昆虫杆状病毒基因转移与表达系统在海洋动物中的应用进展
Advances in Marine Sciences 海洋科学前沿, 2020, 7(2), 31-36
Published Online June 2020 in Hans. https://www.360docs.net/doc/eb9729563.html,/journal/ams
https://https://www.360docs.net/doc/eb9729563.html,/10.12677/ams.2020.72005
Advances in the Application of Insect
Baculovirus-Mediated Gene Transfer and
Expression System in Marine Animals
Mengxi Wu1, Huarong Guo2*
1Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding, Ministry of Education, and College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao Shandong
2Institute of Evolution and Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao Shandong
Received: Apr. 19th, 2020; accepted: May 8th, 2020; published: May 15th, 2020
Abstract
Baculovirus-mediated gene transfer and expression system was designed to effectively deliver the foreign genes into the target cells by the translocation of Tn7 transposon, the packaging of insect cells and infection of the recombinant baculovirus, with the merits of biological safety, high ex-pression level and post-translational modification of the recombinant proteins. Thus, the baculo-virus-mediated gene transfer and expression system has been widely used in the mammalians, birds, insects and freshwater fishes, but rarely in the marine animals. This review has summarized and prospected the applications of the above-mentioned gene transfer and expression technology in the marine vertebrates and invertebrates.
Keywords
Baculovirus-Mediated Gene Transfer and Expression System, Marine Vertebrates,
Marine Invertebrates
昆虫杆状病毒基因转移与表达系统在海洋动物中的应用进展
毋梦茜1，郭华荣2*
1中国海洋大学，海洋生命学院，海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东青岛
2中国海洋大学，海洋生物多样性与进化研究所，山东青岛
*通讯作者。
毋梦茜，郭华荣
收稿日期：2020年4月19日；录用日期：2020年5月8日；发布日期：2020年5月15日
摘 要
