建立肿瘤血管生成抑制剂的体外筛选方法

建立肿瘤血管生成抑制剂的体外筛选方法

李　惠

1,2

　叶　庆

3,4

　李运曼

1

(1中国药科大学,江苏南京210009;2江苏先声药物研究有限公司,江苏南京210042;

3南京军区总医院博士后科研工作站,江苏南京210002;4南京八一医院全军肿瘤中心,江苏南京210002)

摘　要　以Avastin 为阳性药,建立稳定、客观的肿瘤血管生成抑制剂的体外评价体系。用CCK -8检测人脐静脉内皮细胞(HUVECs )的增殖情况;荧光定量的Boyden 小室法检验HUVECs 的迁移能力;荧光定量分析HUVECs 对纤维蛋白的粘附能力;运用图象分析软件I m age -Pr o Plus 定量分析HUVECs 的小管形成行为的图像。结果表明,在该体系中,Avastin 能够抑制VEGF 诱导的HUVECs 与血管生成相关的生物学行为。该体系具有操作简单、可重复性好、易量化的特点,是一种在体外筛选肿瘤血管生成抑制剂的理想模型。关键词　肿瘤血管生成抑制剂　体外筛选方法

　

收稿日期:2009-04-10

作者简介:李惠(1984～),女,硕士,肿瘤药理学研究。李运曼(1957～),女,教授,博导,心血管药理学研究。

　

I nvesti gati on of an Evaluati ve Exper i m ent al Sche me of Anti -angi ogen i c Therapy

L i Hui 1,2

　Ye Q ing 3,4

　L i Yunman

(1China Phar maceutical University,J iangsu Nanjing,210009;2Si m cere Phar maceutical Gr oup,J iangsu Nanjing,210042;

3Postdoct orMoving Stati on,General Hos p ital of Nanjing M ilitary Command,J iangsu Nanjing,210002;

4Peop le’s L iberati on A r my Cancer Center,the 81st Hos p ital of Peop le’s L iberati on A r my,J iangsu Nanjing,210002)

Abstract An evaluative experi m ental sche me of anti -angi ogenic therapy was established .HUVECs p r olifera 2ti on was detected by CCK -8kit .Fluorescence quantitative Boyden cha mber assay was e mp l oyed t o analyze the HU 2VECs m igrati on .Fluorescence quantitative adhesi on assay was perf or med t o evaluate the ability of HUVEC adhesi on t o fibr onectin.I m age -Pr o Plus quantitative analysis of tube f or mati on was conducted .The results indicated that Avastin inhibited the angi ogenesis -related bi ol ogical behavi or of HUVECs in vitr o .The experi m ental sche me was reliable,easy t o operate and quantify .It was an ideal model f or evaluating the anti -angi ogenic therapy .

Keywords an evaluative experi m ental sche me anti -angi ogenic therapy

上世纪60年代初,Folkman 和Becker 观察到,在

肿瘤血管未出现时,离体灌注器官中的肿瘤生长受到

严重限制[1]

。后来,在1971年,Folkman 提出了肿瘤

生长依赖血管生成的假设,认为不超过1mm 3

的微小肿瘤,可通过被动弥散获得所需的氧和营养,但肿

瘤进一步生长就必需有血管生成来支持[2]

。干扰肿瘤与其微环境之间的相互作用进而阻断肿瘤血管新生,可为肿瘤治疗提供新的希望。

肿瘤血管生成过程是一个复杂的级联反应。在

肿瘤细胞分泌的促血管生成因子的刺激下,邻近血管静息状态的内皮细胞被激活。活化的内皮细胞分泌蛋白酶,使内皮细胞连接松弛,基底膜和细胞外基质降解,于是,基质中包含的各种促血管生成因子(如VEGF )被释放,继续刺激内皮细胞,使其侵入周围组织,并增殖、迁移,形成管腔结构。最后,基底膜和细胞外基质重塑,周围支持细胞(如平滑肌细胞)被募集,使新生血管稳定并成熟

[3]

。

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91—第23卷第5期2009年5月 化工时刊

Che m i ca l I ndustry T i m es

Vol .23,No .5

M ay .5.2009

血管生成是起源于内皮细胞的血管系统的发展。

因此,考察血管生成的体外实验方法多涉及到血管内皮细胞,主要包括血管内皮细胞的增殖、迁移、粘附及小管形成实验。传统的评价手段多以拍照、人工计数为主,存在很大的主观因素。随着时代的发展以及科技的进步,尤其是荧光定量技术的广泛应用,使得传统的实验方法得以改进,评价手段更为客观。Avastin 作为效果明确的VEGF 单克隆抗体,在血管生成方面的作用是明确、有目共睹的。2004年,Avastin 被F DA 批准用于联合以5-F U 为基础的化疗方案一线治疗转移性结直肠癌。2008年,F DA 批准Avastin 联合紫杉醇一线治疗HER2阴性的转移性乳腺癌患者。本文拟用Avastin 作为受试药物,检验改进方法的可行性。

