western blot问题汇总
WesternBlot问题解答
1.凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。
2.条带歪斜、或漂移
因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。
另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。
3.单个或多个白点：转膜时在膜与胶之间有气泡。做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。
4、转膜缓冲液过热：
缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高。按照上述方式配液，同时转膜过程中注意降温。我在冰水混合物中转膜，效果很好。
5背景过高！
1）封闭不全，我用5%-10%的光明脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。
2）一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。这种情况通常可以通过加入TWEEN-20或多次洗膜加以解决。如果问题不能解决，那么降低一抗浓度，或更换封闭液种类可能解决
3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。
4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。
5)曝光时间的控制。通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。如果背景强于条带，那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。
6、没有信号：
1)用单抗时比较容易出现这种情况。因为单抗主要是针对天然蛋白，这个时候.TWEEN-20的作用就显现出来了，它可以增加抗原抗体复合物与膜的结合。
2)确信你的蛋白表达
3)确信蛋白高效的转移到你的膜上
4)一抗二抗的效价问题。无论哪个无效都不能发光，因此预实验一定要从最低的稀释度开始，以排除抗体的因素
5)ECL试剂盒质量的问题，不可小觑。偶亲身经历。碰到一批次品。两个月白搭！
7、微量进样器堵了怎么办？
首先从预防入手，每次用后的进样器及时用蒸馏水清洗！
如果堵了，不要紧，有办法：可以用如下办法解决：
1）首先反复推拉上样针，看是否可将堵塞物吹出来；
2）方法1不灵，若是25或50ul的针，把针从后侧拔出，然后重新插入，使其内部产生气压，可能压出堵塞物质；
3）如上述方法不灵可以在拔出后注入些清水，然后重新插入，用水压排出，
4）最后的方法，最灵的方法：开始步骤同第3种方法中，在加入水后，将上样器的前端针部放在酒精灯上煅烧至红色（估计在什么位置堵的），注意烧红部分不要距离玻璃过近，然后，趁热突然推针，将水强行推出，通道打开后，再通过稀酸或稀碱冲洗即可！
5）或者放在超声清洗仪里，超声试试
注意，切记在推拉过程中小心不要把针弄弯
8、关于SDS蛋白电泳的一点心得
最近在做蛋白电泳时候遇到了些麻烦，在这里发了帖子，并且得到了很多同人的恢复。本人在看过回帖后，结合自己的试验，重新设计了方案，得到了满意的结果，同时感觉有必要拿来和大家分享：
1）蛋白电泳中出现的纵向条带：原因主要是由于电泳样品或是电极缓冲液中有没有溶解的样品颗粒所致，上样前充分将样品离心，或重新使用新配电极缓冲液即可解决。
2）电泳条带前沿在染色脱色后呈尖形。原因是由于上样量大且工作电压过大引起，我实验中采用90/120，后来改用了80并且不换电压；同时减少上样量到原来的一半，得到了满意的结果（我的样品分子量18000 Da，15%的分离胶）；
3）电泳结束后，染色脱色结果整个胶面呈现蓝色，背景很重怎么也脱不去，改用新配的电极缓冲液。问题解决。是电极缓冲液污染的结果（平时本人有个坏毛病：喜欢在缓冲液中涮上样针，导致缓冲液污染）。
9.分别用多大电流转膜?
1）一般跟你的分离胶的浓度有关。
2）与你的转印系统型号有关！
3）与目的蛋白的分子量有关1
一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h；
10.好几个蛋白，我做免疫荧光都做得很好，抗体说明也是可以用于western的，可是就做不出来！显影后只有很弱的非特异带。而另一个蛋白，perk却做得很好，操作都是一样的，抗体稀释也是按厂家说明的。
1)你用的是单克隆抗体吗？如果是的话，请注意western 是在蛋白质变性的条件下进行的，活性状态下可以反映的抗体在变形状态下却不一定特异性很强，可能其他的蛋白质变性之后产生了能与之反映的抗原决定簇！
另外，要做好对照！抗体是什么公司的？有的公司会将康体稀释后再卖（奸商），所以抗体的滴度，根据公司的要求也不一定准！
2)如果是单抗，western blotting电泳后蛋白变性，构象表位可能消失，仅存在线性表位，单抗可能不识别。所以WESTERN BLOTTING 做不出来了。
11.我的WESTERN为什么出现了多条带，每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律，为什么？是封闭时间不够吗？请指教我做WESTERN 是想知道处理后细胞分泌细胞因子数量的变化，这样必须要内参吗？
可能性
1)一抗、或二抗抗体浓度太高
2)多克隆抗体本身的非特异性反应
3)抗体的特异性不强
4)蛋白异构体或降解！
5)你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化。所以严格意义上说，内参事必须做的。
12.转膜的时候，最下端的蛋白条带很清楚，可是上边啥都没有看见，社么原因？
1)可能是时间不够，因为一般是分子量小的先转上去的，大的后转，看你的目的蛋白了，如小的话，最后
不要太长时间