昆虫杆状病毒介导的基因转移与表达系统是基于Tn7转座酶的转座原理而设计的一种基因转移与表达技术，因其安全性能好、重组蛋白表达量高和表达产物可进行翻译后加工等优点，目前已在哺乳动物、鸟类、昆虫与淡水鱼类等动物中得到广泛应用，但是其在海洋动物中的应用还不多。本文对昆虫杆状病毒介导的基因转移与表达技术在海洋脊椎和无脊椎动物中的应用进行了综述与展望。
关键词
昆虫杆状病毒基因转移与表达系统，海洋脊椎动物，海洋无脊椎动物
Copyright ? 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). https://www.360docs.net/doc/eb9729563.html,/licenses/by/4.0/
1. 引言
昆虫杆状病毒(Baculovirus)又称为多角体病毒，是一种节肢动物病毒，主要宿主为鳞翅目、双翅目和膜翅目昆虫。感染杆状病毒的昆虫出现厌食与不喜运动的特点，虫体组织于染毒4~5天完全溶解，表皮完整且易破裂，染毒1~2周内虫体死亡，该病毒不能在哺乳动物体内进行感染和复制。昆虫杆状病毒的生活周期中出现两种不同形态的病毒粒子，即芽生型病毒粒子(Budded virion, BV)和包埋型病毒粒子(Occlusion-derived virion, ODV)，这两类病毒体具有相同的核衣壳结构与遗传信息[1] [2] [3]。在昆虫细胞内感染的病毒粒子为芽生型病毒粒子，而在昆虫细胞与细胞之间进行传播的病毒粒子为包埋型病毒粒子。昆虫杆状病毒是一种双链环状DNA 病毒，其基因组较为庞大(80~160 kb)，能够编码产生150多种蛋白[4]
[5] [6]。1983年，Smith 等将人β-干扰素基因(β-Interferon, β-IFN)克隆至重组杆状病毒的多角体蛋白基因PH (polyhedron)的启动子下游，在体外培养的昆虫细胞内成功表达了重组蛋白β-IFN ，标志着昆虫杆状病毒表达载体系统的诞生[7] [8]。1993年，Kitts 等在昆虫杆状病毒的非必须基因ORF603与必须基因ORF1929之间各引入了一个杆状病毒基因组中不存在的Bsu36 I 位点，获得了重组杆状病毒BacPAK6，推动了重组杆状病毒技术的发展[9]。同年，随着细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome, BAC)技术的发展，Luckow 等(1993)根据F 因子载体的构建原理，将F 因子复制子、细菌Tn7转座位点attTn7、卡那霉素抗性基因引入昆虫杆状病毒载体质粒中，构建了杆状病毒穿梭质粒Bacmid ，从而发明了Bac-to-Bac 重组杆状病毒基因转移与表达系统，大大简化了重组杆状病毒的构建过程[10] [11]。
目前，商品化的昆虫杆状病毒表达系统已陆续发展起来，其中以Invitrogen 公司的Bac-to-Bac 表达系统与BD 公司的BaculoGold 表达系统的应用最为广泛。商业化的昆虫杆状病毒也已成功应用于肿瘤治疗、疫苗研究与农业病害防控等方面。王浩等(2011)比较了甲型H1N1病毒血凝素蛋白(HA)在上述两种昆虫杆状病毒表达系统中的表达效率，发现Invitrogen 公司的Bac-to-Bac 表达系统的表达效率更高[12]。本文对昆虫杆状病毒介导的基因转移技术在海洋动物中的应用进展进行了综述，并对其研究前景进行了展望。
Open Access
毋梦茜，郭华荣2. 昆虫杆状病毒介导的基因转移与表达系统简介
昆虫杆状病毒基因转移与表达系统由昆虫杆状病毒供体质粒pFastBac1、大肠杆菌感受态细胞DH10Bac和昆虫包装细胞三部分组成。其中，供体质粒又称转移质粒，用于引入外源基因，含有Tn7转座子的左右两个识别元件：Tn7R和Tn7L，这两个识别元件之间构建有庆大霉素基因(Gentamicin)、苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV) 多角体蛋白基因启动子PH或P10及其之后的多克隆酶切位点(MCS)。外源基因首先被克隆到供体质粒的MCS，然后携带外源基因的供体质粒被转化到大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中。在感受态细胞DH10Bac中，已转化有杆状病毒Bacmid质粒和编码转座酶的Helper质粒，因而在Helper质粒所编码的转座酶的作用下，供体质粒pFastBac1上的两个识别元件之间的序列被转座到Bacmid质粒上的识别位点attTn7。