2020骨来源肿瘤的分子病理学进展

2020骨来源肿瘤的分子病理学进展

摘要

形态学以及经典的免疫组化仍是骨来源肿瘤诊断的基石，但以二代测序为基础的分子病理学的蓬勃发展已改进了目前的诊断技术。同时，分子病理学也进一步为骨来源肿瘤的治疗策略提供线索，用于预测肿瘤的生物学行为。基于分子异常的新病种的文献报道不断涌现，让肿瘤的分类从形态学向分子生物学转换。目前，骨肿瘤可以简单分为简单核型和复杂核型两类，前者包括了特殊异位、基因点突变、特殊基因扩增等，而后者往往缺乏特定的变异。本文基于2019年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）（第5版）新的骨肿瘤分类，对骨肿瘤的分子病理学更新进行归类和总结。新的基因型的发现有助于骨肿瘤的诊断与鉴别诊断，甚至可以为后续的内科治疗提供新的思路。其中以巨细胞来源的骨的肿瘤的H3F3A p.G34W、软骨母细胞瘤的H3F3B p.K36M、软骨肉瘤的IDH1/2突变、动脉瘤样骨囊肿的USP6重排等成为近年来骨肿瘤分子病理学革新的标志。

在过去的十几年间，骨来源肿瘤的分子病理学发展极其迅速。骨肿瘤的亚型鉴别已经从依赖传统的免疫组化染色转变为分子病理学检测，例如免疫荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和二代测序等。新出现的骨肿瘤遗传基因位点，让人们对这些骨肿瘤亚型的遗传背景有了更深刻的认识。与此同时，这些遗传学的改变也

在指导临床治疗策略及预测肿瘤的生物学行为方面有其不可替代的优势。甚至在小圆细胞恶性肿瘤中，部分肿瘤亚型的命名就是以基因异位来进行的，例如CIC重排肉瘤（CIC为毛细血管果蝇的人类同源基因，编码一群高迁移率的转录因子，位于19号染色q13断端）和BCOR 重排肉瘤（BCOR基因，编码转录抑制因子B细胞淋巴瘤-6的共抑制因子，位于X染色体11.4断端）等。

骨肿瘤的二代测序提示基因的初始改变包括单核苷酸变异、体细胞拷贝数变异、基因融合和更复杂的变化，如染色体碎裂等。为了便于理解，在下文中我们就每个骨肿瘤亚型的基因改变做了详细的归类：基因突变、基因重排、基因缺失和基因扩增，并对骨肿瘤亚型相应的基因改变频率进行了归纳和整理。同时，在临床应用中并非所有的基因型鉴定均需要通过二代测序的方法，设计相应探针进行FISH检测或进行免疫组化染色鉴定源基因突变后下游蛋白的表达，虽不如测序精准，但可降低花费，简便易行。部分基因缺失，例如INI-1缺失也可成为靶向治疗的靶点，在辅助诊断的同时提供了治疗思路。值得一提的是，仍有大量骨肿瘤亚型属复杂核型，并没有明确的变异，基于临床生物学特征和免疫组化的分辨，以及通过排除存在简单核型的其他骨肿瘤亚型，才能做出正确的诊断。本综述基于2019年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）（第5版）新的骨肿瘤分类，通过文献复习，对近10年骨肿瘤的分子病理学更新进行归类和总结。

于PubMed、Medline、ScienceDirect及Ovid数据库搜索关键词"bone tumor" 、"molecular pathology" 、"next generation sequencing" 、"immunohistochemistry" 、"fluorescence in situ hybridization" 、"polymerase chain reaction" ，时间自2010年1月至2020年2月。文献纳入标准：①与上述检索词相关的基础及临床研究；②文献类型为专著、论文或综述。排除标准为：①重复性研究；②质量低、证据等级低的文献；③非英文的外文文献；④无法获得全文的文献。共检索文献494篇，其中英文文献429篇、其他语种文献65篇。应用Endnote软件进行查重，并根据纳入及排除标准进行文献筛选，共剔除文献395篇，最终纳入英文文献34篇，其中综述类文章5篇、病例系列报告及机制研究文献29篇。

一、骨肿瘤常用的分子病理学检测方法

常见的分子病理学检测方法为FISH，其次为聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和一代测序、二代测序。部分基因的突变和缺失也可以通过免疫组化检测下游通路蛋白表达情况来鉴别。

