小鼠局部淋巴结(LLNA)：BrdU-ELISA法在染发剂刺激性检测中的应用
淋巴细胞的分离方法
1、淋巴细胞的来源： 人淋巴细胞的方便来源是外周血 分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。 根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。 分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。 2、密度梯度离心法： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。 3、实验方法： 1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2） 3、20℃，1500r/min，离心30min 从上一次至下 稀释的血浆、血小板 PBMC Ficoll 红细胞、粒细胞 4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。 5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清。 6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。 7.适量的培养基重悬细胞，计数。
分离单个核细胞纯度为95% 淋巴细胞约占90%～95% 4、淋巴细胞高纯度化 (一)红细胞的去除 一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。 (二)血小板的去除 将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。 在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。 （三）单核细胞和粒细胞的去除 1．粘附去除法 原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。 优点：简便易行，对细胞损伤极少。 缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。 该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。 2．羰基铁粉吞噬法 原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。 方法一：经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。 方法二：用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。 3．苯丙氨酸甲酯去除法 原理：苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶解。 用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。 该法去除单核细胞后，约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。
颈部淋巴结的超声诊断
颈部淋巴结疾病的超声诊断特点 分布 正常的颈部淋巴结通常可在颌下、腮腺区、颈上区、颈后三角区发现。转移性的颈部淋巴结是位置特异性的。在已知原发瘤的患者，转移性淋巴结的分布有助于鉴别转移类型及帮助肿瘤分期。然而，如果原发瘤未知，已证实的转移性淋巴结的分布可为我们确定原发瘤提供线索。淋巴瘤和结核性的淋巴结肿大也有特定的分布。 大小 恶性淋巴结通常较大。但是，炎性的淋巴结也可和恶性淋巴结一样大。而且，转移性的淋巴结也可表现为较小的状态。因此，淋巴结的大小不能作为鉴别诊断的唯一标准。然而，在临床实践中，当原发瘤明确的患者，当动态连续观察淋巴结呈持续性增大时，强烈提示为转移性淋巴结。而且，恶性淋巴结大小的连续变化在监测患者对于治疗的反应方面用处较大。 外形 恶性和结核性的肿大淋巴结通常呈圆形，短轴/长轴的比率大于或等于0.5，反应性的肿大淋巴结和正常的淋巴结通常较长或呈卵圆形。然而，有报道称正常的颌下淋巴结和腮腺区淋巴结在外形上也趋向于呈圆形。而且，恶性淋巴结在早期累及时会在外形上呈卵圆形。因此，淋巴结的形态应在诊断中被当作是单独的诊断标准。但是，淋巴结外周皮质异常增生表明淋巴结内部有局灶性的肿瘤浸润，是鉴别恶性淋巴结的一个有用的征象。
淋巴结边界 转移性和淋巴瘤的淋巴结有锐利的边缘，然而反应性和正常淋巴结的边界不甚锐利。恶性淋巴结中的锐利边缘被认为是由于肿瘤浸润及淋巴结周围脂肪沉积的减少，这增加了淋巴结和周围组织之间的声阻差。结核性的肿大淋巴结边缘不甚锐利清晰，这是淋巴结周边软组织水肿和发炎所致。根据我们的经验，边界清晰锐利在鉴别诊断中意义不大。然而，在临床实践中，若已证实的恶性淋巴结出现边界不清的情况，则提示有被膜外浸润，对于评价患者的预后有所帮助。 淋巴结门回声 淋巴结门回声是大多数颈部淋巴结（86％）正常的声学特征，通常见于较大的淋巴结。在超声上，淋巴结门回声表现为与相邻软组织相延续。尽管转移性、淋巴瘤、结核性的肿大淋巴结没有淋巴结门回声，但它们在疾病的早期阶段还是可以看到淋巴结门回声的。这主要是因为髓质淋巴窦并没有被充分破坏。因此，淋巴结门回声的存在与否不能成为诊断的单独标准。 回声 正常的、反应性的、淋巴瘤的和结核性的淋巴结与临近肌肉组织相比，其主要呈低回声。除了转移自甲状腺乳头状癌的淋巴结表现为高回声外，转移性的淋巴结通常呈低回声。因此，淋巴结的高回声是鉴别是否转移自甲状腺乳头状癌的一个有用征象。超声医生应当扫查甲状腺，看是否能找到原发瘤以确定诊断。
