小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定_代阳
第21卷 第1期 天 津 农 学 院 学 报 V ol. 21，No. 1 2014年3月 Journal of Tianjin Agricultural University March ，2014
收稿日期：2013-12-19
基金项目：国家自然科学基金项目“牛骨骼肌卫星细胞成肌分化相关miRNAs 的鉴定和功能研究”（31201021）；天津市自然科学基金项
目“microRNA-1对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控作用研究”（13JCQNJC14600） 作者简介：代阳（1988-），女，内蒙古通辽人，硕士在读，研究方向为动物胚胎与转基因工程。E-mail: aq19881209@https://www.360docs.net/doc/da10677354.html,。 文章编号：1008-5394（2014）01-0001-04
小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定
代阳1
，王轶敏
1，2
，刘新峰1，樊晗璐1，李吉霞1，郭宏1，丁向彬
1，通信作者
（1. 天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384；2. 西北农林科技大学 生物工程研究所，陕西 杨凌 712100）
摘 要：采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞，应用差速贴壁法进行纯化，
并利用RT -PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。结果显示：分离出的肌卫星细胞生长状态良好，RT -PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达，诱导分化形成肌管后，分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞，并具有很好的体外分化能力，可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。
关键词：小鼠；骨骼肌卫星细胞；细胞培养；鉴定
中图分类号：Q813.1 文献标识码：A
Isolated Culture and Identification of Mouse Skeletal Muscle Satellite Cells
DAI Yang 1
, WANG Yi-min 1,2
, LIU Xin-feng 1, F AN Han-lu 1, LI Ji-xia 1,
GUO Hong 1, DING Xiang-bin 1,Corresponding Author
(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Institute of
Bioengineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaa n xi Province, China )
Abstract: In this study, mouse skeletal muscle satellite cells were isolated by collagenase and trypsinase digestion method. Then the satellite cells were purified and induced to differentiate into myotubes, and the marker genes of the cells before or after the differentiation were detected by RT-PCR and immunocytochemistry technology. The results show that the isolated muscle satellite cells were healthy, and expressed the marker genes of paired protein box (Pax7) and myogenic differentiation antigen (MyoD ). After inducing to the myotubes, myogenin (MyoG ) and myosin heavy chain (MHC )showed positive expression. The results indicate that mouse skeletal muscle satellite cells of high purity, which can provide cell sources for muscle development and damage repair study, are successfully isolated.