Bacmid质粒中含有miniF复制子和attTn7识别位点，其中，miniF复制子的作用是驱动Bacmid质粒在大肠杆菌中复制，而attTn7识别位点则位于Bacmid质粒中的LacZ基因内部。pFastBac1上的两个识别元件之间的序列的插入，会破坏LacZ (β-半乳糖苷酶)基因的表达，因而可通过蓝白斑筛选的方法，筛选出含有Bacmid 重组质粒的菌株，从而实现在大肠杆菌细胞中构建并扩增Bacmid重组质粒的目的。之后，利用脂质体转染技术，将Bacmid重组质粒的DNA转染到昆虫包装细胞中，进行病毒的包装、纯化和浓缩以及病毒滴度的测定。将包装病毒感染靶细胞，则外源基因即可在多角体蛋白启动子PH或P10的驱动下，在宿主细胞中过表达。其中，应用最广泛的包装细胞系为Sf21及其衍生细胞系Sf9，来源于草地贪夜蛾的卵巢细胞。Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统所采用的包装细胞就是Sf21或Sf9细胞系。Wickham等(1992)报道，粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni)的胚胎细胞系BTI-TN-5B1-4也能够用于包装重组昆虫杆状病毒，并生产出大量的外源蛋白[13][14][15]。目前，重组昆虫杆状病毒表达系统已成功应用于人、鱼、果蝇、蜜蜂、鸡和鱼等的基因转移研究，被誉为最有希望的基因转移技术[16]-[23]。
3. 昆虫杆状病毒基因转移与表达系统在海洋脊椎动物中的研究进展
昆虫杆状病毒基因转移与表达系统在淡水脊椎动物如斑马鱼、罗非鱼和鲤鱼等鱼类中的应用较为广泛[16][24][25][26][27]，而在海洋脊椎动物的研究较少。Leisy等(2003)构建了细胞肥大病毒(CMV)增强子和鸡肌动蛋白启动子驱动的lacZ报告基因的重组昆虫杆状病毒，并成功在鲑鱼心脏成纤维细胞系(CHH-1)中检测到LacZ报告基因的表达[17]。Satone等(2013)构建了牙鲆三丁基锡结合蛋白基因(TBT-bps)的重组杆状病毒，并在家蚕中成功表达了重组蛋白rTBT-bp2，并分析了其结合三丁基锡的能力[28]。Liu 等(2013)利用家蚕杆状病毒表达系统成功表达了条纹斑竹鲨的鲨肝活性肽(APSL)并应用于小鼠中，发现其能够显著降低链脲佐菌素诱导的2型糖尿病模型小鼠的血糖水平，并阐明了APSL作为口服药物在糖尿病治疗中的作用(P < 0.05) [29]。Hwang等(2004)克隆病构建了牙鲆穿孔素基因(perforin)的重组杆状病毒质粒，并通过脂质体转染的方法在昆虫细胞中成功表达、纯化和浓缩得到了牙鲆穿孔素蛋白，并对其氨基酸序列及重组蛋白的活性进行分析，为进一步了解鱼类穿孔素蛋白裂解血细胞的机制奠定了基础[30]。
4. 昆虫杆状病毒基因转移与表达系统在海洋无脊椎动物中的研究进展
与昆虫相比，昆虫杆状病毒介导的基因转移与表达系统在海洋无脊椎动物中的应用则很少，仅限于对虾、海兔与桡足类动物。在体外培养对虾细胞的应用中，Puthuman等(2015) 构建了12型腺病毒早期区域基因1A (12SE1A)的重组杆状病毒BacP2-12SE1A-GFP，并将其感染斑节对虾(Penaeus monodon)的原代培养血淋巴细胞，在感染14天后的血淋巴细胞中检测到癌基因12SE1A的表达，但没有成功诱导对虾血淋巴细胞的永生性转化[31]。在对虾活体的应用中，Musthaq等(2009)构建了对虾白斑综合征病毒(WSSV)早期基因1 (Ie1)启动子驱动的VP28囊膜蛋白基因昆虫杆状病毒，采用肌肉注射的方式感染对虾成体，
毋梦茜，郭华荣