小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书
小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书 【产品规格】200ml/Kit 【产品组成】 为方便广大用户使用，试剂内容如下： 名称 产品编号 规格200ml 200ml 200ml 200ml 1份 A B C D E 小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液样本稀释液（赠品）清洗液（赠品）2010C11192010X1118F2013TBD F 液（赠品）说明书 【实验前准备】A ．适用仪器 最大离心力可达1200g 的水平转子离心机B ．耗材 产品名称产品货号339650339651339652339653 产地15ml 离心管散装美国NUNC 15ml 离心管架装美国NUNC 美国NUNC 美国NUNC 50ml 离心管散装50ml 离心管架装无菌胶头滴管或塑料滴管【检验方法】 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。1.首先制备组织单细胞悬液，制备方法详见“组织单细胞悬液制备技术”。 2.取一支15ml 离心管，加入与组织单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于 3ml ）。 3.用吸管小心吸取组织单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g ，离心20-30min 。（注： 根据组织单细胞悬液量确定离心条件，组织单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
4.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色淋 巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。 5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入 10ml清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。 6.250g，离心10min。 7.弃上清。 8.用吸管以5ml清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。 9.250g，离心10min。 10.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 【注意事项】 1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最 好在取样2h内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。 2.本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离 心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。 3.吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒 细胞数量增加。 4.分离液用量大于组织单细胞悬液样本时，分离效果更佳。 5.如实验后细胞得率或活性过低，请联系上海研谨生物以获得技术支持。 【储存条件及有效期】 18-25℃保存，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 【参考值（参考范围）】 本实验淋巴细胞提取率及纯度大于80%。 下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。 红细胞白细胞血小板 （4.0-10.0）×109 含量（个/L）（4.0-5.5）×1012（1.0-3.0）×1011 中性粒细胞淋巴细胞单核细胞
小鼠淋巴结位置
Research paper Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes:Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice Wim Van den Broeck a,?,Annie Derore b,c ,Paul Simoens a a Department of Morphology,Faculty of Veterinary Medicine,Ghent University,Salisburylaan 133,B-9820Merelbeke,Belgium b Innogenetics NV ,Industriepark Zwijnaarde 7,B-9052Ghent,Belgium c Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology (VIB),Technologiepark 927,B-9052Ghent,Belgium Received 21November 2005;received in revised form 10January 2006;accepted 26January 2006 