Key words: mouse; skeletal muscle satellite cell; cell culture; identification
骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cell）是骨骼肌中具有分化增殖潜能的肌源性干细胞，通
常以静息状态存在于肌纤维肌膜与基底膜之间[1]
，在一定条件下可以被激活，发生增殖和分化，形
成骨骼肌细胞。1961年，Mauro [2]
首次在蛙的肌肉中发现了肌卫星细胞，其后，有多种动物的肌卫星细胞被成功分离，并进行了体外培养。肌卫星细胞在肌肉的发育和再生中发挥了重要作用，而
肌卫星细胞的增殖和分化受众多因素的影响[3]
，目前，其分离效率仍然很低，建立高效的体外培养、鉴定与诱导分化方法仍然是卫星细胞研究和利用的关键。本研究采用胶原酶和胰蛋白酶联用的酶消化法从小鼠肌肉组织中分离肌卫星细胞，并对其进行了诱导分化和鉴定，以期为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供参考。
1 材料和方法
1.1 实验材料 1.1.1 实验动物
10日龄昆明小鼠，体重约3.2 g。 1.1.2 主要试剂
胎牛血清（Gibco）；马血清（Gibco）；DMEM 高糖培养基（Hyclone）；胶原酶Ⅱ（Sigma）；0.25%胰蛋白酶溶液（索来宝）；青链霉素混合液（10 000 m g /L青霉素、10 000 m g/L链霉素，索莱宝）；PBS （自配）；4%多聚甲醛、山羊封闭血清、羊抗兔Cy3标记二抗、羊抗兔FITC标记二抗、羊抗小鼠FITC 标记二抗（武汉博士德）；DAPI、兔抗Pax7抗体、兔抗MyoD抗体、兔抗MyoG抗体（北京博奥森）；鼠抗Myosin抗体（中杉金桥）；TRIzol试剂（Invitrogen）；
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反转录试剂（Takara）；PCR试剂（康为世纪）；细胞培养板、离心管、培养皿等（Corning）。
1.2 实验方法
1.2.1 小鼠肌卫星细胞分离培养
将小鼠颈椎脱臼处死后，浸泡于75%酒精中消毒5 min，然后在无菌条件下剥开后肢皮肤。将后肢切下后于平皿内小心去掉脂肪和骨骼，留肌肉组织。将肌肉组织用PBS冲洗后，于无菌平皿中用眼科剪反复剪碎至1 mm3大小。组织块置PBS中静置，弃上清液。将PBS清洗后的组织块置于适量0.2%胶原酶Ⅱ中，于37 ℃消化1 h，每10 min振荡一次。1 000 r/min离心10 min后弃上清液，再加入0.25%胰酶，于37 ℃消化30 min，每10 min振荡一次。之后，加入含血清的生长培养基（含20%胎牛血清的DMEM培养基）终止消化，细胞悬液分别过100、200和400目细胞筛，过滤后的细胞悬液于1 000 r/min离心10 min，弃上清液，细胞沉淀用生长培养基重悬后接种于60 mm直径培养皿内，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
1.2.2 肌卫星细胞纯化及传代培养
采用差速贴壁方法进行纯化，分离出的细胞在培养箱中培养2 h，此时贴壁细胞主要为成纤维细胞。然后，将未贴壁细胞转入新的培养皿中培养，第4天换液，去除血细胞及未贴壁的死细胞，并观察细胞生长情况。
细胞生长至70%汇合时传代，弃去培养皿中培养基，PBS洗涤1～2次后加入适量0.25%胰酶消化液，显微镜下观察，细胞胞质回缩、开始变圆时用手轻拍培养皿。当绝大部分细胞脱落后，立即加入含血清培养基终止消化，细胞悬液用枪头反复吹吸后，于1 000 r/min离心10 min，弃上清液，细胞沉淀重悬后按1∶2或1∶3接种于新培养皿内，3～5 d 传代一次，每次传代均差速贴壁30 min，以去除成纤维细胞。
1.2.3 肌卫星细胞诱导分化
肌卫星细胞传代培养贴壁后，将培养基更换为分化培养基（含2%马血清的DMEM）进行成肌诱导分化培养，观察肌卫星细胞分化情况及肌管形成状态。
1.2.4 免疫染色鉴定