二、骨来源肿瘤分子病理学检测的难点

（一）脱钙骨来源恶性肿瘤的分子检测的难点是需要从标本中提取所需要的DNA和RNA，而骨肿瘤经福尔马林固定、石蜡包埋后DNA 和RNA经常降解[1]。使用冰冻的肿瘤组织比较理想，但临床操作比

较困难。虽然硝酸和其他无机酸的脱钙很快，但会对细胞核产生严重的损伤导致无法进行分子学检测，甲酸等较弱的酸以及另一种螯合剂的复合成分中的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetra-acetic acid，EDTA）既温和又能带走钙离子的脱钙剂，唯一的缺陷是时间较长且会使组织学镜下评估更不准确。因此，使用更弱的有机酸成为目前大多数病理科脱钙的常规方法。

（二）FISHFISH的目的是利用组织切片中的DNA作为目标进行原位杂交，以便发现目标基因。由于FISH很容易在福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片中应用，因此最常使用。虽然有脱钙的问题，但体积分数为5%的甲酸就能保证足够的DNA。FISH经常用来发现染色体异位和基因的扩增。临床上经常使用分离和融合探针（例如对尤文肉瘤）来检测EWSR1，但使用分离探针的时候无法确定其具体融合基因。举例来说，对小圆细胞有EWSR1融合但无ETS融合的尤文样肉瘤，基因可能融合为EWS-NFATc2而非EWS-FLI1，而这两类肿瘤的镜下表现、免疫组化都很类似，因此使用FISH也无法鉴别[2]。而检测基因扩增，例如骨旁骨肉瘤特征性的12q13-15区域的扩增（包含MDM2和CDK4基因）[1]，可以通过FISH来检测，非常实用。

当一种肉瘤含有大量非肿瘤细胞成分的时候，不建议使用FISH。例如动脉瘤样骨囊肿，虽然USP6的重排比例很大，但只限于肿瘤细胞（文献中比例为7%~82%），而镜下这类肿瘤中富含多核巨细胞，因此做

FISH很容易出现假阴性[3]。当然5'着丝粒和3'端粒信号的数量有时候也会导致FISH出现摸棱两可的判断，从而出现假阳性和假阴性。有的时候还会出现非典型的FISH荧光镜下模式，可能提示某一类肿瘤，例如EWSR1-NFATC2，需要有经验的病理科医生进行鉴别。

（三）反转聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）RT-PCR是一种即便在肿瘤细胞很少的情况下仍然可以检测基因异位的非常敏感的手段[4]。但是，引物的设计非常富于挑战，尤其当RNA是从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中提取的时候，还有当某些肿瘤不包含多种融合方式的时候，RT-PCR可以很准确，但是很难被实施。例如尤文肉瘤，虽然85%的融合基因为EWSR1-FLI1，但EWSR1与其他ETS家族成员的融合也需要检测，甚至有少部分不是EWSR1而是FUS基因的融合。因此，需要设计一个复杂的引物来综合解决这些问题。

（四）二代测序目前使用高通量测序技术的二代测序可以在短期内快速获取更多的遗传学信息，从而成为分子病理学发展的方向[4]。虽然全基因组或全外显子测序可以提供肿瘤相对全面的信息，但在临床实践中它并不适合作为大段复杂基因的检测手段，而基于目标基因设计的各类骨肿瘤的小组合面板（PANEL）更适合临床实际应用。例如，可以准确区分骨的巨细胞瘤和软骨母细胞瘤中的H3F3A和H3F3B（表1）；以及检测出特殊的可能致病的点突变，如中央型软骨肉瘤的

IDH1/IDH2突变、纤维结构不良的GNAS突变、朗格汉斯组织细胞增多症的BRAF突变等。

（五）免疫组化染色通过其他技术发现骨肿瘤的分子病理学靶点，而将基因突变的下游产物设计相应的免疫组化底物进行染色，是一种廉价、便捷又实用的分子病理学检测手段，而且可以被应用于经强酸脱钙处理的组织[2]。例如对经典型上皮样血管内皮细胞瘤，钙调蛋白绑定的转录激活剂（calmodulin-binding transcription activator，CAMTA）可作为诊断性标志[5]。针对巨细胞瘤（H3F3A p.G34W）和软骨母细胞瘤（H3F3B p.K36M）点突变下游蛋白的单抗有助于这两者的诊断[6,7]。在软骨来源的肿瘤中，IDH1 p.R132H的点突变也可以通过免疫组化染色检测出来[8]。