Available online 6March 2006 Abstract Murine lymph nodes are intensively studied but often assigned incorrectly in scientific papers.In BALB/cAnNCrl mice,we characterized a total of 22different lymph nodes.Peripheral nodes were situated in the head and neck region (mandibular,accessory mandibular,superficial parotid,cranial deep cervical nodes),and at the forelimb (proper axillary,accessory axillary nodes)and hindlimb (subiliac,sciatic,popliteal nodes).Intrathoracic lymph nodes included the cranial mediastinal,tracheobronchal and caudal mediastinal nodes.Abdominal lymph nodes were associated with the gastrointestinal tract (gastric,pancreaticoduodenal,jejunal,colic,caudal mesenteric nodes)or were located along the major intra-abdominal blood vessels (renal,lumbar aortic,lateral iliac,medial iliac and external iliac nodes).Comparative and nomenclative aspects of murine lymph nodes are discussed.The position of the lymph nodes of BALB/cAnNCrl mice is summarized and illustrated in an anatomical chart containing proposals for both an official nomenclature according to the Nomina Anatomica Veterinaria and English terms.?2006Elsevier B.V .All rights reserved. Keywords:Mouse;Lymph node;Nomenclature 1.Introduction Rodents,and mice in particular,have long been used as laboratory animals in various scientific experiments.The possibility to produce different murine strains and a variety of knock-out mice,the high reproductive rate of these animals,and the ease of their handling have made them the preferential laboratory animal.In immunolog-ical sciences,murine lymph nodes (lnn.)are often used to isolate lymphocytes in order to study fundamental aspects of immunology and immunopathology.The methodology to recognize and dissect these lymph nodes requires at least a basic anatomical knowledge.In numerous studies,however,inaccurate,misleading or even enigmatic terms such as genital nodes (Cain and Rank,1995)or tonsillar nodes (Deaglio et al.,1996)have sometimes been assigned to murine lymph nodes.The ambiguity of murine lymph node (ln.)nomenclature is illustrated by the lymph node at the ear base of mice which has been variably designated by various terms such as parotid ln.(Cuq,1966;Grassé,1972;Popesko et al.,1992),lateral mandibular ln.(Cuq,1966),and facial ln.(Wolvers et al.,1999),while numerous recent studies refer to an allegedly auricular ln.(Anjuère et al.,1999;Dearman et al.,1996;Sailstad et al.,1995)or pre- Journal of Immunological Methods 312(2006)12– 19 https://www.360docs.net/doc/db4719714.html,/locate/jim ?Corresponding author.Tel.:+3292747716;fax:+3292647790.E-mail address:wim.vandenbroeck@UGent.be (W.Van den Broeck). 0022-1759/$-see front matter ?2006Elsevier B.V .All rights reserved.doi:10.1016/j.jim.2006.01.022