对纯化后的肌卫星细胞和诱导分化后的肌管进行免疫荧光染色鉴定。细胞经PBS清洗1～2次后，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，每次5 min；然后，用含0.1% Triton X?100的PBS 透化处理20 min，PBS洗涤3次，每次5 min；之后，正常山羊血清封闭30 min，弃去血清，不洗，分别加入Pax7、MyoD、MyoG和MHC一抗（1∶100）， 4 ℃过夜，PBS洗涤3次，每次5 min；再加入相应的FITC或Cy3标记二抗（1∶100），37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次，每次5 min；最后，加入DAPI染核，荧光显微镜观察。
1.2.5 RT-PCR鉴定
采用TRIzol法提取未分化肌卫星细胞和分化后肌管总RNA，按照RT-PCR试剂盒说明，以Oligo （dT）15和随机引物为引物，在20 μL体系中合成cDNA，以cDNA为模板，加入Pax7、MyoD、MyoG 和MHC基因上、下游引物进行PCR，GAPDH作为内参照，引物序列见表1。25 μL体系反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环35次；72 ℃延伸2 min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统采集图像。
表1 小鼠Pax7、MyoD、MyoG、MHC和GAPDH
基因引物序列表
名称序列（5’?3’）
扩增产
物/bp
上游引物CCCTCTGGAGACGGAAAACC
Pax7
下游引物GCTCTGTGACTGAGGACACC
310
上游引物TTTCGACTCACCAGACCTGC
MyoD
下游引物GAGA TGCGCTCCACT A TGCT
675
上游引物GAGGAAGTCTGTGTCGGTGG
MyoG
下游引物CCACGA TGGACGT AAGGGAG
395
上游引物GCA TCCCT AAAGGCAGGCTC
MHC
下游引物GCCACTTGT AGGGGTTGACA
446
上游引物TGAAGGGTGGAGCCAAAAGG GAPDH
下游引物TGAAGTCGCAGGAGACAACC
525
2 结果与分析
2.1 小鼠肌卫星细胞分离培养及形态学观察
原代肌卫星细胞分离培养前两天仅有少量细胞贴壁（图1a、1b），第3天有更多细胞开始贴壁（图1c、1d），第4天可以换液，此时细胞中成纤维细胞较多。经过两次差速贴壁纯化，细胞纯度增加，第3代肌卫星细胞相对纯度较高，细胞生长状态良好，生长方式和形态特点一致（图1g、1h）。肌卫星细胞开始贴壁生长时呈梭形，折光性强，散在分布（图1）。培养一段时间后，细胞密度增大，并开始出现方向性，密度继续增大后应及时传代。分化培养基培养可诱导肌卫星细胞进入分化状态，加分化培养基后第2天，开始出现零星肌管（图2a、2b），在分化培养基添加后的第5天形成大量肌管，并排列成束，肌管状态良好，大部分肌管可观察到自发性跳动现象（图2c、2d）。
第1期代阳，等：小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定?39
?
图1 小鼠肌卫星细胞分离及纯化
（注：原代分离出的细胞a. 100×，b. 200×；第3天细胞开始贴壁c. 100×，d. 200×；
第2代肌卫星细胞e. 100×，f. 200×；第3代肌卫星细胞g. 100×，h. 200×）
图2 小鼠肌卫星细胞诱导分化
（注：加分化培养基第2天开始有肌管出现 a. 100×, b. 200×；加分化培养基第5天有大量肌管形成 c. 100×, d. 200×）
2.2 小鼠肌卫星细胞免疫染色和RT-PCR鉴定
纯化后的肌卫星细胞RT-PCR检测结果显示，肌卫星细胞静止期和增殖期的标志基因Pax7和MyoD呈阳性表达（图3），经Pax7和MyoD免疫细胞化学染色，结果显示，分离纯化出的细胞呈阳性反应（图4），胞核着色。随机选择免疫染色片子中的5个视野，计数阳性细胞率，发现第3代平滑肌细胞纯度可以达到92%。
图3 小鼠肌卫星细胞标志基因RT-PCR检测
（注：M为marker，GAPDH为内参基因，下同）
图4 小鼠肌卫星细胞免疫染色鉴定
（注：a为Pax7，200×；b为MyoD，100×）
2%马血清分化培养基培养后第5天，有大量肌管形成。RT-PCR检测显示，肌卫星分化标志基因MyoG和MHC阳性，且表达水平较高（图5）。免疫荧光染色结果也显示MyoG和MHC在诱导分化