2)转膜的时间要根据你的目标蛋白大小和胶浓度而定。蛋白越大、胶浓度越高，时间就要越长。经验是：12％－18％的胶、4－18kD的蛋白用100v衡压/350mA衡流75－90min的条件都可以成功转膜
3)主要是转膜时间不够，若想证明这个问题，可把原来的SDS-PAGE，做一下染色，看看大分子量的蛋白是否仍在胶上。另外，做western时，转膜并不是最复杂的，但无疑是很重要的，如果胶上残存的目的蛋白过多，会使与抗体结合的蛋白负荷不足，而影响实验结果，因而要反复摸索转膜时的时间、电压/电泳，直到获得满意转膜效果。
WB的关键点我觉得有一下几个：一是样品的处理；二是电泳和转膜条件的摸索；三是保证试剂、抗体的质量。
13.western blot 怎样做内参照阿？
1）可以转膜后先用目的蛋白的抗体做杂交，将抗体洗掉，再用内参蛋白的抗体重新杂交，结果显示信号亮度一致，认为上样量一致；。
2）同样条件做两块胶，等量上样，同时转膜；一块做内参蛋白，一块做目的蛋白。
3）只做一块胶，用蛋白marker做标记，转膜后用丽春红染色，可见到42kd（β-actin）左右处有浓染的条带，在42kd略上方将膜剪开分别作杂交即可。要求目的蛋白和内参蛋白大小有一定的差异。
转大分子量的蛋白可以在转膜液中加入SDS至0.05%，并且可以适当减少甲醇用量，如15%的甲醇
电泳中SDS是十二烷基硫酸钠。十二烷基磺酸钠简称为SAS，两者的区别是其中S的化合价不同，各是多少没去考证。由于最初翻译者将SDS翻译为十二烷基磺酸钠，被很多书籍引用，故十二烷基磺酸钠为误称。真正的十二烷基磺酸钠不能用于WESTERN。
14.胶为什么总是漏？
1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件，下次用之前，用75％酒精擦拭玻璃和胶条，能有效防漏，且利于剥胶。
2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方
3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了
4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。
5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用
6）玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在
玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干就OK了（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，赢伟凡士林不导电，会影响第2相的效果的
7）你可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。
8）因为两块玻板没有放的完全对齐，底部不在同一个平面，所以封条封不严，重新对齐后就不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。用手感觉一下确定在同一平面上后，放到灌胶架并压在封条上，卡紧。注意两边均匀用力，一般不会再漏。9）先把两块玻片放在夹子上，不要加紧，放到架子上，使两块玻片的底部对齐，夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片，这样一般就不会漏胶了。但是如果你放了垫片再对齐玻片底部，或者在桌子上对其玻片底部然后放到架子上的话，经常会漏胶
15.条带跑得比正常的窄？
1）可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀
2）是不是有窄有宽？可能与你拔梳子的时候有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。
3）可能是你样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带走的较慢，好像与你的预想不一致4）常见的原因是：每孔上样量不均匀，应确保每孔中上样量一致
5）可能是系统的ph出了问题，有可能是你的电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液看看，看是否能成功
16.为什么会有“微笑”和“倒微笑”这样的效果呢？
1）"微笑"是因为你灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。“倒微笑“也称“皱眉“现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象
2）书上说出现“微笑”是因为整个胶冷凝的不均匀，中间部分和两端受热不一样而致成了“倒微笑”可能是因为两端的胶凝的不好，加APS和TEMED后应该混合均匀。
3）样品中盐浓度过高？点样量太多或每孔点样量不均匀？电泳电压不稳定或过高？
17.Western-blot 制胶时好多泡泡怎么办？
1）首先，玻璃板一定要洗干净，用洗洁净洗，冲干净后再用双蒸水冲一，晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。
2）配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子。
3）倒胶的时候，用1ml的枪沿一侧缓缓加入，不要打到头，以免带入气泡！
4）将胶在小烧杯里配好后，将电泳槽略微倾斜，将烧杯的嘴靠在玻璃边缘，直接倒进去，速度快，而且不容易产生气泡，不妨试试
5）用双蒸水封时建议用200ul的枪加水，这样压力小，以免把胶冲起来！
6）国产的只能是缓慢加样，别把气泡加进去。如果加进去了，小心把整个板在桌上敲敲可以让气泡浮上来。
7）分离胶中的气泡与插梳子有关，垂直插容易产生气泡，且不容意排除。将梳子倾斜5-10
度插入，即使产生气泡也可以也可以通过轻轻晃动梳子使气泡从一侧逸出。