小鼠淋巴细胞分离方法
小鼠淋巴细胞分离方法 一、实验用品的准备： 1.采血用品：10ml注射器10个；手套20付；15ml离心管10个；20μl枪头、200μl 枪头、1000μl枪头。摄子、剪刀各2把；加样器；70%酒精；5%碘酒； 2.取脾用品：10ml注射器10个；手术器械10套；手套20付，60mm玻璃培养皿10个； 200 目尼龙网，裁成100mm×100mm正方形10块；10mL 玻璃注射器内活塞10个； 5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基；鼠淋巴细胞分离液；摄子、剪刀各10 把；70%酒精；5%碘酒；移液器、离心机；刀剪浸泡液（新洁尔灭）； 注：红色必须灭菌；蓝色可以不灭菌；绿色需特殊处理；黑色不用灭菌。 二、相关实验： （一）实验名称：分离小鼠脾脏淋巴细胞 实验目的：获得小鼠脾脏淋巴细胞，为ELISPOT实验做准备。 实验动物：BABALB/c小鼠；雌性 实验材料： 1．小鼠淋巴细胞分离液, 2．60mm玻璃培养皿 3．10mL 玻璃注射器内活塞，灭菌 4．气管切开包 5．5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机 6．1640培养基 实验方法 1. 断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基，将小鼠脾脏放入培养皿中，用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液，注入小鼠脾脏，直至完全分离。 4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。 5. 3000转离心15分钟。（病毒室离心机） 6.吸出淋巴细胞层，加入5mL 1640培养基洗涤一次，1500转离心10 分钟。 7.倾倒上清液，加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬，细胞计数。 8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。
颈部淋巴结炎的超声诊断
颈部淋巴结炎的超声诊断 淋巴结作为机体重要的免疫器官，不仅可以接受抗原刺用。在正常情况下淋巴结较小，质软，直径多在0.5cm 以内，表面光激产生免疫应答反应，而且还具有过滤、增殖以及免疫作滑，与周围组织无黏连，也没有压痛。颈部淋巴结肿大是临床上最为常见的病症之近年来，颈部淋巴结肿大的患者逐年增多，颈部淋巴结肿大的发病原因是多种多样的。伴随着医疗水平的不断进步以及彩色多普勒超声（彩超）检查的普及应用，对诊断颈部淋巴结肿大性质的认识也逐渐有了明显的提高。探头频率5～12MHz。调整仪器最佳状态，嘱患者取平卧位，颈下垫枕，充分暴露颈部，头偏向健侧，沿颌下角、锁骨上角、枕后角及胸锁乳突肌前缘顺序，先行扇扫，在将探头直接放于病变处，进行全方位扫查，找到淋巴结后，常规检查并记录淋巴结部位、数目、大小、形态、淋巴门的类型、皮质的类型、内部结构、内部回声与周围有无浸润，并采用彩色多普勒血流显像，使仪器探测到最多的血流，观察内部及周边血流情况。 【分类】可将病变的淋巴结血流分布分为以下四种类型： （1）中央型：经过多切面扫查均显示，血流信号位于淋巴结中央，不汇入淋巴门部。 （2）边缘型：血流信号不来源于淋巴结门部，而是位于淋巴结边缘。 （3）淋巴门型：血流信号从淋巴门血管主干呈放射状分出或者血流信号沿淋巴门的高回声分布，则考虑为淋巴门型血管。 （4）混合型：通过彩超检查可明显发现，具有上述三种血流类型的两种或两种以上。如果淋巴结内彩色信号仅瞬间
出现，不能在扫查时持续出现，或者淋巴结内没有血流信号显示，则可判定该淋巴结无血流信号 【病因】 ①炎症：患者出现红、痛、热的特点，发病快，局部有压痛感或慢性者无压痛，常位于下颌下区。 ②结核：可以是原发性的，也可以是继发性的，由于病程较长，其肿大的淋巴结呈串状，无压痛，可活动，可互相粘连成团，呈干酪样坏死。 ③恶性淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤的肿块无痛性，质硬，活动度差，呈进行性增大，而霍奇金淋巴瘤多为双侧性，伴有发热，以及肝、脾肿大，消瘦乏力等症状。 ④转移性恶性肿瘤：对于转移性恶性肿瘤来讲，其原发灶多位于头颈部，肿块逐渐增大，没有明显压痛感，质硬，活动度差，常为一侧性，严重者可伴有双侧受累。从临床表现上来看，淋巴结转移癌无性别差异，病程相对较长，淋巴结较大。淋巴结核以女性较为多见，病程也相对较长。淋巴结炎患者年龄相对较小，病程相对也比较短。恶性淋巴瘤男性患者多于女性患者，淋巴结肿大较为明显，常伴有发热反应。 【鉴别诊断】 【良性】肿大淋巴结形态大多呈长椭圆形，边界光滑、走行规则，以中央型为主，向边缘逐渐变细，无扭曲表现，淋巴结内部回声多呈髓质增宽、增强，皮质相对变窄，回声尚均匀，呈低回声，内部无液性改变。