1实验部分

1.1　实验仪器与药品

(1)实验仪器　I nfinite M200型酶标仪:瑞士Te 2

can 公司;I X -70倒置显微镜:日本O ly mpus 公司。

(2)药品　EC M 培养基:美国ScienCell 公司;重

组人血管内皮生长因子(VEGF 165):美国Pep r oTech 公司;人内皮无血清培养基(SF M )、胎牛血清(F BS )、牛血清白蛋白(BS A )、人血清纤维蛋白:美国Gibco 公司;Gr owth Fact or Reduced Matrigel (GFR -Matri 2gel ):美国BD 公司;CCK -8、Calcein AM:同仁化学研究所;Avastin:Roche;ThinCert T M

Trans well:Greiner

公司。

1.2　实验步骤

(1)细胞培养　原代人脐静脉内皮细胞(HU 2VECs )购自美国ScienCell 公司,置于含1%ECGS,5%F BS 及100U /mL 青霉素和100μg/mL 链霉素的EC M ,在37℃、5%CO 2条件下培养。0.25%胰酶/EDT A 消化传代。

(2)增殖抑制实验　取对数生长期的HUVECs,消

化,计数,调整细胞浓度为2.5×104

/mL,100μL /孔接种于96孔板中,培养过夜。完全贴壁后,HUVECs 用

含0.1%BS A 的SF M 饥饿4h 。样本为10×10-9

μg/

mL VEGF 及不同浓度VEGF 抑制剂Avastin,每组设3个复孔。处理24h 、48h 后,加入CCK -8(10μL /孔),

于37℃、5%CO 2条件下继续孵育4h,在酶标仪上读取光密度(OD )值。增殖抑制率%=(OD 不加药-OD 加药)/(OD 不加药-OD 空白)×100%。(3)迁移实验　HUVECs 在含0.1%BS A 的SF M

中饥饿6h 。消化并收集细胞,调整细胞浓度为1×106/mL,24孔板ThinCert T M

插入式细胞培养体系的上室加细胞悬液200μL,下室加诱导物(10ng/mL VEGF )600μL 。37℃、5%CO 2培养22h 后,在另一块24孔板加入4μM Calcein AM (450μL /孔),并将小室移入,继续培养30m in 。除去小室内培养基,转移至含有预温胰酶的培养板,孵育10m in,不时振摇。每孔取200μL 含有迁移细胞的胰酶至黑色平底96孔板内,在酶标仪上测定相对荧光单位数。

(4)粘附实验　于96孔酶标板中每孔加100μg/mL 纤维蛋白60μL,风干过夜。0、10、20、40、80、

160×10-9μg/mL Avastin 与10×10-9

μg/mL VEGF 混合后,每孔加100μL 。以SF M +0.1%BS A 为阴性对照,每组设3个复孔。收集细胞,调整浓度为2.5

×104/mL,每孔加100μL 。37℃孵育1h,P BS 洗4次。4μM Calcein -AM 染色,每孔加50μL,37℃孵育30m in 。在酶标仪上测定相对荧光单位数。

(5)管道形成实验　96孔板每孔以50μL GFR -Matrigel 包被,37℃放置1h 使胶凝固。取对数生长期的HUVECs,消化,计数,以SF M +0.1%BS A 重

悬,调整细胞浓度为3×105

/mL,75μL /孔接种于包被的96孔板中。每组设3个复孔。培养3,6h 后,在倒置显微镜下观察,随机选取3个视野拍照,以I PP 6.0图像分析软件测量小管的长度及个数。

(6)统计方法　采用SPSS 13.0软件进行统计处理,两组间参数比较采用独立样本t 检验,当P <0.05时具有统计学意义。

2结果与讨论

2.1　药物对HUVECs 增殖的影响　

分别以0、10、20、40、80、160μg/mL Avastin 处理

HUVECs 细胞,结果显示,VEGF 单抗对HUVECs 的增殖有抑制作用,且呈剂量依赖性。而在24h 、48h 不同时间段的结果表明VEGF 单抗对HUVECs 的增殖抑制作用也有时间依赖性。24h 时增殖抑制率为0.71%～40.91%,48h 时增殖抑制率上升为24.93%