8)pinghw 还有一个制胶起泡泡的原因，就是配胶的液体全部在四度存放，室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系，液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡，这种情况在夏天室温较高时更容易出现。避免的方法是将制胶成分中除催化剂外的部分配置后放室温下静置一会儿，减小温差后再加入催化剂制胶。
18.一些琐碎的细节，但却是实验中可能经常遇到的令人头痛的问题：
1 ）安装好的制胶装置，最好先用配置电泳缓冲液的水加满检验一下是否漏水，检验确认不漏水的装置再用于制备凝胶。确认不漏水后，倒出水，然后使其尽量流出，其实残留的一点水并不影响结果，而且还会使电泳好的凝胶容易剥落下来。漏水的装置制作的凝胶尽管可以使用，但它会造成电泳时候电流的分流，不但影响电流的效率，而且还会使部分加样孔的条带歪曲。
2）制胶时最好最后加入AP，这样可以避免偶然情况下不能马上灌胶而导致胶的聚合，确认所有的东西准备齐全了，再最后加入AP，混合均匀后马上灌胶。一定要使配胶的几种溶液混合均匀，这是制得性质均一的凝胶的前提。
3 ）进口的AP可以很快使胶凝聚。所以，AP的用量最好比书上推荐的用量少点，这样可以使胶的溶液慢慢聚合，这更有利于形成均匀一致的凝
胶。也不会使操作变得手忙脚乱。
4）有时候，梳子拉出以后，明明看不到加样孔中有凝胶，但是就是加不进去样品，这主要是由于梳子与较大的那块玻璃之间的缝隙中存留的制胶溶液凝聚后形成的很薄的一层凝胶造成的。由于很薄，当梳子拉出后，它就会和玻璃分离，刚好将加样孔的口封住了，如果用20ul的加样器加样的话，这层凝胶很容易将样品堵在外面，只要将这层凝胶除去，就可以顺利加样了。如果用专门的微量进样器，不会存在这样的问题。
5）薄膜原因可能是由于梳子和 slide的厚度不是十分一致，而这可能是无法避免的。除此之外，也有由于拔出梳子时候造成的堵塞现象，个人认为，这样的堵塞现象可以通过插入梳子时先用水（配置电泳缓冲液的水）湿润梳子的方法避免，这样还有利于形成整齐的加样孔。不管怎么做，一定要等胶完全聚合好了再拉出梳子。如果孔的形状变化了，扭曲了，肯定会导致条带不一致，结果不好。
6）wangjun2002274 主任的：加样的时候也是用专门的微量进样器，是宁波出的，50ul容量，每次都是用20ul的上样量。以前等胶干后拔出梳子，马上用水冲洗进样孔，就是用的那种塑料瓶挤压冲洗，薄膜就没有了，注意不要用力过猛，如果胶还没有完全凝，很可能导致进样孔不整齐，那么跑出来的条带就有窄有宽了
将变性的和不变性蛋白同时加样，相同浓度的抗体反应后，不变性的条带也可见，但明显较弱。其原因，查资料后认为蛋白的某些抗原性被其天然的结构所掩盖，通过蛋白变性可使其抗原表位暴露。而且，现在的抗体都是用细菌表达的某段融合蛋白并且变性后来诱导产生的血清，与体内真正的蛋白有区别的，因此需要通过煮沸来变性体内蛋白，暴露需要的抗原部位。SDS主要为统一不同蛋白的电荷，去除其对电泳迁移率的影响。
一抗孵育：分别与相应的抗体（初次做建议按照试剂要求的最高浓度开始，别舍不得，否则没结果更难受），及内参照抗体（β-actin抗体1:10 000，这蛋白抗体效价特别高，所以预实验做一下一般会有阳性结果，一旦没条带可以排除你的实验操作中的因素）于室温温育90min，4℃过夜，再次室温温育60min。抗体稀释液为TBST（内含1%的BSA）（其实直接室温2h就够了，背景老是太高放4度过夜有时候对降低背景效果不错）。
19.漂洗：室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗3次以上，每次各5min。勤换液比延长漂洗时间更有效。
显影定影完毕，要用自来水冲干净胶片，不划伤，晾干以后再收藏，很重要！否则粘糊糊的，
很容易把你本来漂亮的条带给破坏了，这里出岔子就功亏一篑了！
配胶准备：将玻璃板、梳子有清洁剂或稀酸泡洗，电泳装置用水冲洗并晾干，亦可用酒精棉球擦洗灌胶面晾干
Westernblot实验步骤及注意事项1(精)
Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。 3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参 考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒 进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要 采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生
综合实践活动教学工作总结
综合实践活动教学工作总结 皇集乡初级中学高岩
综合实践活动教学工作总结 一学期来，在学校领导的关怀和指导下，我和同学们在综合实践活动课这片快乐的绿洲上一起研究，共同感受、共同分享、共同成长着，下面就这学期的工作总结如下： 一、创造性的运用教学资源，上好每一堂课。 为了适应学校课程改革，全面推进素质教育，结合综合实践活动课的要求，目前我们学校综合实践活动课的教学资源采取由学校教师自主开发与借鉴以前综合实践活动资源包相结合的方式进行。由于综合实践活动没有固定的教材，更没有现成的教案，对于教师而言每一节课的开展都要费不少脑筋，为了上好每一节课，教师要善于创造性的使用教材。同时可根据自身特点及学生实际开展主题教学活动的开发。如这学期开展的《科技小发明、小制作》，等研究性学习活动贴近学生实际，充分发展了学生的主动性，培养了学生搜集资料、动手实践、调查研究的能力，收到了很好的教学效果。 回顾半年来综合实践活动课教学工作，我体会到了付出的艰辛和收获的喜悦，下学期，我们将继续发挥教研组教研的优势，将我们云枫初中的综合实践活动搞得更加丰富，更具实效性。 二、存在的问题和困惑 虽然在课堂上自认为已经把学习任务布置得再清楚了，也多次强调要按时完成，可每次去检查完成情况时都让我大失所望，同学们不能自觉地完成，一催再催，虽然我也采用批评加激励措施，可仍有不少同学没完成，可能是同学们对这门课程的认识不够。那么如何转变