成功在对虾组织中表达了VP28囊膜蛋白，提高了染毒对虾对WSSV病毒的抗性[32]。Puthumana等(2015)对Bac-to-Bac重组杆状病毒表达系统进行了改造，以绿色荧光蛋白GFP为报告基因，分别将对虾WSSV 病毒的Ie1启动子和对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的P2启动子插入至杆状病毒供体质粒的昆虫多角体蛋白基因启动子(PH)的下游，构建了PH-Ie1与PH-P2两种双启动子杆状病毒系统，并应用于斑节对虾成体的研究中。结果表明，未经改造的仅含有PH启动子的重组杆状病毒不能有效感染斑节对虾成体组织，且对虾成体各组织中均未检测到GFP荧光信号，而改造后的重组杆状病毒能够感染对虾成体，但表达效率仅有20% [33]。随后，Shi等(2016)将昆虫杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac1中的多角体蛋白基因启动子(PH)切除，以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的β-actin启动子：SbaP (ENX)替换PH启动子，以红色荧光蛋白基因RFP为报告基因，制备了SbaP (ENX)启动子驱动的RFP基因重组杆状病毒：Bacmid-SbaP (ENX)-RFP，在添加丁酸钠的条件下，以肌肉注射的方式感染凡纳滨对虾成体，在染毒2天的对虾多个组织中包括鳃、附肢、肝胰腺、血淋巴和肌肉组织可以检测到杆状病毒DNA，但是RFP报告基因的mRNA表达仅在肌肉和肝胰腺中能够检测到，而且存在着时空上的组织特异性。其中，在肌肉组织中，染毒后1~7天都能检测到RFP的转录表达，但是肝胰腺中的表达仅能在前3天中检测到
[34]。Citarasu等(2019)构建了罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)野田村病毒(MrNV)衣壳蛋白基因的重
组杆状病毒，在昆虫细胞内表达并纯化得到了重组MrNV衣壳蛋白，并分析了其在罗氏沼虾中的抗病毒作用。结果表明，口服90 ± 10 mg MrNV衣壳蛋白的罗氏沼虾幼虾在感染MrNV病毒后第30天和60天分别具有65%和80%的存活率，而未口服MrNV衣壳蛋白的罗氏沼虾在染毒后的死亡率为100%，说明杆状病毒表达的MrNV衣壳蛋白可显著提高对罗氏沼虾幼虾抵抗MrNV病毒感染的能力[35]。
昆虫杆状病毒基因转移与表达系统应用于其他海洋无脊椎动物的研究报道很少，仅停留在利用上述表达系统在昆虫细胞中异源表达海洋无脊椎动物来源基因的水平上。Lin等(2014)利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，在昆虫Sf9细胞中成功表达了海兔乙酰胆碱结合蛋白(Ac-AChBP)，并分析了AChBP蛋白的结构与功能[36]。Larionova等(2018)利用昆虫杆状病毒表达系统，在昆虫细胞内表达了海洋桡足类动物分泌的高斯荧光素酶(Gaussia Luciferase, GpLuc)，并分析了高斯荧光素酶的生物发光特性和结构特征[37]。
5. 前景与展望
昆虫杆状病毒基因转移与表达系统具有容纳大片段、表达量高、筛选阳性克隆耗时短的优点，是理想的基因转移与表达系统。但是，昆虫杆状病毒基因转移与表达系统在海洋动物成体及其体外培养细胞中的表达效率仍然很低，这可能与该表达系统所用的启动子等元件均来源于昆虫，不适用于海洋动物有关，也可能与体外培养的对虾细胞不分裂有关。因此，通过添加海洋无脊椎动物如对虾的启动子与转录元件，对昆虫杆状病毒基因转移与表达系统进行改造的尝试，可以明显提高上述昆虫杆状病毒介导的基因转移与表达系统在对虾中的感染与表达效率[33][34]。但是，在上述对昆虫杆状病毒基因转移与表达系统的改造研究中，对虾和对虾病毒来源地启动子成分的引入，一定程度上影响了外源基因在昆虫包装细胞中的表达。我们实验室最近通过引入对虾病毒囊膜蛋白，显著提高了上述昆虫杆状病毒表达系统对对虾细胞的亲嗜性，从而提高了其在对虾成体组织中的感染效率，为促进昆虫杆状病毒基因转移与表达系统在海洋动物中的广泛应用奠定了基础。当然，由于对虾病毒的研究基础最好，所以可以预期的是，未来将最新构建对虾病毒介导的基因转移与表达系统，从而最终在对虾活体及其体外培养细胞中实现基因的高效转移与表达。
基金项目
国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”专项(2018YFD0901301)，中央高校基本科研业务费项目(201822018)。
毋梦茜，郭华荣
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节肢动物分类