T淋巴细胞提取
淋巴细胞提取 一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取 二实验对象：B／C 小鼠 三实验器材： 1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基 2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台 四实验步骤： 1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。 3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果） 4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。 5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。 五、注意事项： ①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。 ②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。 ③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些 ④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。
小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告
小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告 一、实验目的 1. 了解淋巴细胞分离的意义和原理 2. 掌握淋巴细胞分离的技术，为进行下一步生物实验奠定基础 二、实验材料 1.淋巴细胞分离液 2.EDTA抗凝剂 常用EDTA的钠盐或钾盐作为抗凝剂，能与血液中的钙离子结合成螯合物，而是钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固 3.PBS缓冲液 PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用 4.戊巴比妥钠溶液 作用与苯巴比妥相同，为中时作用的巴比妥类催眠药，作用时间可维持3～6小时，显效较快。用作催眠和麻醉前给药，亦可用于治疗癫痫和破伤风的痉挛。 5.其他实验材料：健康的小白鼠一只、注射器（1ml，10ml）1ml、20ul的枪以及相应的枪头、滴管、水平离心机、医用镊子、EP管（5ml，10ml） 三、实验原理 外周血中各种细胞的密度不同。密度离心法的原理主要根据各类血细胞的比重差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立区带，从而达到分离的目的。 第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层
图1 小鼠外周血离心前后示意图 四、实验步骤 1.给小鼠注射适量的戊巴比妥钠麻醉剂，使其麻醉 2.用镊子用力拉扯掉麻醉完全小鼠的其中一只眼睛，将血液滴入事先已经加入100ulEDTA抗凝剂的5mlEP管中，取足1ml新鲜血液 3.用滴管将抗凝后的血加入事先加入1mlPBS缓冲液的5ml的EP管中稀释(血液与PBS的比率为1:1) 4.用滴管将稀释后的1ml新鲜血液沿试管壁缓缓（一定要慢）加到含有2ml淋巴细胞分离液(事先要恢复到室温)的10mlEP管中（稀释血液：分离液=1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面 5.经水平式离心机离心（1500r/min）15分钟，小心取出试管 6.用平口滴管小心吸取中层呈白絮状的淋巴细胞，用PBS溶液洗涤两次，每次离心1800r/min，离心10min 7.弃上清液，加入4mlPBS待用
颈部淋巴结肿大的鉴别诊断
颈部淋巴结肿大的鉴别诊断 1.急性淋巴结炎：肿块有红、肿、热、痛。 2.慢性淋巴结炎：淋巴结肿大约0.5一1.0cm，质软。多数有明显的感染灶，且常为局限性淋巴结肿大，有疼痛及压痛，一般直径不超过2～3cm，抗炎治疗后会缩小。腹股沟淋巴结肿大，尤其是长期存在而无变化的扁平淋巴结，多无重要意义。但无明显原因的颈部、锁骨上淋巴结肿大，标志着全身性淋巴组织增生性疾病。 3.淋巴结结核：多低热，肿大淋巴结质较硬（纤维化或钙化）、表面不光滑，质地不均匀（干酪样变），或因干酪样坏死而呈囊性，或与皮肤粘连，活动度差 ，可破溃。常伴发肺结核。这类患者结核菌素实验和血中结核抗体阳性。确诊方法是多次、多部位地做淋巴结穿刺、涂片和活体组织检查，并找出结核原发病灶。 4.结节病 ：多见于青少年及中年人，淋巴结多在2cm直径以内 ，质地一般较硬 ,不融合，不与皮肤粘连。常侵犯双侧肺门，呈放射状，临床上90%以上有肺的改变，伴有长期低热。全身淋巴结都可肿大，尤其是耳前后、颌下、气管旁。可有乏力、发热、盗汗、食欲减退、体重减轻等。在临床上很难与恶性淋巴瘤鉴别。可有肝和（或）脾肿大，纵隔及浅表淋巴结常受侵犯而肿大。活动进展期可有白细胞减少、贫血、血沉增快。约有1／2左右的患者血清球蛋白部分增高，以IgG增高者多见，血浆白蛋白减少。血钙增高，血清尿酸增加，血清碱性磷酸酶增高。血清血管紧张素转化酶（SACE）活性在急性期增加（正常值为17.6-34u/ml），对诊断有参考意义，血清中白介素－2受体（IL－2R）和可溶性白介素－2受体（sIL－2R）升高，对结节病的诊断有较为重要的意义。 