学生的思想，提高学习的积极性是一个亟待解决的问题。 三、今后工作的方向和思路 1、加强理论引领，向有经验的教师请教，向身边的优秀教师学习，大胆创新和实践，多反思和总结，积极参与各种学习培训和竞赛活动，不断提高自己的专业水平和科研能力，让学生爱上综合实践活动课。 2、以身作则，组织和带动其他综合实践活动老师积极参与课题研究，进一步完善综合实践活动评价机制，探索一条螺旋上升的本土化的综合实践活动实施之路，更好地实现课程资源共享，促进综合实践活动的常态化、有效开展。
小学综合实践活动经验总结材料
小学综合实践活动先进事迹材料 许昌市郊董庄小学常丹 综合实践活动是基于学生直接经验、密切联系学生自身生活和社会生活、体现对知识的综合运用的实践性课程。随着课程改革的逐步推进，综合实践活动这一崭新的课程形态正日益深入人心，并显示出它强大的生命活力。几年来，我以增强学生的探究意识、创新精神和实践能力，培养学生综合运用知识的能力和社会责任感，提高学生的整体素质为目标，切实重视了综合实践课程的开设和探索，取得了一定的成绩。 一、开发课程资源，拓展活动时空。 一是开发环境教育资源。为使学生全面正确地认识环境，自觉自主地保护环境，我重视了环境教育资源的开发和利用，通过组织观察、进行采访、专题研究、参与管理等形式，让学生感受环境与生活、与社会、与人类的紧密联系，获取环境保护的初步知识，增强环境保护的意识。 二是开发生活教育资源。我注意挖掘生活教育资源，让学生为家庭就餐环境选择适合就餐环境的音乐，为中午练字时间选择合适的音乐，选择合适的音乐进行配乐诗朗诵或根据音乐所渲染的意境选择合适的诗文；音乐进行即兴舞蹈、模特表演等；听音乐想象作文等；利用生活中的实物创造音…从而让他们在生活中感受生活，认识生活中的音乐美，学会生活，使他们成为生活的主人。三是开发科技教育资源。我在进行《在生活中发现音乐美》综合
实践活动，通过上网查询、调查访问、实验研究等多种形式的综合实践，向学生打开科技的大门，让他们尽快接受科技新信息，了解科技新成果，认识科技新发展。 二、讲究实施方法，确保活动效果。 综合实践活动受多方面因素制约，开始实施阶段，我曾碰到诸多矛盾。一是时间的安排问题。二是内容衔接的问题。三是谁来兼课的问题。四是教师指导的问题。有些复杂的活动，老师不作具体指导，学生不知干什么，怎样干。 1、时间确定体现灵活性。根据课程计划，每周仍是一节大课、一节小课。但在具体操作上，根据实际情况，灵活掌握，合理安排，可分散使用，也可合并使用。对部分阅读型、调查型、实验型、采访型的任务，提倡让学生利用双休日去完成。课表上的时间，主要用于实践活动的启动、学生难点的答疑、活动成果的展示。 2、内容选择重视系列性。综合实践活动的空间广阔，内容丰的，为保证效果，我认真研究教材，寻找学科教材知识之间、能力之间、情感之间的联系点，沟通学科教材与环境教育、生活教育、科技教育、文化教育、品德教育间的联系，挖掘活动主题。在此基础上，围绕主题，认真思考，把握联系，从而围绕一个主题，尽可能地将诸多内容融合其中，围绕主题开展系列活动，使年段之间的综合实践活动内容上互相联系，逐步推进，以形成系列；活动上互相配合，互相促进，以强化效果。 3、活动过程体现操作性。为保证活动的全员参与和全程参与，我
westernblot详细图解
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
综合实践活动工作总结
总结范本：_________综合实践活动工作总结 姓名：______________________ 单位：______________________ 日期：______年_____月_____日 第1 页共6 页
综合实践活动工作总结 本学期，我校综合实践活动是按班级为单位开展。密切联系学生的生活经验和社会发展的实际，确定好综合实践活动的主题，并围绕主题制定好切实可行的活动计划，以保证活动有序深入地开展。结合本地区的人文地理条件优势，社会热点问题及学生的身心特点，提出课题，在实施过程中尊重学生的选择，生成或改变。 对于综合实践活动课，老师们高度的重视，制定了详细的工作配档，指导按工作配档采取课时集中与分散相结合的方式，自主的组织活动，大部分学生参加了课题的研究。在活动中，强调学生的亲身经历，要求全体学生积极参与到各项活动中，在“做”、“考察”、“实验”、“探究”、“设计”、“创作”、“想象”、“反思”、“体验”等一系列活动中，发现和解决问题，体验和感受生活，发展实践能力和创新能力。 在活动中，学生是最大的受益者，在好奇心和求知欲的吸引下，他们会主动的去获取知识，去查询信息，长期这样可培养良好的学习习惯。在活动中，他们的实践操作能力、分析问题的能力、综合表达的能力、与人交往的能力等等方面都得到了提高。综合实践活动为他们打开了想象的翅膀，也为他们搭建了展示自我的平台。在这一系列的活动中，学生了解了家乡的实际，形成爱家乡、爱社会、爱国家的思想感情，增强民族自豪感，以及对国家、对社会的使命感，掌握知识，提高能力，开拓视野。可见，通过综合实践活动课，学生不仅在活动中获取知识，培养能力，而且在思想上能够得到纯化，心灵得到升华。 综合实践活动是教师引导下，学生自主进行的综合性学习活动，是基于学生的经验，密切联系学生自身生活，体现对知识的综合运用的实 第 2 页共 6 页
Western Blot常见问题及处理总结
免疫细胞研究western blot Western Blot常见问题及处理总结 阿木 1、western blot 的优点 答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便，特异性高。 2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋 白？ 答：原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。 3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很 清亮，为什么呢？