实验六蜚蠊解剖及节肢动物分类 一.目的 通过对蜚蠊的观察，了解节肢动物门昆虫纲的基本形态、生理及其对陆生生活的适应。进一步通过对昆虫各种类型的触角、口器、翅、足、及变态的观察更深了解昆虫纲的多样性与适应的广泛性，并识别重要目的一些代表。了解节肢动物的分类。 二.材料与用具 活体蜚蠊，各种代表昆虫的口器、翅、足、触角和变态的制片。体视镜、解剖镜、解剖器、蜡盘、大头针。有关节肢动物标本。 三. 观察 （一）美洲大蠊（Periplaneta americana）的解剖： 首先将乙醚滴在脱脂棉上，然后将脱脂棉放进装有活体美洲大蠊的广口瓶内，待蜚蠊被麻醉，不能爬行后，进行活体观察和解剖。 1. 外形（图6-1）： 观察蜡盘中的蜚蠊。身体已明显具有体区的分化，可分为头、胸、腹三部分，头部体节愈合，胸部三节，腹部分节明显，整个身体覆以几丁质外骨骼。 图6-1 雄性蜚蠊外形及内部结构图 （1）头部：是蜚蠊取食与感觉的中心，头部以活动的颈部与胸部相连，头部向前伸出一对鞭状的触角，由基节（柄节），梗节，与多节的鞭节组成，是感觉器官。头前端两侧有一对椭圆形复眼，是由许多小眼组成。头部外骨骼坚硬，复眼之间为额，额上端为颅顶，头的两侧复眼下方为颊。蜚蠊的口器属于咀嚼型。这种口器由上唇、
下唇、上顎、下顎及舌五部分组成（图6-2）。用镊子轻轻将口器各部分取下，依次放蜡盘中观察。 图6-2 咀嚼式口器（以蝗虫口器为例） （2）胸部：头后有足和翅的部分是胸部。胸部分三节，即前胸、中胸、后胸。每一胸节上有一对足，中胸与后胸各有一对翅。在胸部侧面，前胸与中胸之间有一对气孔（spiracle）。中胸与后胸之间也有一对气孔，明显可见。 （3）足：蜚蠊的前足、中足和后足均为步行足。这三对足在构造上是相似的。每一足都是由五部分组成，第一节与躯体相连，称为基节（coxa），其次为转节（trochanter），腿节（femur），胫节（tibia），及跗节（tarsus）。蜚蠊跗节又分为5节。 （4）翅：在中胸背面伸出一对革质前翅，有保护后胸膜质后翅的功用。揭开前翅即可看到折叠于其下的后翅，后翅较薄，纵行折叠，展开后很宽大，是飞翔的主要器官。 （5）腹部：腹部是生殖与消化代谢的中心。腹部分节清楚，共有11节，但第9节后的体节不易分清楚。试以一手拿住头部，另一手拿住尾端，轻轻拉动蜚蠊身体，便可看出腹节之间有节间膜可使腹部拉长或缩短。每一体节包括一个背板，一个腹板，侧区为膜状。腹部从第一节到第八节共有八对气孔，为气管的开口。尾部侧面有一对尾须，是第11腹节的退化附肢。 2. 内部构造（图6-3）： 将蜚蠊足和翅剪去，背部朝上放在蜡盘上（此时可透过体壁看到背血管）。用解剖剪从尾端稍前位置沿侧膜向前至头部纵行剪开体壁，用大头针固定住腹板，轻轻掀去背板，露出整个体腔（混合体腔即血腔，haemocoele），加入少量水以免干燥，由于蜚蠊体内有较多的脂肪体，在解剖镜下用镊子小心去除脂肪体，并用清水轻轻冲洗，
杆状病毒表达系统简介
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。 1、杆状病毒的生物学特性 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用： ①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。 ②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。 昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。 近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae 的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。 杆状病毒基因组的结构和功能研究 杆状病毒基因组为双链环状 DNA分子。DNA以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白和髓核(COle)。其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。 目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角
