Western Blot常见问题及处理总结要点

免疫细胞研究western blot

Western Blot常见问题及处理总结

阿木

1、western blot 的优点

答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便，特异性高。

2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋

白？

答：原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。

3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很

清亮，为什么呢？

答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲

液即可。

4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），

请问怎么做WB？

答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。

其他按步骤即可。

5、我的目的带很弱，怎么加强？

答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。

同时也可以将一抗稀释比例降低。

6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改

变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。

7、目标带是空白，周围有背景，是为什

么？

答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。

8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？

答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二

抗失活。

9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,

底片漆黑一片,是什么原因呢?

答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.

看是否有改善.；b) 显影时间过长。

10、DAB好还是ECM好？

答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。要看

你实验的情况。

11、抗原检测出的分子量比资料上的大，

是怎么回事？

答：a)抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。

b)蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等

12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时

Marker 转上去了，为什么？

答：可能是：a)样品浓度过低；b)转移时

间不够，。

13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一

定要加NaF等？

答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时

候是不用加的。

14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以

共用吗？

答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，

不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是

不能定位。

②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切

片或者冰冻切片。

15、做Western Blot时，提取蛋白后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂

单加PMSF行吗？

答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加

几中种蛋白酶抑制剂。

16、细胞水平要做western blot，多少细

胞提的蛋白够做western blot？

答：一般5×10^6就足够了

17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么？

这样对western blot有无影响？

答：能，没有问题。

18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的

Western Blot检测吗？

答：当然可以，有的甚至可以同时测几十

种样品。

19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋

白，操作需要注意什么？

答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上NaF去抑

制磷酸化酶的活性。

20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？

答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，加

20％甲醇。

21、想分离的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？答：200kd的蛋白不好做，分离胶用7％，

积层胶 3.5％。

22、如果上样量超载，要用什么方法来增

加上样量？

答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。

23、蛋白变性后可以存放多久？

答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

24、我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不

知为何？

答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。

25、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？

解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．

26、问一般一次上样的蛋白总量是多少，

跟目的蛋白的表达量有关系吗？

答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时

间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。

27、做组织样品的western的时候，怎样

处理样品？

答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。

28、问大分子量蛋白200KD，在做western

要注意什么呢？

答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量

参照（否则出现杂带不知道如何分析）。

29、有什么方法可以提高上样量？

答：a)可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量；b)用5倍的上样缓冲液来稀释

变性

30、蛋白的上样量有没有什么具体的要

求？

答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是

不要超载.

31、一抗，二抗的比例是否重要？

答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。

32、要做磷酸化某因子Western Blot，其

二抗有何要求？

答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。

33、免疫组化和Western Blot可以用同一

种抗体吗？

答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

34、Western Blot 中抗体的可以重复应用

吗？

答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

35、在做Western Blot时，PVDF膜用甲

醇浸泡的目的？

答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的

抗原可以在同一张膜上吗？

答：可以。

37、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好，

为什么？

答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。

38、做Western Blot时，同样的抗体免疫组化能做出，而Western Blot却不能？

答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和免疫组化。

39、如果是6×8转印膜，要加多少一抗？

答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。

40、上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达

到最佳效果。

答：无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两

次的缓冲液

41、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么

原因呢？是有的成分不对吗？

答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一

下，选用好的试剂。

42、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可

以一次做好吗？

答：这么广的分布不好转移，一般建议：

21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE，湿转120mA，45-60min 就可以了，可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA

90-120min。

43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜

上，转移效率低怎么样解决？

答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）.

44、我用的是可视marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。

marker是新买的。

答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。

当然梯度胶也是不错的选择。

45、是否Western Blot实验半定量一定要

加ACTIN内参？

答：对于发表文章的实验最好加内参，实

验严谨。

46、核内抗原Western Blot内参选择什么

合适？

答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。

47、做半定量Western Blot，内参β-actin，

GAPDH哪个好？

答：选用beta-actin就可以。

48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？

答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都

没有区别。

49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T 是Tween吗，浓度多大？

答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl：8g，Tris base：2.42g 加水800ml溶解, 加500-1000ul 的Tween-20, 用HCl 调节pH 至7.4, 加水定容至1L.

50、封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如在室温里做，或者要在4

度下?