答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲 液即可。 4、我做的蛋白质分子量很小（10KD）， 请问怎么做WB？ 答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。 其他按步骤即可。 5、我的目的带很弱，怎么加强？ 答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。 同时也可以将一抗稀释比例降低。 6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改
变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。 7、目标带是空白，周围有背景，是为什 么？ 答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。 8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？ 答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二 抗失活。
western blot操作注意事项
一．配胶 1．注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。 2．分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可 3．封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。 4．灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。 二．样品处理 1．培养的细胞（定性）： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。 ⑶100℃，1min。 ⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。 ⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP 管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 ⑹待样品恢复到室温后上样。 2．培养的细胞（定量）： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 ⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 ⑷12000g离心，4℃，2min。 ⑸取少量上清进行定量。 ⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。 3．组织： ⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 ⑵12000g离心，4℃，2min。 ⑶取少量上清进行定量。 ⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液
综合实践活动经验小结工作小结
综合实践活动经验小结工作总结 自综合实践活动课程设置以来,本校开展此学科教学已有一学年整.此门活动课的开设,为教师和学生提供宽广、自由的活动空间以及广阔的活动背景.在一年的教学中,我们摸索到,只有教师具有问题意识,具 备探究的能力,才能较好地指导学生开展研究性学习.现将本学年度课 程实施情况做出几点总结. 一、课程实验进展情况.综合实践活动是一个全新的课程形态,是 本次课程改革的一个突出亮点.通过对《综合实践活动指导纲要》的学习,任课教师对综合实践活动课程有了进一步的认识和了解,我校还制 定课程的实施计划,初步具备综合活动实践课程的实施条件.课程的开展,学校领导也给予充分的重视,组织观看示范课、教师讨论、座谈等 形式,促进了任课教师教育观念的转变,同时鼓励、支持教师去研究综 合实践活动的实施规律,提高开发与实施综合实践活动的能力,为课程 的实施打好基础.在综合实践活动刚开始时,指导教师公布一定数量的 课题,倡导学生对课题自主选择,让学生从日常生活中发现自己感兴趣 的问题作为自己研究的课题.随着学生能力的不断发展,教师放手让学 生自主选择课题.课题在开始时及结束时课题集中,而在活动过程中课 题分散,同时鼓励学生利用双休日和假期开展综合活动. 二、综合实践活动指导教师的情况反馈.综合实践活动是与学科课程有着本质区别的新的课程领域,是我国基础教育体系的结构性突破. 教师们对综合实践活动课程价值认识比较深刻,充分体现了新的课程理念.特别是综合实践活动的开放性、生成性、自主性为教师和学生的发展提供了广阔的空间,从而使教师从“教死书,死教书”的束缚中解脱
出来,表现出了较高的热情.有的任课教师说:“以前教劳动、科技课，学校不重视,家长不认可,学生不爱学.如今综合实践活动则不同了,不仅教的范围光了,而且内容都是密切联系学生的实际,学生普遍感兴趣的课题开展活动,有的课题还是学生自己提出来的,因此学生的兴趣也非常高.”形式多样的教学活动,民主平等的师生关系,进一步拉近师生间的距离.“亲其师,信其道”为教学活动的深入开展,实现课程的整体功能打下了基础.如三月份开展了“街头小食品的调查研究”这个课题后,学校意外地发现,学生购买小食品的人数大大减少了.纵观综合实践活动课的实施情况,尽管在实施过程中存在许多差异和不完善,但我们仍然积极探索综合实践活动课程的有效途径,以推进实验的开展.综合实践活动经验小结
western blot实验经验总结