昆虫杆状病毒诱导宿主行为变化及其分子机制
Science of Sericulture 蚕业科学 收稿日期：2013－06－14接受日期：2013－06－30资助项目：国家自然科学基金项目（No．31272506）。第一作者信息：王国宝（1987－），男，博士研究生。 E-mail ：gbwang0216@163．com 通信作者信息：吴小锋，教授，博士生导师。 E-mail ：wuxiaofeng@zju．edu．cn * Corresponding author．E-mail ：wuxiaofeng@zju．edu．cn 2013，39（5）：1005－1010 ISSN 0257－4799；CN 32－1115/S E-mail ：CYKE@chinajournal．net．cn 昆虫杆状病毒诱导宿主行为变化及其分子机制 王国宝吴小锋 （浙江大学动物科学学院，杭州310058） 摘要最近的研究发现杆状病毒感染能够诱导宿主昆虫产生行为变化，典型的表现为寄主运动能力的增强。从生物学的 角度分析，这是杆状病毒有利于自身传播的操控策略。本文综述了3种典型杆状病毒诱导宿主昆虫行为发生变化的现象以及其可能的分子机制。其中，舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV ）的egt 基因能够引起吉普赛舞毒蛾（Lymantria dispar ）出现异常活跃的攀爬行为；而家蚕（Bombyx mori ）与甜菜夜蛾（Spodoptera exigua ）幼虫分别被家蚕核型多角体病毒（BmNPV ）和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV ）感染后，出现爬行异常活跃的行为则是由于病毒中ptp 基因的存在。不同种类的杆状病毒对宿主昆虫行为的操控策略不同，对杆状病毒操控宿主行为的分子机制的探索是一个新的研究领域，其研究成果不仅有助于揭示杆状病毒与寄主的互作关系，而且将为农林病虫害的生物防治提供新的参考策略。关键词 杆状病毒；egt 基因；ptp 基因；昆虫宿主；行为 中图分类号 S884．5+1 文献标识码 A 文章编号0257－4799（2013）05－1005－06 Host Behavior Alteration and Its Underlying Molecular Mechanism upon Infection of Insect Baculovirus WANG Guo-Bao WU Xiao-Feng * （College of Animal Sciences ，Zhejiang University ，Hangzhou 310058，China ）Abstract Recent studies discovered that baculovirus infection could induce behavior alteration on their host insects．A typ- ical consequence of it is the enhanced locomotor activity．In view of biology ，it is a manipulatory strategy of baculovirus that favors its own transmission．This paper describes behavior alterations in host insect caused by three types of baculov-irus and possible molecular mechanisms underlying the alterations．Among them ，the egt gene of LdMNPV is essential for the hyperactive climbing behavior of Lymantria dispar ，while the ptp gene of BmNPV and AcMNPV is the cause of abnor-mal wandering behavior of Bombyx mori and Spodoptera exigua lavrae．