 2．掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。二、实验原理细胞核（nucleus）是细胞中重要的细胞器，细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动需要。对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的，因而分离细胞核和线粒体是必须的。差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。在确定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿B（Janus green B）活染法，对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中染料被还原成无色。从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为

利用离心技术分离细胞核和叶绿体

密度梯度离心后的结果低倍镜下的叶绿体高倍镜下的叶绿体实验二利用离心技术分离细胞核和叶绿体一、实验目的： 1. 了解常用的离心法； 2. 理解差速离?心法和速率区带离心法分离样品组分的原理； 3. 以分离细胞核和叶绿体为例,掌握离心的操作方法。二、实验原理： ? 离心技术：是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离的实验技术。?离心技术类型: 1.差速离心法 2.密度梯度离心法 ?等密度梯度离心： ①对象：常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。(此法一般应用于分离大小相近，而密度差异较大的颗粒物质时) ②原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置，在这里颗粒没有重量，不管离心多长时间，它们再也不移动了，形成一系列密度区。从而使不同浮力密度的物质得到分离。③等密度梯度离心一般常用CsCl、蔗糖、甘油等做介质。 ?速度梯度离心： ①对象: 纯化分离叶绿体和细胞核(主要用来分离密度相近，大小不同的物质) ②原理:根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带,达到彼此分离的目的。 ②要求：1、样品溶液的密度必须小于悬浮介质层的最小密度； 2、样品颗粒的密度必须高于悬浮介质的最大密度； 3、离心时间十分重要三、实验结果分析：实验结果：

实验结果：如图所示，叶绿体在混合液的梯度层中，形成一条带，聚集在密度梯度交界处；沉降系数较大的细胞组份则沉到离心管底部。如图所示，叶绿体镜检为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒为基粒。实验分析：此实验最难的一点就是蔗糖溶液梯度的制备。要想制得清晰，平整的界面，需要将离心管放置于稳定的水平界面上；最重要的是，向下层溶液中加入上层溶液时，需要极小心、熟练地控制滴加的力度，并使枪头贴着离心管管壁，让液滴缓慢的流入，防止梯度层被破坏；除此之外，将配置好梯度层的的EP管放入离心机时要用试管架移动，而且离心时一定要两两平衡，之前要称量两个离心管使其相等。四、思考问答：本实验使用了哪两种离心方法，它们在分离样品时有何不同？答：使用了等密度梯度离心和速率区带离心。速率区带离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始离心速度较低，使较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍悬浮在上清液中。收集沉淀，再改用较高的离心速度离心悬浮液，使较小的颗粒沉降，多次重复此步骤，从而达到分离不同大小颗粒的目的；等密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。此种分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。

细胞核与线粒体的分级分离

细胞核与线粒体的分级分离一、原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即 0.25mol／L 蔗糖一 0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。二、细胞核的分离提取 (一)操作步骤 1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有 0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。 3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。 4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用； (2)同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥； (3)余下的沉淀物进行下一步骤。 5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。 6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。 (二)结果分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。三、高速离心分离提取线粒体 (一)操作步骤 1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以 17000rpm 离心 20 分钟，弃上清，留取沉淀物。 2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液混匀成悬液(可用牙签)。 3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。 (二)结果油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。

淋巴细胞的分离及鉴定

离心分离技术与淋巴细胞分离及鉴定【实验目的】 1.了解离心分离技术的原理与分类。 2.掌握应用密度梯度离心法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的方法。【实验原理】 1.利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分。因此用比重与被分离细胞比重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集到所需要的单个核细胞。 2.用过氧化物酶标记的抗IgM，在一定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与 B细胞表面的IgM结合，通过DAB显色，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染色。【实验步骤】一.细胞分离 1.将小鼠用颈椎脱臼法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。 2.将脾脏置于培养皿内100目筛网上，加入8ml的生理盐水，用磨棒磨碎脾脏后过滤，即获得脾细胞混合悬液。 3.1500rpm,5min,离心细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积至4ml,重悬细胞。 4.取盛有3ml细胞离心液（比重1.088）的试管一支，用移液器加入细胞混合液4ml。 5.将试管离心1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。 6.离心后取出试管，观察细胞分层，底层为红色的红细胞，依次向上为细胞分离液和生理盐水，在此之间可见一层淡淡地白色细胞层。 7.用尖吸管小心取出中层间的细胞到另一洁净离心管，并加2ml PBS洗涤一次，1500rpm 离心5min后去上清。 8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片上，自然干燥后，可进行细胞类型鉴定。二.细胞鉴定 1.分离出单个核细胞并取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片左右各一滴涂片，自然干片 2.在室温条件下，用甲醇固定细胞，自然干燥后用蜡笔标出细胞范围，蒸馏水洗三次。 3.配制封闭液。室温浸泡30分钟，PBS洗3次。 4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgM抗体于左侧涂片，滴加适量的封闭液于右侧涂片（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。 5.滴加DAB显色液，37 ℃显色30分钟，蒸馏水洗3次，干片后，显微镜下观察。【注意事项】 1.向分离液管加脾细胞混合悬液时应沿试管壁缓缓加入，使脾细胞混合悬液与分离液形成明显的界面，小心放取试管，保持界面完整，避免打乱界面，影响分离效果。 2.在滴DAB显色液前要彻底去除游离的抗体，以免假阳性结果。 3.DAB潜在致突变作用，请注意适当防护,请穿实验服并戴一次性手套操作。【实验结果】如下图：