试验十一植物组织中可溶性糖淀粉氨基酸及蛋白质的系列测定
实验十一植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的
系列测定
一、实验目的：
从一份植物样品中系统分离和测定可溶性糖淀粉氨基酸及蛋白质等多种成分，不仅对研究植物碳氮代谢，了解植物的生长发育状况有重要意义，也可以作为鉴定其品质的重要指标，另外也有助于训练基本操作技能。
二、实验原理
（一) 分离提取原理
在80%~85%的乙醇中，植物组织中的还原糖，蔗糖以及游离氨基酸和叶绿素等溶解，而淀粉及蛋白质沉淀，再用9.2mol/L高氯酸溶解淀粉（蛋白质沉淀），最后用0.1mol/L氢氧化钠溶解蛋白质。选用适当的方法测定各个提取液中相应物质的含量。
（二）测定原理
1.蒽酮比色法——可溶性糖含量测定
碳水化合物及其衍生物经浓硫酸处理，生成糠醛，再与蒽酮脱水缩合而生成蓝绿色化合物，在一定范围内，其颜色深浅与碳水化合物含量呈线性关系，蒽酮反应的颜色深浅，随温度条件和加热时间而变化，葡萄糖显色高峰在100℃时，加热10min后出现，而核糖在相同温度下，加热3min出现。此法灵敏度高，糖含量达30μg即可测定。
2.茚三酮比色法——氨基酸含量测定
氨基酸的游离氨基与水和茚三酮作用后，产生二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，在570nm下有最大光吸收，在一定范围内，其颜色深浅与氨基酸的含量成正比。
3.考马斯亮蓝G-250结合法————蛋白质含量测定
考马斯亮蓝G-250在游离状态时成红色，当与蛋白质结合后成青色，后者最大光吸收在595nm，在一定范围内（0~1000μg/ml），其颜色深浅与蛋白质的含量成正比，此法快速灵敏，反应在2min内即达到平衡，室温1h内颜色稳定，而且干扰物也少。
三、仪器、试剂和材料
1、仪器
（1）25ml刻度试管×8,15ml试管×20
（2）10ml离心管×2
（3）容量瓶50ml×1,25ml×1
（4）移液管5ml×2,2ml×4,1ml×2,0.1ml×2
（5）洗耳球
（6）恒温水浴锅
（7）离心机
（8）电子天平
（9）分光光度计
2、试剂
1.样品分离提取
80%乙醇，9.2mol/l高氯酸，4.6mol/l高氯酸，0.1mol/l氢氧化钠，
2..可溶性羰基淀粉测定
（1）葡萄糖标准溶液（100μg/ml）：0.1g无水葡萄糖溶于蒸馏水中，定容至1000ml （2）硫酸蒽酮试剂：0.2g蒽酮，1g硫脲（阻氧化剂），缓缓加入100ml浓硫酸，边加边搅拌，溶解后成黄色透明溶液，处于棕色瓶中，4 冰箱中保存。
3.氨基酸测定
（1）60%乙醇
（2）水合茚三酮：1.2g茚三酮，加入30ml正丙醇，搅拌使其溶解，再加入60ml正丁醇和120ml乙二醇，最后加入18mlPH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液混匀，储于棕色瓶，4℃冰箱中保存。
（3）乙酸-乙酸钠缓冲液（PH5.4）：乙酸钠54.4g，加入100ml蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至原体积的一半，冷却后加30ml冰醋酸，用蒸馏水稀释至100ml。
（4）标准氨基酸（200μg/ml）：取80℃下烘干的亮氨酸20mg，溶解在10%的异丙醇中，并用10%异丙醇稀释至10ml，取5ml，用蒸馏水稀释至50ml。
（5）0.1%抗坏血酸：50mg抗坏血酸溶于50ml蒸馏水中，现用现配。
4.蛋白质含量测定
(1)牛血清白蛋白标准液（1000μg/ml）：100mg牛血清白蛋白溶于100ml蒸馏水中，处于4℃冰箱中
(2)考马斯亮蓝G-250溶液：100mg考马斯亮蓝G-250溶解于50ml95%的乙醇中，加入85%（m/V）磷酸100ml，用蒸馏水定容至1000ml。
四、操作步骤
(一)分离提取（每次离心转速3000~3500r/min）
1、取1g植物样品，
加80%乙醇并研磨成匀浆，转移至10ml离心管中，80℃水浴浸提10min，冷却离心5min，上清液倒于25ml容量瓶中，定容至刻度（沉淀留用）
2、上清液部分：从25ml容量瓶中取2.5ml放入10ml离心管中，蒸干，准确加入5ml水搅拌，离心取上清液，从中取适量测定可溶性糖及游离氨基酸含量