5.坏死性淋巴结炎：多为青壮年，骤起高烧持续不退，或持续低烧，常伴有上呼吸道症状，似流感样。肿大的淋巴结常有压痛，相互之间不融合。病理检查示淋巴结广泛凝固性坏死，周围有反应性组织细胞增生，无中性粒细胞浸润。本病可在1—2个月内自然缓解(自愈)，预后良好 。 6.巨大淋巴结增生：原因不明的淋巴结肿大，侵犯胸腔、纵隔及肺门与肺内。肿物切除后，症状消失。 7.淋巴结转移性癌：质地坚硬，无压痛，不活动。多见于鼻咽癌、肺癌及消化道肿瘤的转移． 8. 反应性淋巴结炎： 当机体受到创伤或疾病或外来异物抗原引起的应急反应后会导致反应性淋巴结炎。例如某些药物或生物制品可引起机体发热、皮疹、淋巴结肿大等。由普通化学药物引起者称药物热，如甲基多巴、异烟肼、苯妥英钠等各种疫苗；由生物制品引起者称血清病。这些都可以引起淋巴结肿大。 9. Castleman病：该病大多数表现为无痛性淋巴结肿大。局灶型患者，病理学以透明血管型多见。肿大的淋巴结可发生于任何部位，结外组织病变较少；可单发或多个聚集，部分可融合。多中心型患者，发病高峰为50-60岁，女性多见。病理学主要为浆细胞型或混合型，常见临床表现为多发、分散的淋巴结肿大，常伴有全身症状，如发热、贫血、消瘦，体征上多伴有肝脾肿大，实验室检查可有贫血、血沉加快、球蛋白增高、多克隆高丙种球蛋白血症、粒细胞增多和骨髓浆细胞比例增高等。其它少见的相关临床表现有：难治性贫血、自身免疫性血细胞减少、狼疮抗凝物及血栓性血小板减少性紫癜等血液学表现； 肾病综合征、肾小球肾炎、急性肾功能衰竭等肾脏表现；寻常天疱疮、皮肤色
小鼠脾脏中分离淋巴细胞
小鼠脾脏中分离淋巴细 胞 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞 １小鼠断颈处死，酒精浸泡５分钟，超净台内打开左侧腹部皮肤，小心分离皮下组织和腹部肌肉暴露出脾脏，提起，剪去周围结缔组织，放入有PBS的小瓶中。无菌镊子夹碎，挤压脾脏，将获得的细胞悬液移入无菌试管中。 ２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。个人用1500转/分钟，20分钟。 ３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟，10分钟）。 ４，洗好的细胞加入１６４０培养液和２０％的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放３７度孵育一小时。一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号注射器做的），以HANKS液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B细胞也相对吸附冲洗下来的不多，所以冲洗来的大多是T细胞，纯度可打到８０％到９０％，再次冲洗并且用力挤压，这样得到的就是B细胞。得到的细胞可以以１６４０加血清配制的培养液进一步培
养或做它用。但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。
2018年淋巴细胞分离
淋巴细胞分离 淋巴细胞分离与计数 淋巴细胞分离 原理： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 tZz3a1Ui实验材料： 淋巴细胞分离液 肝素 稀释液（生理盐水） RPMI1640粉末 实验设备：1ml移液器、移液管、5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜 操作流程： 1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加 0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝 3.稀释（外周血：稀释液=1：2取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀） 4.用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2） 5.放入离心机1500r/min离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟）
6.用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。 7.重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。 8.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞 9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度. 10.取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数 ────────── × 10４×2(稀释倍数) 4 11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。 注意事项: 1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2. Ficoll应适量，外周血应充分稀释 3.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 4.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 5.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 淋巴细胞计数： 实验流程： 1.准备计数板：