三、骨来源肿瘤的分子病理学亚型和更新

2019年新版WHO分型骨来源肿瘤共八大类50多种亚型，其中去掉了"良性骨的纤维组织细胞瘤"和"小骨的巨细胞病灶"两个诊断，而增加了"差分化的脊索瘤"和"纤维软骨性间叶瘤"两个诊断[9]。

（一）软骨来源肿瘤近年来，软骨来源肿瘤中最具特征性的发现当属异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase，IDH）1和2了。IDH1/2是一种体细胞、杂合子、错义的点突变，最早报道于低级别胶质细胞瘤及继发性胶质母细胞瘤[10]。由IDH基因编码的IDH蛋白催化了异

柠檬酸的氧化脱羧过程，产生柠檬酸循环中的α-酮戊二酸和CO2，继而导致下游DNA和组蛋白的过甲酰化，出现肿瘤发生发展过程中不同基因的表达（图2）。据文献报道，良性内生软骨瘤病（如Ollier 病）中约87%可出现IDH基因点突变，中央型非典型软骨的肿瘤或软骨肉瘤1级中有50%~78%含有IDH点突变，而中央型软骨肉瘤2~3级有30%~50%的突变[11]。IDH1有多种可替换的残基，在40%IDH 突变的软骨来源肿瘤中，最常见的位点为R132C，其余的残基包含R132G、R132H、R132L、R132S、R132I、R132Q和R172S[12]。这点与IDH突变相关的脑部肿瘤70%都位于R132H的特征性诊断不同。

图2 异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase，IDH）分子机制图。由IDH基因编码的IDH蛋白催化了异柠檬酸的氧化脱羧过程，产生柠檬酸循环中的α-酮戊二酸和CO2，继而导致下游DNA和组蛋白的过甲酰化状态，出现肿瘤发生发展过程中不同基因的表达

90%以上的软骨母细胞瘤都含有17号染色体的H3F3B K36M突变，少部分病例有位于1号染色体的H3F3A突变，这点与骨巨细胞瘤不同[6]。而IDH1/2突变几乎不出现于软骨母细胞瘤。90%以上的软骨黏液性纤维瘤有6q24重排，导致下游代谢型谷氨酸受体1（metabotropic glutamate receptor, GRM1）蛋白表达[13]。但一般不常规做该分子的检测，靠组织学特征足以诊断。

（二）骨来源肿瘤FOS基因重排可能在骨样骨瘤、骨母细胞瘤和上皮样血管瘤中见到，尤其是骨母细胞瘤，几乎都含有该基因的重排或少见情况下的FOSB基因重排[14]。而MDM2/CDK4（12q13-15）的基因扩增见于近90%的低级别中心型骨肉瘤[15]，有助于与其他良性骨肿瘤的鉴别，但缺乏MDM2扩增并不能排除低级别中心型骨肉瘤的诊断[9]。85%的骨旁骨肉瘤也含有MDM2/CDK4扩增，但该扩增在骨膜骨肉瘤几乎见不到[16]。值得一提的是，约10%的高级别骨肉瘤也存在着MDM2扩增[16]。

对高级别骨肉瘤这样一种复杂基因型、异质性大的肿瘤诊断，最常见的胚系基因为TP53、Rb1和相对少见的RECQ解旋酶[2]。Paget骨病20%~50%有家族性的、10%~20%有散发的SQSTM1突变[9]，部分有TNFRSF11A（RANK）和VCP突变[2]（表2）。

（三）纤维来源肿瘤这一大类包含了骨的促结缔组织增生纤维瘤和骨

纤维肉瘤，但是均没有特征性的分子病理学表型。

（四）骨的血管源性肿瘤59%的骨上皮样血管瘤含有FOS/FOSB基因重排[17]，而89%~100%的骨上皮样血管内皮瘤含有WWTR1-CAMTA1 t （1；3）（p36；q25）的融合[5]。小部分骨上皮样血管内皮瘤中有YAP1-TFE3的融合[9]。这些基因的重排和融合机制未明，可能为致瘤的原因。