3、沉淀部分：加水2ml，沸水浴活化15min，冷却后加9.2mol/L高氯酸2mL，搅拌，15min 后加水2ml，离心10min
，上清液倾入50ml容量瓶，沉淀部分加2ml4.6mol/l，高氯酸搅拌15min后加水3ML混匀，离心10min，上清液倾入50ml容量瓶，水洗一次（4ml），离心10min，上清液倾入50ml容量瓶，取用沉淀部分，50ml容量瓶中即淀粉待测液。
4、沉淀部分加入5ml0.1mol/lNaOH搅拌，浸提1h（室温），离心10min，上清液倾入25ml 容量瓶，沉淀部分再加5ml0.1mol/lNaOH搅拌，浸提0.5h，离心10min，上清液倾入25ml 容量瓶，沉淀部分再加5ml0.1mol/l，NaOH搅拌，浸提15min，离心10min，上清液倾入25ml 容量瓶，沉淀弃去，25ml容量瓶中即蛋白质待测液。
（二）测定
1.可溶性糖及淀粉的测定
（1）按下表制作标准曲线
葡萄糖标准曲线制作
试管号
1 2 3 4 5 6 7
蒸馏水/ml 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8
葡萄糖标准溶液100μ
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
g/ml
硫酸-蒽酮/ml 5 5 5 5 5 5 5
加入硫酸-蒽酮试剂时，最好将各管放在冷水中，沿管壁缓缓加入，全部加完后再混匀，将以上各管在100 水浴中加热10min，取出后用自来水冷却，620nm比色测定。
（2）样品测定
去可溶性糖提取液1ml+1ml 蒸馏水（根据含量而定），显色与标准曲线相同。 （3）计算
可溶性糖含量=
%1001000mg ml g ××××）
样品重（稀释倍数
显色用样液体积）
样品液总体积（）
查标准曲线数（m
2.淀粉测定
吸取上述淀粉提取液2ml （或1ml+1ml 水）于大试管中，用测定可溶性糖的方案测定。
%
1001000mg ml 9.0g ××××
×=
）样品重（稀释倍数
显色用样液体积）
样品液总体积（）查标准曲线数（淀粉含量m
3.游离氨基酸含量测定
（1）按下表制作标准曲线 试剂/ml 试管号 1 2 3 4 5 6 标准亮氨酸 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 蒸馏水 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.1 水合茚三酮 3 3 3 3 3 3 抗坏血酸
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
加完试剂后混匀，置沸水浴加热15min ，然后取出放在冷水中，迅速冷却并摇动，
使加热时形成的红色逐渐被氧化而褪色，直至溶液成紫色时用60%的乙醇定容至10ml 混匀，570nm 比色测定。 （2）样品测定
吸取上述样品提取液2ml （或1ml+1ml 水），显色与标准曲线相同。 （3）计算氨基酸含量（mg/100g 干样品）
氨基酸含量=
%1001000
mg ml g ××××
）样品重（稀释倍数
显色用样液体积）
样品液总体积（）查标准曲线数（m
4.蛋白质含量测定
（1）按下表制作标准曲线
蛋白质标准曲线制作
试管号 1 2 3 4 5 6 蒸馏水
1
0.8 0.6 0.4 0.2 0 1000μg/mL 牛血清白蛋白 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
混匀后，分别准确吸取各试管0.1ml 至另外6个试管中，加5ml 考马斯亮蓝G-250试剂，混匀，放置2min 后，595nm 比色测定。 （2）样品测定
准确吸取蛋白质提取液0.1ml ，显色与标准曲线相同。 （3）计算
蛋白质含量=
%1001000
mg ml g ×××
）样品重（显色用样液体积）
样品液总体积（）查标准曲线数（m
五、思考题
从植物样品中进行可溶性糖、氨基酸及蛋白质系列提取和测定应注意哪些问题？
参考资料
（1） 王冬梅，吕淑霞，王金胜.生物化学实验指导.北京：科学出版社，2009:39-41