后的肌管内表达，MyoG在分化早期就开始表达，胞核着色，而MHC在肌管胞质中高表达（图6），说明分离出的肌卫星细胞具有很好的成肌分化能力。
图5 小鼠分化肌卫星细胞标志基因RT?PCR检测
图6 小鼠肌卫星细胞分化后免疫染色鉴定
（注：a为MyoG，200×；b为MHC，200×）
3 讨论
肌卫星细胞的数量和比例随动物年龄的增加而不断减少，出生时卫星细胞含量较多, 约为32%[4]，成年鼠稳定在1%～5%[5]。因此，要分离大量骨骼肌卫星细胞，材料选择是关键。本研究发现，10日龄左右小鼠作为实验材料比较好，因为日龄太小时，肌肉组织很少，骨组织柔软脆弱，很难将脂肪组织、骨组织和筋腱去除干净，从而造成分离出的杂细胞较多；而日龄太大，卫星细
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胞数量较少，也会影响分离效果。
肌卫星细胞的分离多采用分步酶消化法，由于在分离肌卫星细胞时往往掺杂着其他细胞，使得要获得大量高纯度的肌卫星细胞极其困难。文献曾报道过多种纯化方法，如差速贴壁法[6]、反复差速贴壁法[7]、Percoll非连续密度梯度离心法[8]以及改良纯化方法[9]等，但如何快速、高效、经济地获取足量的高纯度肌卫星细胞仍需不断摸索。本研究采用胶原酶和胰酶联合消化的方法分离肌卫星细胞，采用差速贴壁法对卫星细胞进行纯化，分离出的细胞在培养箱中差速贴壁2 h，在每次传代时也差速培养30 min，以去除成纤维细胞，经过2～3次差速贴壁处理，大部分成纤维细胞被去除，在第3代时，肌卫星细胞的纯度已达到90%以上，细胞生长状态良好。由于差速贴壁法操作简单，不需要复杂的操作步骤和试剂，比较适合用于肌卫星细胞的分离培养。
肌卫星细胞在10%～20%血清的营养条件下以分裂增殖为主，在1%～5%血清的低营养条件下以分化为主[10]。本研究采用含2%马血清的分化培养基进行诱导分化培养，第2天开始有零星肌管出现，第5天时可以形成大量肌管，肌管状态良好，大部分肌管可以观察到自发性跳动。研究中也发现，原代分离的肌卫星细胞最好在密度不超过70%时就进行传代培养。传代不及时，部分细胞会自发进入分化状态，即使在20%血清的培养基中也会有肌管出现，但可能是分离出的卫星细胞中有一部分在分离时已经进入了成肌细胞的分化状态，或可能是细胞密度增大后，卫星细胞相互接触，从而自发融合形成肌管。所以，肌卫星细胞分离出来后，要及时传代。
各种标志基因是对不同阶段细胞进行鉴定的依据，已知Pax7是静止期和增殖期肌卫星细胞的重要标志蛋白[11]，生肌决定因子（MyoD）是成肌细胞增殖的标志[12]，肌细胞生成素（Myogenin，MyoG）和肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）基因在分化时和分化后期表达可作为细胞分化的标 志[13-14]，因此，通过对标志基因的检测，可以对卫星细胞进行鉴定。本研究采用免疫荧光染色和RT-PCR方法对肌卫星细胞的标志基因进行了检测，结果显示肌卫星细胞Pax7和MyoD基因阳性表达，说明分离出的细胞为骨骼肌卫星细胞，诱导分化后的肌管Myogenin和MHC基因呈阳性表达，说明分离出的肌卫星细胞具有很好的成肌分化能力。
综上所述，本研究采用胶原酶和胰酶联合消化法，成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞，细胞生长状态良好，纯度较高，低血清诱导后可以分化成状态良好的肌管，可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。
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骨骼肌卫星细胞的研究现状
骨骼肌卫星细胞的研究现状 阎振鑫S111666（四川大学生命科学学院细胞生物学专业成都） 摘要：肌卫星细胞是目前公认的骨骼肌干细胞，负责骨骼肌生长和损伤修复。干细胞研究 成为医学研究领域的热点，肌卫星细胞移植成为治疗骨骼肌损伤萎缩和心肌坏死的新的治疗方案，具有广阔的前景。肌卫星细胞的体外培养中大多采用胰酶胶原酶两步消化法得到细胞悬液。在原代培养中最关键的是细胞的纯化。防止成纤维细胞的污染，主要是采用查速铁壁的方法将细胞分离。胰岛素多肽家簇、MyoD转录因子家族和MEF2家族等对肌肉的形成起重要的调控作用。 关键词：骨骼肌卫星细胞体外培养干细胞移植 肌卫星细胞是小的单核梭形细胞，是源于胚胎中胚层的干细胞，在正常骨骼肌中，它位于基底膜与肌纤维浆膜之间，处于静止状态。当受到外界刺激，在应激状态下可以分裂、增生，形成新的肌纤维，是骨骼肌再生的储备力量，负责骨骼肌的生长和损伤修复。因此,肌卫星细胞特有的成肌能力倍受重视[1-4]。