Different types of baculovirus have various mecha-nisms in manipulating host insect behavior．Studies on the underlying molecular mechanisms of such behavior manipula-tions constitute a new and fascinating research field．It will not only uncover the interactive relationship between baculovirus and their host insects but also provide new strategy for biological control of agricultural and forestry pests /diseases．Key words Baculovirus ；egt gene ；ptp gene ；Insect host ；Behavior 杆状病毒是一个庞大的病毒家族，其基因组大 小在80 180kb 之间，为共价闭合环状双链DNA ，包含100多个基因。有趣的是，其中超过10%的基因是从原始宿主中通过水平转移获得的，这些基因 被利用后更加有利于病毒的复制和传播［1］ 。已发现的几百种昆虫杆状病毒分为杆状病毒属（NPV ）和颗粒体病毒属（GV ）2个属。杆状病毒在感染循环过程中会产生遗传物质完全一致但表型具有差
除昆虫外节肢动物分类表
除昆虫纲外节肢动物分类表 肢口纲 1.剑尾目Xiphosura 鲎科Limulidae 蛛形纲 1.蝎目Scorpiones 拟湿地蝎科Pseudochactidae 钳蝎科Buthidae 小迷蝎科Microcharmidae 豕蝎科Chaerilidae 湿地蝎科Chactidae 真蝎科Euscorpiidae 超蝎科Superstitioniidae 狱神蝎科Vaejovidae 巨蝎科Iuridae 毛蝎科Caraboctonidae 腺尾蝎科Bothriuridae 蝎科Scorpionidae 半蝎科Hemiscorpiidae 2.伪蝎目Pseudoscorpiones 冥拟蝎科Chthoniidae 雷赤拟蝎科Lechytiidae 毛伪蝎科Tridenchthoniidae 纹拟蝎科Feaellidae 拟加拟蝎科Pseudogarypidae 博赤拟蝎科Bochicidae 吉姆拟蝎科Gymnobisiidae 牙拟蝎科Hyidae 中美拟蝎科Ideoroncidae 尼奥拟蝎科Neobisiidae 帕拉拟蝎科Parahyidae 西亚拟蝎科Syarinidae 艾顿拟蝎科Atemnidae 车利拟蝎科Cheliferidae 车恩拟蝎科Chernetidae 维西拟蝎科Withiidae 斯特拟蝎科Sternophoridae 柴利拟蝎科Cheiridiidae 加利拟蝎科Garypidae 拟加利拟蝎科Garypinidae 吉奥拟蝎科Geogarypidae 拉次拟蝎科Larcidae 拟次拟蝎科Pseudochiridiidae 梅西拟蝎科Menthidae 长尾拟蝎科Olpiidae 3.盲蛛目Opiliones 丝提盲蛛科Stylocellidae 尼奥盲蛛科Neogoveidae 培塔盲蛛科Pettalidae 丝尔盲蛛科Sironidae 特古盲蛛科Troglosironidae 卡迪盲蛛科Caddidae 莫诺盲蛛科Monoscutidae 尼皮盲蛛科Neopilionidae 斯科勒盲蛛科Sclerosomatidae 发朗盲蛛科Phalangiidae 色拉盲蛛科Ceratolasmatidae 艾思奇盲蛛科Ischyropsalididae 沙巴盲蛛科Sabaconidae 迪克朗盲蛛科Dicranolasmatidae 尼曼盲蛛科Nemastomatidae 尼坡盲蛛科Nipponopsalididae 特格鲁盲蛛科Trogulidae 可拉顿盲蛛科Cladonychiidae 皮坦盲蛛科Pentanychidae 他五盲蛛科Travuniidae 奇亚盲蛛科Triaenonychidae 