（五）富含巨细胞的肿瘤骨巨细胞瘤是一类良性肿瘤，呈浸润性生长，术后易复发。其特征性的基因突变位于H3F3A。Amary等[18]检测了3 163例骨原发肿瘤的H3F3A G34W突变，结果发现97.8%的骨巨细胞瘤含有H3F3A G34W突变。而骨肉瘤等其他类型的肿瘤鲜有表达。该基因突变的下游90%作用于甘氨酸34W（p.Gly34Trp[p.G34W]），但也有小部分人群为甘氨酸34L（p.Gly34Lys[p.G34L]），因此可以使用免疫组化染色寻找下游蛋白的方式来检测该基因的突变[18]。值得一提的是，90%的恶性巨细胞瘤也含有该位点的突变，可作为鉴别恶性巨细胞瘤和毛细血管扩张型骨肉瘤等富含巨细胞成分的其他肿瘤的主要方法[1,2,4]。但是与骨肉瘤类似，10%的恶性巨细胞瘤也含有TP53的突变[19]。骨巨细胞瘤的肿瘤细胞间含有大量破骨细胞产生的小分子RANKL介导的骨质破坏（图3），因此出现了以地舒单抗为靶点的治疗手段[20]地舒单抗治疗后镜下往往出现破骨细胞样的多核巨细胞消失和骨化。

图3 地舒单抗作用于RANKL靶点机制图。核因子kappa B受体激活剂的配体（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）激活了破骨细胞生长和分化。而地舒单抗为RANKL的人源化单克隆抗体，高亲和度地结合在RANKL上，阻抑RANKL与破骨细胞前体表面的RANK结合，从而阻抑了破骨细胞的形成，避免骨质破坏与骨质吸收

动脉瘤样骨囊肿是一类起源于长骨干骺端的充满血液的多囊性良性肿瘤。70%以上包含USP6 17p13.2基因重排[3]。可以通过FISH来检测，但经常是病灶中肿瘤细胞含量太少而血性囊壁成分或基质细胞成分太多，导致FISH结果假阴性。有临床报告证实超过80%的非骨化性纤维瘤含有KRAS和FGFR1突变[21]，但并不认为这些突变位点是特征性的诊断指标。

（六）脊索的肿瘤新版WHO骨肿瘤分类中脊索肿瘤分为以下四类：良性脊索细胞的肿瘤、普通脊索瘤、去分化脊索瘤和差分化脊索瘤（表3）。其中，差分化脊索瘤是新的诊断[9]。普通脊索瘤是起源于脊索残余组织的恶性肿瘤，主要发生在颅底和骶尾部，在肿瘤内部及肿瘤之间均有形态学异质性。而参与脊索组织发生发展的鼠短尾突变体表型[9]转录因子仅见于脊索瘤，在98%的脊索瘤中有表达，可通过下游的蛋白免疫组化染色来检测。

差分化脊索瘤是一类特征性含有SMARCB1缺失22q11

（hSNF5/INI1）的、多见于中轴骨、镜下几乎看不见脊索特征的肿瘤[22,23]。该肿瘤多见于儿童，少数情况下见于年轻的成人，女性发病是男性的两倍；全世界文献报道的病例数在60例以下，预后相对于普通脊索瘤差。但这个特征性的INI1基因缺失却是一个用药的靶点，组蛋白甲基化转移酶2（Enhancer of zeste homolog 2，EZH2）的抑制剂Tazemetostat也许有可持续的疗效[24,25,26]。

（七）其他间叶来源的骨肿瘤在新版的其他间叶来源的骨肿瘤中添加了"纤维软骨性间叶瘤的"诊断，但是该亚型的肿瘤缺乏GNAS/IDH突变，也没有MDM2扩增。而50%~70%的纤维结构不良有GNAS基因突变[27]，该突变与Wnt/β-catenin通路相关，可能成为治疗的靶点。

（八）骨的造血系统肿瘤骨的造血系统肿瘤不是骨原发恶性肿瘤，其治疗靶点和特征主要根据血液系统肿瘤的特点来进行。主要包含有以下几类：骨的孤立性浆细胞瘤、骨的非霍奇金淋巴瘤、朗格汉斯组织细胞增多症、Erdheim-Chester病和Rosai-Dorfman病[9]，其特征性基因改变如表2所示。

（九）基因源性骨与软组织肿瘤综合征部分骨与软组织肿瘤综合征源于特征性基因型（表4）。文献报道中87%的内生软骨瘤病（Ollier 病或Maffucci综合征，后者在内生软骨瘤的基础上合并有梭形细胞血管瘤）的内生软骨瘤成分中含有IDH1突变，而70%的梭形细胞血管瘤（Maffucci综合征）成分中也含有IDH1突变。研究证实IDH1

的突变可能与肿瘤的成因有关[11]。

Li-Fraumeni综合征是一类常染色体显性突变的症候群，其诊断依据为：小于45岁发病；存在亲属遗传性；29%的患者有胚系突变的TP53基因且有各种不确定的TP53变异亚型。但此基因在Li-Fraumeni综合征成因中的机制尚未明确[28]。