答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后

4度过夜。

51、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白

的原理是什么？

答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不

易脱落，结果较好。

52、怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道都

Westernblot实验步骤及注意事项1(精)

Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。 3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生

计算机实训总结

计算机实训总结（一）计算机实训就这样结束了，我感觉自己还有好多东西要学，还有好多的东西不懂呢!每次实训，上机操作，我都感觉学到了好多东西!因为是一天到晚的不间断训练，所以记的会非常牢固。在课上，有老师在前面讲解我们都还能跟着做，可轮到我们独立完成的时候，因为实际操作的少，早就忘光了!我很感谢学校有实训这样的安排，把我们这一学期学的东西系统的集中的进行训练，对我们计算机水平的提高发挥着重要作用!计算机一级考试也就快到了，希望通过实训可以帮助我们顺利通过考试。在考试端上不断抽题训练，基本上能掌握WINDOWS XP的基本操作，和 Excel,word,outlook powerpoint。而且我发现我对计算机有了新的认识，以前只知道玩游戏、娱乐和简单的应用。通过这次的实训，我了解到，要真真正正的掌握计算机程序还不是一件简单容易的事儿，但真正掌握后，它带个我们的将是无穷的便捷与科技，我喜欢高端便捷的生活。文字录入题是操作题里的第一大题，而且有时间限制。通常在练习的时候会先完成这一题，因为要打标点的关系，文字输入的状态需要改变，会因此浪费掉时间，总的来说打字速度还有待提高。 WINDOWS XP的基本操作题，主要学习了鼠标及窗口操作、任务栏和开始菜单设置、控制面板和显示设置操作、添加和删除程序等计算机基本操作技能，这些里对控制面板的了解还不够深入。同时也熟悉WINDOWS文件管理方式，了解路径、文件夹、文件、文件类型的概念，能够按需要创建文件和文件夹，掌握在资源管理器中对文件和文件夹进行复制、移动、删除、压缩等常规管理任务，懂得查看和修改文件属性，为文件创建快捷方式。 EXCEL在平时用的少，了解也少，但是基本上掌握了excel工作表的建立、删除、重命名等操作。和工作表中数据的输入、编辑操作，对于excel计算公式与常用函数的使用还不能完全运用自如，尤其是要套用公式的。 Powerpoint的制作。联系中掌握了演示文稿的编辑与文本格式化操作，和演示文稿的演示技术与设置。在平时，常常会有PPT演讲大赛，这正好可以帮助我们制作PPT。 Internet与outlook expres。实训里掌握了IE的基本应用：浏览网页，将指定的页面、图片下载，收藏夹的使用与管理。也掌握了outlook express的帐号和邮件管理，电子邮件的建立和发送。 Access数据库、表与查询的创建与使用。掌握了数据库、数据表创建的方法，数据表的编辑操作，数据库中数据表间关系的建立与设置，和数据库中查询的创建、修改及操作。网页图片的处超链接的创建与框架网页。在习题里，掌握了网页中图片的插入与编辑，网页图片与文字环绕方式的设置，文本超链接的建立，图片超链接建立和热点的建立，框架网页属性的设置等。但是平时最注重联系操作题，常忽略了理论题。信息处理与计算机基础知识，都掌握的不好，还有很多知识记不准，这是我要不断加强的地方，在考试之前多背，加强记忆。计算机实训让

westernblot详细图解

检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

Western Blot常见问题及处理总结

免疫细胞研究western blot Western Blot常见问题及处理总结阿木 1、western blot 的优点答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便，特异性高。 2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？答：原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。 3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？

答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。 4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。 5、我的目的带很弱，怎么加强？答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。 6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改

变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。 7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。 8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二抗失活。