B淋巴细胞分离技术
B淋巴细胞分离技术 一、实验原理 膜表面免疫球蛋白(SmIg)，是B细胞特有的表面标志，它既是B细胞识别抗原的受体，与相应抗原特异性结合；又是表面抗原，能与相应的抗Ig的抗体结合，故可用荧光标记的抗Ig抗体作免疫荧光镜检，以查出B淋巴细胞。由于B淋巴细胞在分化过程中最先出现SmIg，所以该法可以检出全部B淋巴细胞。B淋巴细胞表面最先出现IgM，以后相继出现IgG、IgD、IgA等表面免疫球蛋白。而金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)能与许多哺乳动物IgG 的Fc段发生结合，并且这种反应也发生于膜表面的IgG，所以亦可以用荧光标记的SPA菌体(FITCSPA)替代FITC抗IgG检测SmIg阳性B淋巴细胞，凡于FITCSPA结合的细胞，在荧光显微镜下，可见到B淋巴细胞表面或周围布满许多呈黄绿色荧光的菌体，即为SmIg 阳性细胞即为B淋巴细胞。现将荧光标记SPA法介绍如下： 二、实验材料 1 冻干荧光金黄色葡萄球菌A蛋白(FITCSPA)菌体试剂，用时按要求稀释。 2 pH值72 Hank s液，含5%小牛血清。 3 淋巴细胞分层液，20℃时比重为1077±0002 4吸管、移液管、台式离心机、载玻片、盖玻片 三、实验步骤 1、取肝素抗凝血2ml，用Hank s液稀释1～2倍，轻轻加入到装有3ml淋巴细胞分层液的试管中，2000～2500 r/min水平离心20～25min，获取淋巴细胞。 2、用pH值7.2Hanks液洗2次，最终配成细胞数为2～25×106/ml的淋巴细胞悬液。用pH值72Hanks液稀释FITCSPA菌体试剂，然后将淋巴细胞液与等量的FITCSPA菌体悬液混合，充分混匀后，放4℃冰箱30min。
小鼠淋巴瘤细胞(L5178Y)TK基因突变试验预实验方法
小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y）TK基因突变试验 1.目的：在正式试验开始之前需要确定供试品的溶解性并确定适宜的供 试品剂量范围。 2.剂量：剂量设计试验通常不考虑供试品的溶解性，分别在有和无S9 的情况下接受3小时处理，最高浓度可达5mg/ml（即使其溶解度大于5mg/ml，也就是说这是最大的剂量）；以2倍稀释度向下设6－10个剂量。 3.溶剂：溶剂的选择按其优先顺序依次是RPMI-0、生理盐水、蒸馏水和 DMSO，要尽量避免悬浮液，如果供试品不可溶，应用RPMI-0将其制成悬浮液。 4.方法： 4.1 收集细胞。细胞总量应达到6×107个，用RPMI-10培养基悬浮备用。 （收集过程中每天应调整细胞的细胞量为2×105/ml，）。 4.2 将10ml RPMI-10培养基（约含107个细胞）分别置于一系列50ml一次 性消毒离心管中。为使处理用培养基中血清含量降至5％（V/V）， RPMI-0、溶剂、供试品、1mlS9混合物（代谢活化系统时）或150mM KCL（非代谢活化系统时）加入离心管的总体积应达到20ml（如表 所示）。 表处理时培养基的组成成分 成分体积 无活化系统有活化系统细胞悬液（106/ml RPMI-10）10ml(107个细胞) 10ml(107个细胞) RPMI-0 8.8ml 8.8ml S9混合物－1ml 150 mM KCL 1ml -- 供试品0.2ml 0.2ml 将离心管塞紧并置于振荡器上，37℃水浴3小时。然后低速离心（1000r.p.m）5分钟，弃去上清液，用PBS(PH7.4)洗涤细胞两次。重新悬浮细胞于50ml
RPMI-10之中，并调整细胞密度为2×105/ml，,转移至培养瓶中。培养2 天。每天计数细胞生长（DCG），并调细胞密度为2×105/ml左右。 5. 结果 按第1d、第2d的DCG计算相对悬浮生长（RSG）. 选择10％－20％RSG作为诱变试验的最高剂量，并以2倍稀释度向下设2－5个剂量。 6. 计算方法 RSG＝〔DCG1×DCG2(供试品组)/ DCG1×DCG2(对照组)〕 DCG1为第一天的生长率，DCG2为第二天的生长率。 DCG为：次日细胞密度/ 配制或稀释后的细胞密度。
MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书
MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书 主要用途： 淋巴细胞分离试剂是一种旨在通过葡聚糖和泛影酸钠混合液，达到特定比重，然后离心分层以获得纯化完整的单核细胞/淋巴细胞的权威而经典的技术方法。可以被用于动物（大鼠、小鼠等）单核细胞/淋巴细胞的分离、鉴定、染色、标记、培养、 DNA萃取、线粒体分离、细胞因子测定和细胞流式仪分析等研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，分离出色，性能 稳定，细胞活性保证。 技术背景： 全血溶液含有血清、各种蛋白因子、无核血红细胞、血小板、多核白细胞和单核白细胞等。为了获得纯化完整的单核白细胞 /淋巴细胞，采用Boyum（1968）的离心技术，可以方便快速地从全血和骨髓中分离。 产品内容： 淋巴细胞分离液（200）毫升 产品说明书1份 产品特点： -密度变化率依照 Ficoll400泛影酸和氢氧化钠。-最佳分离溶液的密度为参照具体产品的标签-生理学参数-在 低粘度时高密度-无菌-即用型-溶液产品规格