～97.27%。72h 后HUVECs 几乎全部死亡。

2.2　药物对HUVECs 迁移能力的影响　

迁移实验采用经典的Boyden 小室模型。不同浓度Avastin 处理HUVECs22h 后,通过相对荧光单位

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02—化工时刊　20091Vol 123,No .5 科技进展《Advances i n Sc i ence &Technology 》

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12—李　惠等　建立肿瘤血管生成抑制剂的体外筛选方法 20091Vol 123,No .5　化工时刊

CCK -8细胞计数试剂盒作为检测试剂。该试剂中

含有W ST -8[化学名称为:2-(2甲氧基-4-硝基

苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H 四唑单钠盐)],它在电子载体1-MethoxyP MS [1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯]的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲簪染料,因此操作简单、重现性好。此外,由于该试剂仅在细胞外染色,对细胞活性几乎没有影响,因此,增殖检测后去除培养基即可同步检测细胞凋亡的情况,从而了解增殖抑制与凋亡的关联性

。

本实验采用荧光定量的Boyden 小室模型,在诱导源的作用下细胞能够穿过聚碳酸酯膜,我们以Cal 2

cein -AM 为荧光探针,将迁移至8μm 孔径的聚碳酸酯膜另一面的细胞染色,通过荧光强度来反映迁移的细胞数量,从而定量分析HUVEC 的迁移能力。Cal 2cein -AM 由于在Calcein 的基础上加强了疏水性,因

此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后,酯酶会将其水解为Calcein 留在细胞内,使细胞呈现黄绿色荧光。与传统的细胞固定、染色、在镜下选取视野、拍照计数的评价方法相比,采用荧光定量更加客观且简便。

血管内皮细胞与细胞外基质(Extracellular Ma 2trix,EC M )的粘附是血管新生过程中不可或缺的一个步骤。本实验中我们选用纤维蛋白包被96孔板。纤维蛋白是EC M 的重要组分,具有多个蛋白结合位点,不仅与细胞外基质的结构分子结合,也可以和细胞表面分子结合,在内皮细胞与EC M 的粘附过程中发挥

重要作用[4]

。采用Calcein -AM 染色进行荧光定量,可以方便地读取相对荧光值,避免主观因素带来的误差。此外,由于荧光染色可以区分两种细胞,进而为研究肿瘤细胞与血管内皮细胞之间的粘附作用提供了方便。

管道形成实验是一系列体外评价血管生成方法中最直观的,能够直接反应内皮细胞在体外形成管道的能力,却也是较不容易客观定量的。我们利用I m 2age -Pr o Plus 6.0图像分析软件分析小管的个数和长度,得到了定量的数据,能够较为客观地作出判断。

3结　论

在该体系中,Avastin 能够抑制VEGF 诱导的HUVECs 与血管生成相关的生物学行为,且具有操作简单、可重复性好、易量化的特点,是一种在体外筛选肿瘤血管生成抑制剂的理想模型。

与常规的抗肿瘤药物相比,肿瘤血管生成抑制剂具有许多优势:①处于增生状态的血管有相对较高的靶分子表达,故肿瘤血管生成抑制剂治疗肿瘤具有良好的特异性;②实体瘤生长和转移均依赖血管生成,因而抗血管治疗具有广谱性;③血管内皮细胞直接暴露于血液中,药物能直接发挥作用,故剂量小、疗效高;④与肿瘤细胞相比,内皮细胞基因表达相对稳定,不易产生耐药性;⑤许多肿瘤血管生成抑制剂是内源性的,因此,反义用药不易引起耐药性,无细胞毒药物的巨大毒副作用。正是由于其不可比拟的优越性,肿瘤血管生成抑制剂有着广阔的市场前景。

参考文献

[1]　Folk man J,Long DM ,J r .,Becker FF .Gr owth and metas 2

tasis of tu mor in organ culture [J ].Cancer,1963,16(4):453～467

[2]　Folk man J.Tu mor angi ogenesis:therapeutic i m p licati ons

[J ].N Engl J Med,1971,285(21):1182～1186[3]　Se mela D,Dufour JF .Angi ogenesis and hepat ocellular

carcinoma [J ].J Hepat ol .2004;41(5):864～80[4]　Rhodes J M ,Si m onsM.The extracellular matrix and bl ood

vessel for mati on:not just a scaff old [J ].J CellMolM ed .2007;11(2):176～205

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22—化工时刊　20091Vol 123,No .5 科技进展《Advances i n Sc i ence &Technology 》