western blot实验经验总结 1.抗体的选择 对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。在这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。 进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot 实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。 进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对（抗体品种，货号等完全一致），在都能做出来的前提下，原装抗体能重复使用的次数要多出许多。具体原因我已经揣测了好几年，不敢说出来，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖，也会有所不同。揣测归揣测，假如只为了发论文毕业走人，可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。 国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。western blot能做出来的确实不多，而且杂带多，背景不干净。我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化，怎么说呢，应付硕士论文够了。 我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。效价非常不错，夸张的时候1：10000都能做出条带，唯一的麻烦是兔子太骚（骚臭），不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。如果读书非常悠闲，老板又特别想拥有手工作坊的情况下，可以自己伺候折腾兔子来玩玩，刚开始的时候还是蛮有成就感的。只是单凭抗原表达和制备多抗，是不是可以写成论文毕业，估计因校而异了。 2.Western Blot设备 目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad（伯乐），尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶，但通常用不上，由此造成垂直缓冲液的浪费，而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽，容易漏液，塑料夹应该是有疲劳寿命的，估计日子一长，弹性就会改变，所以如果你们实验室刚买了MINI4，赶紧用，遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。 Biorad的一套系统得两万多，西部能玩得起伯乐的还真不多。好在咱中国人聪明，上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样，而且可以通用，不带电泳仪是5千多一套，挺好用的。唯一的不足是塑料寿命不如伯乐，胶架容易断裂。不过仔细算算，三套天能也就是一套伯乐的价格，值了。北京六一的垂直槽
蛋白质印迹法westernblot
蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴
原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色
综合实践活动经验总结材料知识分享
综合实践活动经验总结材料 ————坞墙一中刘西良 综合实践活动是基于学生直接经验、密切联系学生自身生活和社会生活、体现对知识的综合运用的实践性课程。随着课程改革的逐步推进，综合实践活动这一崭新的课程形态正日益深入人心，并显示出它强大的生命活力。几年来，我们以增强学生的探究意识、创新精神和实践能力，培养学生综合运用知识的能力和社会责任感，提高学生的整体素质为目标，切实重视了综合实践课程的开设和探索，取得了一定的成绩。 一、开发课程资源，拓展活动时空。 一是开发环境教育资源。为使学生全面正确地认识环境，自觉自主地保护环境，我们重视了环境教育资源的开发和利用，通过组织观察、进行采访、专题研究、参与管理等形式，让学生感受环境与生活、与社会、与人类的紧密联系，获取环境保护的初步知识，增强环境保护的意识。 二是开发生活教育资源。我们注意挖掘生活教育资源，让学生走进家庭学当家，走上街头管交通，走进商店学营业，走进银行学储蓄，走进车站学服务，走进社区学管理……从而让他们在生活中感受生活，认识生活，学会生活，使他们成为生活的主人。 三是开发文化教育资源。我们还以坚持多年的“诵千古美文，做中华赤子”活动为载体，组织综合实践活动，充实人文内涵，增加文化含量，让学生在丰富多彩的活动中提高人文素养。
二、讲究实施方法，确保活动效果。 综合实践活动受多方面因素制约，开始实施阶段，我们曾碰到诸多矛盾。一是时间的安排问题。二是内容衔接的问题。三是谁来兼课的问题。四是教师指导的问题。有些复杂的活动，老师不作具体指导，学生不知干什么，怎样干。 1、时间确定体现灵活性。根据课程计划，每周仍是一节课。但在具体操作上，根据实际情况，灵活掌握，合理安排，可分散使用，也可合并使用。对部分阅读型、调查型、实验型、采访型的任务，提倡让学生利用双休日去完成。课表上的时间，主要用于实践活动的启动、学生难点的答疑、活动成果的展示。 2、内容选择重视系列性。综合实践活动的空间广阔，内容丰的，为保证效果，我们认真研究教材，寻找学科教材知识之间、能力之间、情感之间的联系点，沟通学科教材与环境教育、生活教育、科技教育、文化教育、品德教育间的联系，挖掘活动主题。在此基础上，围绕主题，认真思考，把握联系，从而围绕一个主题，尽可能地将诸多内容融合其中，围绕主题开展系列活动，使年段之间的综合实践活动内容上互相联系，逐步推进，以形成系列；活动上互相配合，互相促进，以强化效果。 3、活动过程体现操作性。为保证活动的全员参与和全程参与，我们坚持精心设计每一项活动，细化过程，做到目标具体，环节明确，组织严密，前后相连，整体推进。这样，既能解决活动在一起，时间难以保证，空间难以变换的问题，又可促进个体活动与群体活动、课
westernblot详细图解详细版.docx
Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转 移到固相载体（例如硝酸纤维素薄 膜）上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；
SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提
综合实践活动经验小结_模板
综合实践活动经验小结_模板 自综合实践活动课程设置以来,本校开展此学科教学已有一学年整.此门活动课的开设,为教师和学生提供宽广、自由的活动空间以及广阔的活动背景.在一年的教学中,我们摸索到,只有教师具有问题意识,具备探究的能力,才能较好地指导学生开展研究性学习.现将本学年度课程实施情况做出几点总结. 一、课程实验进展情况. 综合实践活动是一个全新的课程形态,是本次课程改革的一个突出亮点.通过对《综合实践活动指导纲要》的学习,任课教师对综合实践活动课程有了进一步的认识和了解,我校还制定课程的实施计划,初步具备综合活动实践课程的实施条件.课程的开展,学校领导也给予充分的重视,组织观看示范课、教师讨论、座谈等形式,促进了任课教师教育观念的转变,同时鼓励、支持教师去研究综合实践活动的实施规律,提高开发与实施综合实践活动的能力,为课程的实施打好基础. 在综合实践活动刚开始时,指导教师公布一定数量的课题(200题),倡导学生对课题自主选择,让学生从日常生活中发现自己感兴趣的问题作为自己研究的课题.随着学生能力的不断发展,教师放手让学生自主选择课题.课题在开始时及结束时课题集中,而在活动过程中课题分散,同时鼓励学生利用双休日和假期开展综合活动. 二、综合实践活动指导教师的情况反馈. 综合实践活动是与学科课程有着本质区别的新的课程领域,是我国基础教育体系的结构性突破.教师们对综合实践活动课程价值认识比较深刻,充分体现了新的课程理念.特别是综合实践活动的开放性、生成性、自主性为教师和学生的发展提供了广阔的空间,从而使教师从“教死书,死教书”的束缚中解脱出来,表现出了较高的热情.有的任课教师说:“以前教劳动、科技课，学校不重视,家长不认可,学生不爱学.如今综合实践活动则不同了,不仅教的范围光了,而且内容都是密切联系学生的实际,学生普遍感兴趣的课题开展活动,有的课题还是学生自己提出来的,因此学生的兴趣也非常高.” 形式多样的教学活动,民主平等的师生关系,进一步拉近师生间的距离.“亲其师,信其道”为教学活动的深入开展,实现课程的整体功能打下了基础.如三月份开展了“街头小食品的调查研究”这个课题后,学校意外地发现,学生购买小食品的人数大大减少了. 纵观综合实践活动课的实施情况,尽管在实施过程中存在许多差异和不完善,但我们仍然积极探索综合实践活动课程的有效途径,以推进实验的开展. 综合实践活动经验小结一文由搜集整理，版权归作者所有,转载请注明出处! 篇一：出差工作总结报告 我于X月15日至x月21日至北京等地参加由清华紫光培训中心举办的《绩效实务管理》，现将此次培训总结如下： 一、培训课程有《如何设计合理的绩效目标》、《绩效工具的有效应用》、《绩效推进中的辅导与沟通》、《战略的执行者》，通过以上课程的学习，了解到： 1、绩效不能单纯叫做绩效考核，而应该称之为绩效管理。绩效管理只能是一种沟通和跟进的管理工具，而非是用于衡量工作好坏、薪资领取多少的手段，而且它是一项全员参与的工程。
【最新】综合实践活动经验小结工作总结
【最新】综合实践活动经验小结工作总结 自综合实践活动课程设置以来,本校开展此学科教学已有一学年整.此门活动课的开设,为教师和学生提供宽广.自由的活动空间以及广阔的活动背景.在一年的教学中,我们摸索到,只有教师具有问题意识,具备探究的能力,才能较好地指导学生开展研究性学习.现将本学年度课程实施情况做出几点总结. 一.课程实验进展情况. 综合实践活动是一个全新的课程形态,是本次课程改革的一个突出亮点.通过对>的学习,任课教师对综合实践活动课程有了进一步的认识和了解,我校还制定课程的实施计划,初步具备综合活动实践课程的实施条件.课程的开展,学校领导也给予充分的重视,组织观看示范课.教师讨论.座谈等形式,促进了任课教师教育观念的转变,同时鼓励.支持教师去研究综合实践活动的实施规律,提高开发与实施综合实践活动的能力,为课程的实施打好基础. 在综合实践活动刚开始时,指导教师公布一定数量的课题(_0题),倡导学生对课题自主选择,让学生从日常生活中发现自己感兴趣的问题作为自己研究的课题.随着学生能力的不断发展,教师放手让学生自主选择课题.课题在开始时及结束时课题集中,而在活动过程中课题分散,同时鼓励学生利用双休日和假期开展综合活动. 二.综合实践活动指导教师的情况反馈. 综合实践活动是与学科课程有着本质区别的新的课程领域,是我国基础教育体系的结构性突破.教师们对综合实践活动课程价值认识比较深刻,充分体现了新的课程理念.特别是综合实践活动的开放性.生成性.自主性为教师和学生的发展提供了广阔的空间,从而使教师从〝教死书,死教书〞的束缚中解脱出来,表现出了较高的热情.有的任课教师说:〝以前教劳动.科技课,学校不重视,家长不认可,学生不爱学.如今综合实践活动则不同了,不仅教的范围光了,而且内容都是密切联系学生的实际,学生普遍感兴趣的课题开展活动,有的课题还是学生自己提出来的,因此学生的兴趣也非常高.〞 形式多样的教学活动,民主平等的师生关系,进一步拉近师生间的距离.〝亲其师,信其道〞为教学活动的深入开展,实现课程的整体功能打下了基础.如三月份开展了〝街头小食品的调查研究〞这个课题后,学校意外地发现,学生购买小食
最详细的WesternBlot过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
WB实验问题