检测标准： 热源检测结果：＜0.5EU∕ml 无菌检测结果：已检测 应用 人外周血中分离出淋巴细胞的最佳试剂。这种分离液同样可被用作从其它途径分离人的淋巴细胞，包括骨髓血细胞、脐带血 细胞及组织匀浆。 实验步骤 实验开始前，室温预热淋巴细胞分离液。然后进行下列操作。（注：上述方法适用于从外周血中分离淋巴细胞。如从骨髓、脐带及组织匀浆中分离，需要先去除红细胞后再进行上述步骤分离淋巴细胞。 1．准备无菌的锥形离心管 2．加入淋巴细胞分离液 3. 用hank’s 液或用户自备的PBS缓冲液1：1比例（如果全血样本粘稠，可适当增大比例）稀释抗凝过的全血样品。 3．小心沿着管壁，接近分离液层面，非常缓慢地加入新鲜的稀释过的全血样品在淋巴分离液上面。 （注意：切记不要搅浑淋巴细胞分离液） 4．小心放进台式离心机离心30分钟，速度为400g 5．小心取出离心管，切记不要震动 6．可见，最上层为淡红色透明血浆，其次为薄薄的致密白色环
临床医学诊断基础：诊断学——淋巴结的检查
1.检查顺序 全身体格检查时，淋巴结的检查应在相应身体部位检查过程中进行。为了避免遗漏应特别注意淋巴结的检查顺序。头颈部淋巴结的检查顺序是：耳前、耳后、枕部、颌下、颏下、颈前、颈后、锁骨上淋巴结。上肢淋巴结的检查顺序是：腋窝淋巴结、滑车上淋巴结。腋窝淋巴结应按尖群、中央群、胸肌群、肩胛下群和外侧群的顺序进行。下肢淋巴结的检查顺序是：腹股沟部（先查上群、后查下群）、胭窝部。 2.检查方法 检查淋巴结的方法是视诊和触诊。视诊时不仅要注意局部征象（包括皮肤是否隆起，颜色有无变化，有无皮疹、瘢痕、瘘管等）也要注意全身状态。 触诊是检查淋巴结的主要方法。检查者将示、中、环三指并拢，其指腹平放于被检查部位的皮肤上进行滑动触诊。这里所说的滑动是指腹按压的皮肤与皮下组织之间的滑动；滑动的方式应取相互垂直的多个方向或转动式滑动，这有助于淋巴结与肌肉和血管结节的区别。 3.检查内容 检查淋巴结应注意部位、大小与形状、数目与排列、表面特性、质地、有无压痛、活动度、界限是否清楚及局部皮肤有无红肿、瘢痕、瘘管等。 附：一般检查的体检纲要一般检查包括全身状态、皮肤和淋巴结检查。反映这些内容的检查项目多、范围广，在进行全身体格检查过程中都应该注意观察病人的全身状态的有关内容及皮肤、淋巴结状况。 全身状态的体检纲要生命征（体温、脉搏、呼吸、血压） .发育是否正常，体型是否匀称（正力型、超力型、无力型） 营养状况（良好、中等、不良、肥胖、恶液质） 意识状态（清晰、嗜睡、模糊、昏睡、昏迷、谵妄），能否与医师合作。 精神状态有无异常（情感、认知、行为有无异常），语言是否流畅，语调有无改变。 面容与表情有无异常（急性或慢性病容、特殊面容、表情痛苦、忧虑、恐惧、安静）；体位（自主体位、被动体位、强迫体位）；姿势有无特殊，步态有无异常。 皮肤粘膜检查纲要颜色有无改变（发红、苍白、发紫、黄染、色素沉着、色素脱失）；湿度有无异常；弹性是否正常或减低；有无皮疹（斑疹、丘疹、斑丘疹、玫瑰疹、荨麻疹、疱疹）及皮肤脱屑；有无皮下出血、蜘蛛痣、水肿（轻、中、重度）、皮下小结、溃疡与糜烂、瘢痕及毛发分布情况。 淋巴结检查纲要检查淋巴结应注意部位、大小与形状，数目与排列、表面特性、质地有无压痛、活动度、界限及局部皮肤有无红肿、瘢痕、瘘管等。
流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中小鼠脾脏的摘取(图文解说)
流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中 小鼠脾脏的摘取 最近老婆要提取脾脏细胞做流式，我就做个简单的解说，也顺便传到网上供菜鸟理解，如果有大神看到这篇文章，也欢迎指导。大家一起讨论，把实验做得更好。 无论是做混合淋巴细胞反应或者流式细胞分析都要用到脾脏。小鼠的脾脏摘取颇为简单，但有很多同学是第一次接触，所以在此做一个简单的图文讲解。在此讲解不甚详细，具体步骤请同学参照网上已有各种protocol,本文重点在于图文解说，让大家对照图片和其他protocol更好的理解脾脏的摘取。 一，小鼠处死后泡酒精2-3分钟，泡久了细胞会缩水，泡的时间短了起不到消毒杀菌的作用 二，摆好小鼠体位，取右侧卧位。 三，沿着小鼠左侧肋骨走行方向做切口。准备眼科镊和眼科剪若干（文中笔者使用眼科直镊3把，眼科剪2把）
四，向小鼠左后背方探查，在皮下很浅的地方可见深红色脾脏。脾脏走行向与肋骨方向近似平行 五，用镊子轻轻提起脾脏。脾脏下会连着许多结缔组织，轻轻把它们撕掉。
六，完整摘下脾脏，放于培养皿中【事先在培养皿中放入PBS（混淋）或红裂（流式）和200目的铁丝网】如下右图所示，银色的为本步骤中使用的铁丝网，白色的为后面要用到的过滤膜 七，一把新的眼科剪和一把新的眼科镊（新消毒过的。本文所用的为新高压的），把脾脏在培养皿里剪成小块。然后用2.5ml或5ml注射器柄，把脾脏研磨成细胞。研磨过程要轻柔，否则会损伤脾脏中的细胞。
八，研磨至培养皿中不见整块脾脏，只剩一些不能磨碎的结缔组织为止。
九，再加入4ml红细胞裂解液，冲洗铁丝网，注射器内芯，并用枪头吹打混匀，裂解5min 十，将液体一并转入15ml离心管中，400g,5min,离心 十一，弃去上清，加入5ml含10%FBS的1640 ,重悬, 用装有200目的尼龙滤膜过滤(可过滤两次); 尼龙滤膜就是第六步中右图的白色滤膜。 十二，滤液离心400g,5min,弃上清，加入1ml含10%FBS的1640,重悬混匀，稀释50(20+980)倍计数，； 至此，脾脏细胞就算提取完成了。后面几步没有上图，但做过实验的同学很容易就能理解是怎么回事啦。