建筑施工操作工种实训总结-总结报告模板

建筑施工操作工种实训总结作为大一新生,实训对于我们来说是那么的新鲜,那么的充满诱惑力.在专业老师的带领下,我们第一次踏上实训的路程.在这为期4天的实训中,我随时都保持高度警惕,注意到把书本上的知识运用到实践中去,把理论与实际相结合,并从中获得了很多,下面就这次实训我简单地谈谈自己的体会. 我们实训的第一站是建筑工地，进工地只前，该工地的施工员下班给我们介绍了建筑工程方面的相关知识.他说做我们这一行首先就是要能吃苦耐劳，叫我们要做好思想准备.因为在大多数的时间里，都是顶着烈日工作，整天都是跟钢筋混泥土打交道，先不说皮肤被晒得嘿嘿的，就是每天干下来那种臭汗浸泡全身的滋味也是一般人吃不消的。我想，我既然选择了这个专业就不会怕吃苦，对于这一点我相信自己已经合格了。在听完施工员讲了安全事项后我们就迈进的工地现场。进入工地后我茫然了。若大的工地，我不知从何下手。只看见工人们忙个不停，只听见鼎鼎当当的敲打声，抬头一望，哇塞，30多层高的大楼直立着，让人看得头晕。说实话，第一次出去实训真的染我还有点不知所措，不知道该做些什么，不知道如何去学习。就在工地上消耗掉了时间，心理也不大平衡，别的同学貌似都学到了不少东西，而我却 .....唉，郁闷在第二次上工地之前我有了较明确的方向，我要把书本上所学的知识运用到实践中去，要把理论与实际起来，不懂就要多向老师或工人师傅多问问，就用这种方法，我在以后上工地的时候整了个大丰收，主要懂得了以下知识：一，对框架---剪力结构的认识我们第二次上工地所参观的建筑采用的是框架---剪力结构。它是框架结构和剪力墙结构两种体系的结合，吸取了各自的长处，既能为建筑平面布置

蛋白Western blot电泳——试验中常见问题及解答

蛋白质电泳与western blot1 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。（1）原理（2）分类 ①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题 3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题 9. 条件的摸索10. 方法的介绍 11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。（2）分类 ①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。（3）主要试剂 1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和 1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、，1mlH2O去离子水配制，室温保存。 3、分离胶缓冲液:1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C 保存。 4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05g Tris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。 5，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制. 6.1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。 7缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

western blot操作注意事项

一．配胶 1．注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。 2．分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可 3．封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。 4．灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。二．样品处理 1．培养的细胞（定性）： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。 ⑶100℃，1min。 ⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。 ⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP 管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 ⑹待样品恢复到室温后上样。 2．培养的细胞（定量）： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 ⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 ⑷12000g离心，4℃，2min。 ⑸取少量上清进行定量。 ⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。 3．组织： ⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 ⑵12000g离心，4℃，2min。 ⑶取少量上清进行定量。 ⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液

western blot实验经验总结

western blot实验经验总结 1.抗体的选择对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。在这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot 实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对（抗体品种，货号等完全一致），在都能做出来的前提下，原装抗体能重复使用的次数要多出许多。具体原因我已经揣测了好几年，不敢说出来，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖，也会有所不同。揣测归揣测，假如只为了发论文毕业走人，可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。western blot能做出来的确实不多，而且杂带多，背景不干净。我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化，怎么说呢，应付硕士论文够了。我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。效价非常不错，夸张的时候1：10000都能做出条带，唯一的麻烦是兔子太骚（骚臭），不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。如果读书非常悠闲，老板又特别想拥有手工作坊的情况下，可以自己伺候折腾兔子来玩玩，刚开始的时候还是蛮有成就感的。只是单凭抗原表达和制备多抗，是不是可以写成论文毕业，估计因校而异了。 2.Western Blot设备目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad（伯乐），尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶，但通常用不上，由此造成垂直缓冲液的浪费，而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽，容易漏液，塑料夹应该是有疲劳寿命的，估计日子一长，弹性就会改变，所以如果你们实验室刚买了MINI4，赶紧用，遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。 Biorad的一套系统得两万多，西部能玩得起伯乐的还真不多。好在咱中国人聪明，上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样，而且可以通用，不带电泳仪是5千多一套，挺好用的。唯一的不足是塑料寿命不如伯乐，胶架容易断裂。不过仔细算算，三套天能也就是一套伯乐的价格，值了。北京六一的垂直槽

免疫组化操作方法原理步骤以及常见问题处理大总结

免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较

蛋白质印迹法westernblot

蛋白质印迹法蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法类似方法2 Northern Blot 杂交方法使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴

原理与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色

毕业实习报告总结实训报告总结范文

毕业实习报告总结实训报告总结范文 1

《网络运营与网络营销》实训计划一、实训内容网店的运营和管理、网络营销和推广（网络信息收集、网络市场调查、C2C(B2B、B2C）电子商务网站建设实训、知识问答营销推广、E-mail 营销推广实训、搜索引擎营销推广实训、博客与微博营销推广实训、网络营销策划实训）二、实训目的和要求（一）专业能力目标 1.掌握C2C(B2B、B2C）网站的运营过程。 2.掌握基于C2C(B2B、B2C）中介网站开店实现销售的方法。 3.掌握常见的电子商务网站及网络产品的推广和经营手段，并具备一定网络产品或网站推广的能力。掌握一定的电子商务经营经营的方式和方法，能把计算机技术应用到实际的商务活动之中。 4.基于自己的产品，或者根据指定网站制作网络广告的推广计划；设计基于自己的产品或者指定网站电子邮件营销的邮件内容，掌握确定获取收件人方法；基于自己的产品或者指定网站实现BBS营销；基于自己的产品或者指定网站实现网络搜索引擎营销；基于自己的产品或者指定网站实现博客营销；基于指定产品或者网站实现一份

详细的网络营销策划书，进行病毒式营销或事件营销（二）通用能力目标 1.自我管理和自我发展安排自己的任务并承担责任。安排好自己的时间完成课题。 2.与她人合作共事 ——个人和群体良好的合作交往。 3.沟通、交往与联系经过各种直观的方式表示信息。用书面形式交流，传达信息。 4.安排任务和解决问题获取、整理、利用、使用信息资源。发现并解决常规或非常规问题。（三）实训要求为确保实训能顺利进行，圆满成功，培养同学们良好的习惯，增强修养，提高个人素质，特制定如下实训要求： 1.实训开始，按学号顺序分组，一人或多人一组，选一名同学为

westernblot详细图解详细版.docx

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；

SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）（6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提

汽车电气设备与维修》实训总结

《汽车电气设备与维修》实训总结概论随着社会科技的迅猛发展，经济的迅猛增长，工业结构发生改革，我们应该清楚地认识到科技创新无疑会成为21世纪的主力军，势必会带动汽车行业的飞快腾飞。因此汽车行业也同样会成为社会经济结构的主力军，而且中国也成为了汽车销售的第一大国。面对这个形势，作为汽车专业的学生，既是机遇又是挑战，因此既要赶上当今社会的汽车热潮流，又要有扎实的专业技能，方能立足于竞争激烈社会之林中。通过本学期的实训，不仅使学生掌握了汽车电气设备的基本组成和相关知识，而且也意识到在以后的工作学习中团结协作，以及充分发挥自己的主动性，创造性来解决问题的能力的重要性。并且要学会对已学过的知识和工程文件记录要及时的反省和总结，从而实现知识的根深蒂固！一、实习内容及心得本学期我任教1122、1116、1117班的汽车电气设备与维修课程，通过本学期对充电系、启动系、点火系、照明、信号、仪表及报警装置等的实训，使同学们了解了汽车电气设备拆装操作的基本要领和基本知识，熟悉安全操作规程和防护要求，能够使用汽车电气设备构造与维修常用的拆装工具和量具，并具备拆装的基本操作技能，掌握各典型总成部件的构造、工作原理和调整方法，让同学们对汽车电气设备有一个感性和理性的了解并得到岗位的基本训练，为缩短未来工作岗位的适应期打下基础，实现了理论与实践的有机结合。从而达到了手脑并用，双手万能的目的。在实训课程中，同学们严格按照老师的安排与计划，按照5S管理要求，同时实训时一步一步地对汽车电气各部件进行拆装，并对照资料熟悉各个机构的作用、工作原理与拆装的注意点。

1.学习了汽车维修中可导致人身伤害的因素： 1）服装按要求穿着，如：不穿拖鞋工作。 2）按章程要求操作。 3）在车间内不允许抽烟，容易引发火灾或爆炸事件。 4）蓄电池正负极的拆装顺序要按照正确操作来做。 5）高空作业要注意人身安全。 6）防止触电。 2、学习了汽车维修的基本要求使学生掌握理论教学的重点内容，了解高级层次的理论；使学生掌握几种典型现代汽车电气设备的正确使用和常见故障的诊断；使学生真正将汽车理论与实践相结合，为做蓝领人才打下坚实基础．随着汽车技术的日益发展，现代汽车电气、电子设备的特点，主要体现在功能集约化、控制电子化和连接标准化上。在分析电子线路的故障时， 3.学习了5S标准 5S标准对于培养学生良好的工作习惯，树立学生正确的职业道德观有很好的作用。通过5S标准的训练可以使学生更好更快的适应企业的管理，融入企业的文化。为了坚持文明生产，由日本丰田公司提出的“5S”理念。如下是5S标准： SEIRI(整理):确定某种物品是否需要，不需要的物品应立即丢弃以便有效利用空间。 SEITON(整顿)：这是一个整顿工具好人零件的过程，目的是为了方便使用。