McCune-Albright综合征是一种特征性的骨纤维结构发育不良，皮肤存在牛奶咖啡斑和机能亢进的内分泌疾病综合征。有文献报道McCune-Albright综合征存在G蛋白活化突变，但不是特征性的诊断标准，且出现概率不明[29,30]。

70%~95%的多发骨软骨瘤病存在胚系的EXT1/EXT2突变，且存在EXT1突变者预后差。但这个基因型不是诊断所必须的[3]。

95%的神经纤维瘤病1型存在NF1（17q11.2）的失活突变，而5%存在NF1的微缺失[11]。该常染色体显性遗传综合征的特征性表现为牛奶咖啡斑、腋窝和腹股沟雀斑、虹膜色素缺陷瘤、全身多发神经纤维瘤和神经纤维瘤恶变。NF1的微缺失且有SUZ12基因同步缺失的患者更容易形成恶性外周神经鞘瘤。NF1基因的缺失可导致该信号通路下游的RAS通路激活，而RAS通路下游的MEK靶点的抑制剂可阻抑该信号通路的活化，进一步作为该疾病药物治疗的靶点。MEK抑制剂——司美替尼（Selumetinib，AZD6244）的Ⅰ期及Ⅱ期临床试验取得了不错的疗效[31]。

（十）难以区分的骨与软组织的小圆细胞恶性肿瘤经典的小圆细胞恶性肿瘤主要包括尤文肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤（desmoplastic small round cell tumor，DSRCT）等，因病理表现为肿瘤细胞较小、核染色深，又被称为小蓝圆细胞肿瘤；在骨与软组织肉瘤的分类上横跨了骨肿瘤和软组织肉瘤两类。随着分子病理诊断技术的进步，骨来源小圆细胞肿瘤家族的划分日益明确（表5）。

根据WHO 2019版分型，有EWSR1或FUS重排的肿瘤可根据其融合的伙伴基因分为两种：EWSR1或FUS基因[32]与ETS家族转录因子融合者定义为尤文肉瘤；而EWSR1或FUS与非ETS伙伴基因融合者定义为"有EWSR1-非ETS融合的小圆细胞肉瘤"，取消了之前尤文家族肿瘤的定义。

尤文肉瘤的分子遗传学特点较为复杂。t（11；22）（q24；q12）是典型尤文肉瘤的遗传学改变，它形成EWSR1-FLI1融合基因，且在此基因框架下可能形成18种框内嵌合性转录因子[33]。除FLI1外，有很多属于ETS转录家族的次要伙伴基因，如ERG、ETV1/4、FEV，也可与EWSR1或FUS形成融合，同属尤文肉瘤范围；对"有EWSR1-非ETS融合的小圆细胞肉瘤"，EWSR1或FUS的融合伙伴基因常见有NFATC2、PATZ1、VEZF1等[34]。在流行病学方面，与经典FLI1融合相比，FEV和NFATC2融合的患者年龄较大，骨外病灶的比例更高。在整体预后方面，与经典FLI1融合相比，非FLI1融合的肉瘤初治时发现转移的比率较高，总生存期更短[32]。此外，EWSR1-WT1是一类特殊的"有EWSR1-非ETS融合的小圆细胞肉瘤"，它是DSRCT的

分子遗传学标志。随着分子病理诊断技术的进步和普及，在EWSR1或FUS重排的基础上，未来会有更多的伙伴基因和框内嵌合性转录因子被发现。

除EWSR1或FUS重排外，此前一些小圆细胞肿瘤如BCOR-CCNB3、CIC-DUX4[34]也被归为尤文家族肿瘤名下。但根据WHO 2019版分型，这两种基因异常的肿瘤被单独列出，从尤文家族肿瘤中分离了出来，单独以融合基因的名称进行命名。

综上所述，分子病理学检测为骨来源的恶性肿瘤提供了新的诊断思路和治疗线索，是未来病理学发展的方向。对具备简单核型的骨肿瘤，可通过二代测序或FISH来直接鉴别基因，抑或通过免疫组化染色鉴定下游通路的蛋白表达来判断肿瘤亚型；而针对复杂核型的骨肿瘤，可通过分子病理学检测方法排除镜下类似的骨肿瘤亚型来明确诊断。应进一步深入探索这些遗传学信息背景下的分子信号通路，为进一步药物治疗靶点的选择、生物学标记物的选择以及预后的预测提供更多有价值的信息。