目前，干细胞研究成为医学领域研究的热点，肌肉干细胞因直接参与分化骨骼肌而受世人关注。胚胎和成体内都存在肌肉干细胞，成人体内存在两类具有干细胞样特性的细胞，一类称为卫星细胞(Satellite Cells，SC)也叫成肌祖细胞(Myogenic Progenitor Cell，MPC)，另一类称为肌源干细胞(Muscle Derived Stem Cell，MDSC)，也叫群旁细胞(Side Population S，SP)，后者在数量上远少于前者。目前公认的肌肉干细胞主要是指肌肉卫星细胞[5]。 近年来，国外有报道将肌卫星细胞移植到冻伤的骨骼肌中，可改善肌肉功能[6]。组织缺损或器官功能障碍是人类保健中发生频繁、危害性大、花费高的问题之一。近年来随着组织工程技术的发展，应用肌组织工程技术，进行骨骼肌再生代替以往的手术方法修复动力性瘫痪，以其特有的优点避免了以往手术的缺陷，为瘫痪肌肉的动力修复开创了一个崭新的研究前景。另外，骨骼肌可能会通过分泌低分子量细胞因子即骨骼肌源性抑瘤物显著抑制肿瘤细胞生长[7-10]。现就肌卫星细胞的研究现状作一综述。 1肌卫星细胞的体外培养 1961年Mauro首先发现了肌卫星细胞，并推测肌卫星细胞实质上是一种处于休眠状态下的成肌细胞[11]，是肌细胞核的一种来源。肌卫星细胞作为肌组织工程技术的种子细胞，它的体外培养、鉴定及生物学特性已有大量实验研究，取得了显著的成果[ 12 ]。培养肌卫星细胞的材料来源，目前多数取自兔、鼠、犬、鸡等的肌肉组织，人体肌卫星细胞的培养已有报道，培养方法多采用胰酶、胶原酶分步消化，分离出单个成肌细胞，通过差速贴壁法去除混杂的成纤维细胞，再进行单层细胞培养。在这些步骤中纯化卫星细胞防止纤维细胞的污染是关键，在这个步骤中较好的做法是：采用PrePlate差速贴壁法进行细胞纯化，去除杂质细胞的污染。将细胞接种于明胶包被的培养瓶中培养2h，贴壁细胞为P1P；未贴壁细胞悬液转皿培养12h，贴壁的细胞为P1P2；未贴壁细胞悬液再转皿培养24h，贴壁的细胞为P1P3，未贴壁细胞悬液转皿培养24h，贴壁的细胞为P1P4；再次将未贴壁的细胞悬液转皿培养24小时，贴壁的细胞为P1P5。P1P5培养3d后换液，以后隔天换液1次，倒置显微镜下观察，
肌肉卫星细胞
肌肉卫星细胞是骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性细胞。它们在一般情况下是处于静息状态的，当被激活后，具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌细胞的能力。在那里它们通过形成与肌肉纤维融合的先驱细胞来对损伤做出反应。有研究报告说，它们能充当干细胞，但卫星细胞群的混合性质意味着，它们的干细胞身份难以证明。” “最新一期Nature刊登由美国斯坦福大学医学院的Sacco等人的研究结果：研究小组通过利用克隆分析证实卫星细胞的确是干细胞、能够自我更新，从而澄清了相关问题。他们将一个表达荧光素酶的卫星细胞移植进了小鼠的肌肉中，发现它能够大量增殖，有助于肌肉纤维的形成，而且可以被再次移植。因此断定肌肉卫星细胞也是一种干细胞。” 肌肉中肌肉卫星细胞非常多。我们在进行性肌营养不良的肌肉病变中很容易发现大量的由卫星细胞分化而来的再生细胞。然而，这些干细胞中缺乏、缺损某些膜蛋白基因。因此，即使发生再生，也只能再生膜功能缺损肌纤维，免不了肌纤维变性坏死的命运。 我们实验室的研究重点是，如何保护膜蛋白缺损的肌纤维，而不是通过基因治疗，如何根治肌营养不良。因为目前世界上哪一个实验室也做不到这一点，某些研究成果，即使在动物身上似乎有效，但人身上还是没有得到证实。 在肌肉修复功能 当肌肉细胞进行损伤，静止卫星细胞从基底膜下方的释放。他们被激活，并重新进入细胞周期。这些分裂的细胞被称为“过境放大池”前接受生肌分化，形成新的肌管（有丝分裂后）。也有证据表明这些细胞能够与现有的肌纤维融合，促进生长和修复。 肌肉再生的过程，涉及相当大的重塑细胞外基质，并发生了广泛的破坏，是不完整的的。肌肉存款瘢痕组织成纤维细胞内，这可能削弱肌肉的功能，是一个的重要组成部分肌营养不良症的病理。 卫星细胞增殖肌肉损伤（西尔，等，2003），并形成新的肌纤维，通过对胎儿肌肉的发育（帕克等人，2003年）的过程类似。经过多次细胞分裂，卫星细胞开始与周边核保险丝损坏的肌管，并进行进一步的分化和成熟，作为标志（帕克等，2003）。 IGF - 1所描述的第一个角色之一是其在卫星细胞的增殖和分化的参与。此外，骨骼肌中IGF - 1的表达能力扩展激活卫星细胞的增殖（Charkravarthy，等，2000），增加和延长beneficaleffects老化的肌肉。 评述：Mourkioti和Rosenthal（2005），免疫学的发展趋势，第26卷，第1 号霍克和加里（2001），应用生理学杂志，19卷，第534-551 可塑性和治疗中的应用卫星细胞在体外或体内最小的刺激后，将经历一个生肌分化。