计算机常见问题实训总结

电脑学习经验一、装系统（傻瓜式） 1.U盘启动。制作U盘方法，在系统之家下好所需要的系统，比如：XP系统（适用于奔腾处理器），WIN7系统 32位(适用于2G或4G内存，酷瑞i3的处理器),WIN764位(适用于4G,6G内存，酷瑞i5的处理器) ，一般无特殊需要不要装64位的。系统的文件后缀为（.gho ）大小1G多，下好后放U盘里，再下载DOS工具即大白菜传入U盘，再下载Maxdos静象复制文件，再下载驱动精灵，路大师，所下载的都要放入U盘中。在电脑安装大白菜后，在程序启动栏找到大白菜插入UZ盘，点U盘制作，完成。 2.台式机装系统。开机按不停del键进入BIOS的修改界面，一般情况只要修改为U盘启动，按F10 保存，等待进入DOS工具，运行，按四，后输入ghost回车点OK123按TAB键选择最上面的对话框，进入U盘（这里区分什么是U盘的方法：分析前面的比例系数唯一不同的如1:2或2:1）选择你所需要安装的系统类型回车，接下来有四个对话框1选择数据大的，点YES，这样程序开始装了，在走完100%后立刻拔U盘，自动运行装驱动，装好后出现桌面，调分辩率，删掉桌面一些不要的图标，右键点我的电脑或者计算机看管理或者设备管理，看是否图标前面有！或？或叉，这样都是说驱动没装好，这时你把驱动精灵装上，自动运行检测，修复没有下好的驱动，解决问题再关闭，这样你只剩下最后一步备份还原了，双击U盘中的MAXDOS安装，再运行选择自动备份系统，等待这样就装好了。 3.笔记本装系统不同之处。不同的机型进入BIOS按键不同（联想F2，dell，sony，东芝，hp，thin kpad按enter键，）修改BIOS的SA TA模式为compa或者IDE模式，其余的一样在走完第一个100%时按相应的键把BIO S改回来其余一样。二.基础知识 1.台式机。硬件问题: a. 开机不显示。电路板不通电即风扇不转，可能是电源坏了，换新电源试，如果风扇还没转可能主板坏了。转了没显示换内存条，还没有把电路冲放电，换电池看。电路通电没显示，可能是显卡坏了，插诊断卡，观察数字跳动规律。 c:风扇响可能风扇坏了，换新的。软件问题: a:系统卡，系统需要清理，重新换系统 b:蓝屏或白屏，进入DOS工具三.遇到问题的解决方法。 a:进水了，先不开机拆机吹干（冷风），有明显腐蚀，用洗板水洗 b:横轴断了，拆机换，成本假70 c:测试出硬盘坏了，直接换350(360G) d:机子反应慢，内存版本过低，加内存注意是二代还是三代，一代没有了。 e:屏幕压坏了，通过投影仪的切换确定，拆开看是否为超薄屏，要定，厚的直接换四.一些需记的规则。 1.网线的接线规则：白橙橙白绿蓝白蓝绿白灰灰 2.(1)装新台式机的规则：1.装好电源，光驱，放好主板，把金属片压好，装cpu风扇，接好电源线，风扇线，装硬盘接好线，接好内存条（压紧），接好光驱线，接好复位线，开关线，正负极线，接好音频线，USB线 (2).开完成机分四区装系统，完成。

最详细的WesternBlot过程步骤详解

最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解

最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】

Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

WB实验问题

Western Blot问题指南时间：2011-05-13 08:55 来源：网络作者：admin点击：3679次根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）； 1.参考书推荐A.对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies （a laboratory manual ，根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）； 1. 参考书推荐 A. 对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies （a laboratory manual，wrote by Ed Harlow ，david lane ）两本书不错。 2. 针对样品的常见问题 B. 做线粒体膜UCP蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120 口g,换了个santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单力口PMSF亍吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：1,样品不能反复冻融；2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。 C. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。 D. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。 E我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5—10%甲醇。 F. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Wester n Blot吗？解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6%, Stacking Gel 3.5 %。 G. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5m m的comb。