Western Blot问题指南 时间：2011-05-13 08:55 来源：网络作者：admin点击：3679次 根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）； 1.参考书 推荐A.对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies （a laboratory manual ， 根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）； 1. 参考书推荐 A. 对初学者看什么资料比较好？ 解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies （a laboratory manual，wrote by Ed Harlow ，david lane ）两本书不错。 2. 针对样品的常见问题 B. 做线粒体膜UCP蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120 口g,换了个santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单力口PMSF亍吗？ 解答：怀疑是样品问题，可能是：1,样品不能反复冻融；2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。 C. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？ 解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。 D. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？ 解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑 制磷酸化酶的活性。 E我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分 蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了， 有什么办法可以解决？ 解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5—10%甲醇。 F. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的 浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Wester n Blot吗？ 解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6%, Stacking Gel 3.5 %。 G. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。 解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5m m的comb。
“综合实践活动总结”
“综合实践活动总结” 综合实践活动是学生自主进行的综合性学习活动，是基于学生的经验，紧密联系学生自身日子和社会实际，体现对知识的综合应用的实践性课程。我校做为综合实践活动课程改革采取的策略是：边学习、边研究、边实践。前一时期我们在学生评价工作和校本课程方面工作取得了比较好的效果，得到了家长和学生的认可。我校的综合实践教师们在参与中学到了许多新的理念及教学方式。为了把综合实践活动研究深入地开展下去，现总结如下： 一、成立了研究小组，制定研究打算 学校成立了综合实践活动课程研究与实施小组，制定了学习和研究打算，并按打算开展了多次学习与研讨活动，进一步强化了课程理念，明确了课程实施方向、组织形式，尤其是学生的学习活动形式。我校的综合实践活动基于学习者的直接体验，紧密联系儿童、日子、社会，在以学生自主活动为特征的实践操作中体现对知识的综合运用和实践科学结论、发觉新知识的课程形态。其基本理念包蕴着三种教育思想的融合，即综合教育的思想、实践教育的思想、主体教育的思想的有机融合。结合课本内容及学校政教处、少先队大队部的工作，对本学期的综合实践活动内容重新作了调整。 二、开辟研究主题，探讨研究方式 经过前一时期的实践研究，老师们对主题的开辟，研究的方式办法有了更多的认识，学习中更关注学生的喜好、个性、原有知识层面。本学期我们拟以五年级综合实践小组为龙头，带动其他年级的综合实践活动课题研究，研究走到评价时期，目前正在讨论，拟定出一具能突出我校特点、个性化的综合实践学生成长记录册，以便能更好的指导检查学生的实践活动。 在对一、二年级学生的知识、水平、能力、兴趣爱好等方面的事情进行了全面调查的基础上，充分激发学生的兴趣，调动他们的参与积极性，结合学校特色、周边环境特点和依据综合实践活动课程的相关理论，制定了我校综合实践活动课程一、二年级的活动实施方案，经过科任的教师实践与修改，使之趋于科学、合理，更能贴近学生、贴近教师、贴近学校。 三、开发研究渠道，营造研究氛围 我们思考到，综合实践活动课程的实施过程中，学生的一些实践活动，需要得到社会、家长的支持与合作。为此，我们经过多种途径，进行了广泛的宣传，使社会及家长也充分认识到：在教育改革的大背景下，为促进学生素养的全面提升，实施综合实践活动课程十分必要和及时，为此，我们营造了课程实施的良好社会氛围。 四、正确把握角色，转变学习方式 在课程的具体实施过程中，我们十分注重教师的角色把握，要求教师首先是与学生一样，是实践活动的参与者，其次才是实践活动的指导者。学生的学习方式必须得以转变，必须是多种学习方式的综合运用，要让别同水平的学生都能有实践活动过程的切躯体验，而且，实践活动的组织形式也应呈多样性，如个人独立探索、小组合作探索、师生共同探索、班级集体探索等。配合全市课改样本校的调研工作，我们工作的重点放在怎么用好我们的成长记录册这一方面上。我校三、四、五年级的综合实践课教师以学生进展性评价为主题，进行深入探讨与研究，指导学生有制造性的使用小学生综合实践评价手册。注意运用自评、他评、集体评、再评等多种评价方式，及时对学生在实践活动过程中的表现（包括知识、水平、能力、成果、情感、态度等）进行恰当的评价，并与学生的实践活动成果一起存入学生的课程材料袋。经过使用手册与未使用手册两种班级的实验对照，我们发觉，手册特别适用于中年级，能有效的指导学生开展活动。对高年级同学用评价手册已显示别出太大的激励作用，对高年级同学的活动评价是否能够思考运用现代信息技术电脑进行，使之更趋向于现代化、个性化，在这方面还有待研究。 五、实施过程中的考虑： 1．综合实践活动主题的挑选过程中，假如彻底由学生依照自己的兴趣爱好而独立自主