小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定_代阳
第21卷 第1期 天 津 农 学 院 学 报 V ol. 21，No. 1 2014年3月 Journal of Tianjin Agricultural University March ，2014 收稿日期：2013-12-19 基金项目：国家自然科学基金项目“牛骨骼肌卫星细胞成肌分化相关miRNAs 的鉴定和功能研究”（31201021）；天津市自然科学基金项 目“microRNA-1对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控作用研究”（13JCQNJC14600） 作者简介：代阳（1988-），女，内蒙古通辽人，硕士在读，研究方向为动物胚胎与转基因工程。E-mail: aq19881209@https://www.360docs.net/doc/da10677354.html,。 文章编号：1008-5394（2014）01-0001-04 小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定 代阳1 ，王轶敏 1，2 ，刘新峰1，樊晗璐1，李吉霞1，郭宏1，丁向彬 1，通信作者 （1. 天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384；2. 西北农林科技大学 生物工程研究所，陕西 杨凌 712100） 摘 要：采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞，应用差速贴壁法进行纯化， 并利用RT -PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。结果显示：分离出的肌卫星细胞生长状态良好，RT -PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达，诱导分化形成肌管后，分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞，并具有很好的体外分化能力，可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。 关键词：小鼠；骨骼肌卫星细胞；细胞培养；鉴定 中图分类号：Q813.1 文献标识码：A Isolated Culture and Identification of Mouse Skeletal Muscle Satellite Cells DAI Yang 1 , WANG Yi-min 1,2 , LIU Xin-feng 1, F AN Han-lu 1, LI Ji-xia 1, GUO Hong 1, DING Xiang-bin 1,Corresponding Author (1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Institute of Bioengineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaa n xi Province, China ) Abstract: In this study, mouse skeletal muscle satellite cells were isolated by collagenase and trypsinase digestion method. Then the satellite cells were purified and induced to differentiate into myotubes, and the marker genes of the cells before or after the differentiation were detected by RT-PCR and immunocytochemistry technology. The results show that the isolated muscle satellite cells were healthy, and expressed the marker genes of paired protein box (Pax7) and myogenic differentiation antigen (MyoD ). After inducing to the myotubes, myogenin (MyoG ) and myosin heavy chain (MHC )showed positive expression. The results indicate that mouse skeletal muscle satellite cells of high purity, which can provide cell sources for muscle development and damage repair study, are successfully isolated. Key words: mouse; skeletal muscle satellite cell; cell culture; identification 骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cell）是骨骼肌中具有分化增殖潜能的肌源性干细胞，通 常以静息状态存在于肌纤维肌膜与基底膜之间[1] ，在一定条件下可以被激活，发生增殖和分化，形 成骨骼肌细胞。1961年，Mauro [2] 首次在蛙的肌肉中发现了肌卫星细胞，其后，有多种动物的肌卫星细胞被成功分离，并进行了体外培养。肌卫星细胞在肌肉的发育和再生中发挥了重要作用，而 肌卫星细胞的增殖和分化受众多因素的影响[3] ，目前，其分离效率仍然很低，建立高效的体外培养、鉴定与诱导分化方法仍然是卫星细胞研究和利用的关键。本研究采用胶原酶和胰蛋白酶联用的酶消化法从小鼠肌肉组织中分离肌卫星细胞，并对其进行了诱导分化和鉴定，以期为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供参考。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物 10日龄昆明小鼠，体重约3.2 g。 1.1.2 主要试剂 胎牛血清（Gibco）；马血清（Gibco）；DMEM 高糖培养基（Hyclone）；胶原酶Ⅱ（Sigma）；0.25%胰蛋白酶溶液（索来宝）；青链霉素混合液（10 000 m g /L青霉素、10 000 m g/L链霉素，索莱宝）；PBS （自配）；4%多聚甲醛、山羊封闭血清、羊抗兔Cy3标记二抗、羊抗兔FITC标记二抗、羊抗小鼠FITC 标记二抗（武汉博士德）；DAPI、兔抗Pax7抗体、兔抗MyoD抗体、兔抗MyoG抗体（北京博奥森）；鼠抗Myosin抗体（中杉金桥）；TRIzol试剂（Invitrogen）；
骨骼肌细胞的超微结构特点
骨骼肌细胞的超微结构特点 肌肉和肌纤维周围均包有结缔组织，按其位置不同分为肌外膜、肌束膜和肌内膜。 包在整块肌肉外面的致密结缔组织，称肌外膜。 若干条肌纤维集成束，束的外周包有较厚的结缔组织，称肌束膜。 分布在每条肌纤维周围的少量结缔组织，称肌内膜。 骨骼肌纤维表面附有肌卫星细胞，肌纤维损伤后肌卫星细胞分化形成肌纤维。 （一）骨骼肌纤维的光镜结构 骨骼肌纤维呈长圆柱形，一条肌纤维内含多个细胞核，核呈扁椭圆形，位于肌膜下方； 肌浆内含大量肌原纤维，每条肌原纤维上都有明暗相间的横纹，后者由明带和暗带组成明带又称Ι带，其中部为Z线 暗带又称A带，其中部较浅的窄带称H带，H带中央为M线 * 肌节（sarcomere）为两条相邻Z线之间的一段肌原纤维，由?I带+A带+?I带组成；是骨骼肌收缩的基本结构单位 肌膜外有基膜紧贴，肌膜与基膜间有肌卫星细胞，肌纤维损伤后，肌卫星细胞分化形成肌纤维。 （二）骨骼肌纤维的超微结构 肌原纤维、横小管和肌浆网等是骨骼肌纤维最主要的超微结构。 1．肌原纤维（myofibril） 由粗、细两种肌丝（myofilament）规律排列组成。 粗肌丝位于肌节的暗带，中央固定在 M线上，两端游离。 细肌丝位于肌节两端，一端附于Z线，另一端伸至粗肌丝间，末端游离，止于H带外侧； Ι带仅有细肌丝；H带(A带中部) 仅有粗肌丝；H带两侧的A带既有粗肌丝，又有细肌丝； （1）粗肌丝的分子结构： 由肌球蛋白分子组成，肌球蛋白形似豆芽，分头和杆两部分，头部具有ATP酶活性。 （2）细肌丝的分子结构： 细肌丝由肌动蛋白、原肌球蛋白、肌原蛋白组成。 骨骼肌肌纤维的结构 骨骼肌由骨骼肌纤维组成。骨骼肌纤维呈长圆柱状，其大小因肌肉类型和生理活动的状况而不同，一般长度约3－－40mm，镫骨肌纤维最短，长约lmm；缝匠肌纤维长达125mm。肌纤维的宽度约为10－－100μm，加强体育锻练能使肌纤维体积增粗。