西音盲蛛科Synthetonychiidae 比安盲蛛科Biantidae 伊斯盲蛛科Escadabiidae 奇缪盲蛛科Kimulidae 坡得盲蛛科Podoctidae 萨摩盲蛛科Samoidae 斯蒂格恩盲蛛科Stygnommatidae 伊皮盲蛛科Epedanidae 阿格盲蛛科Agoristenidae 阿萨姆盲蛛科Assamiidae 饰容盲蛛科Cosmetidae 科拉纳盲蛛科Cranaidae 瘦腿盲蛛科Gonyleptidae 曼拉盲蛛科Manaosbiidae 丝提格盲蛛科Stygnidae 思蒂格诺盲蛛科Stygnopsidae 盎科盲蛛科Oncopodidae 长奇盲蛛科Phalangodidae 菲斯盲蛛科Fissiphalliidae 加什盲蛛科Guasiniidae
节肢动物
外部形状编辑 1、一般均为两侧对称，身体是异律分节，即身体的若干体节分别组成不同的部分，如分头、胸、腹3部,或节肢动物门。 头部与胸部愈合为头胸部，或胸部与腹部愈合为躯干部,也有头、胸、腹3部分整个愈合在一起的。 2、体节可能消失，各部机能不同。如头部司感觉和摄食，胸部司运动，腹部司代谢等。 3、除身体分节外，附肢也分节，附肢有双枝型和单枝型两类，各部分的附肢在结构和功能上有分化，分别用于摄食、御敌、行走和游泳。 4、水栖种类的头部附肢甚至躯干部的附肢有能从水中滤取食物的功能。附肢也能起攻击、防卫或辅助交配的作用，有的可通过附肢表面交换空气。有的附肢分化为很特异的结构，如蝎的栉状板和蜘蛛的纺器。有的附肢已经退化或消失。 2结构特点编辑 1、外骨骼和肌肉：节肢动物的重要特征是体外覆盖着几丁质的外骨骼，又称表皮或角质层。外骨骼分成不 节肢动物门 同的骨片,在相邻体节之间的关节膜上，角质层非常薄,易于屈折活动。 2、每体节的角质层基本上分成4块：1块背板、1 块腹板和两块侧板。通常由于次生性的合并或分割而有不同的变化。附肢的管状外骨骼在各分节之间也有关节膜相连，关节也可活动。多数节肢动物体节间的关节膜折叠在前一个体节外骨骼后缘的下方。某些节肢动物有脊椎动物球窝式的关节。外骨骼有时向体内突出形成内突，作为肌肉的附着点；或内部组织骨化成游离的骨片，供体内肌肉附着，外骨骼由其下方的一层上皮细胞（称上皮或下皮）所分泌。
3、外骨骼可分3层：自内向外依次为:内表皮、外表皮和上表皮。内表皮紧接上皮,是外骨骼中最厚的一层，主要成分是蛋白质和几丁质的复合体，无色而柔软，具有延伸性和曲折性。 4、外表皮位于内表皮的外侧较薄，在主要成分蛋白质和多糖几丁质中沉淀有钙盐，或富含骨蛋白，是外骨骼中最坚硬的部分，一般在节间膜和其他膜质区，由于此层不发达，因而显得柔韧。上表皮位于最外层,薄,通常含有蜡质。 5、有的节肢动物外骨骼薄且无含蜡的上表皮，使水和空气可以透入。角质层一般有纤细的孔道，使角质层下方的腺体的分泌物可以通出。角质层不完全局限于体的外表面。胚胎时期外胚层内陷部分的上皮亦能分泌角质层，因而象前肠、后肠、气管、书肺以至生殖器的一部分，内面衬有角质层，蜕皮时也要脱去。上皮层向内分泌形成基膜，基膜是一层无定形的颗粒层。肌肉呈束状，由肌纤维组成，两端无肌腱，着生在外骨骼的内壁或内部突起上。 6、无生命的角质层不能象脊椎动物骨骼那样生长，所以在生长过程中要定期蜕皮。蜕皮前，上皮与外骨骼分离，分泌形成一层新的上表皮。上皮再分泌几丁质酶和蛋白酶，通过新的上表皮把旧皮中的内表皮腐蚀掉。接着上皮层再分泌新的外表皮和内表皮。此时动物体外包着新旧两层皮。旧皮沿着预定的某些线裂开，身体蜕出，前后两次蜕皮之间的阶段叫做龄期。甲壳动物一生中连续蜕皮多次，性成熟交配繁殖后还能再次蜕皮。 3形态特征编辑 身体分部 节肢动物身体两侧对称。由一列体节构成，异律分节，可分为头、胸、腹三部分，或头部与胸部愈合 节肢动物门 为头胸部，或胸部与腹部愈合为躯干部。例如：昆虫纲（蝗虫）动物身体分头、胸、腹三部分；甲壳纲（虾）动物身体分头胸、腹二部分；蛛形纲（蜘蛛）动物身体分头胸部、腹部；多足纲（蜈蚣）动物身体分头部、躯干部。身体的分部在生理机能上也出现了分工：头部：感觉和取食中心；胸部：运动和支持中心；腹部：营养和繁殖中心。 附肢分节 节肢动物每一体节上有一对分节的附肢。附肢有双枝型和单枝型两类。节肢动物的附肢也按节排列，与环节动物的附肢疣足相比，有了重大进步，疣足与节肢的比较见下表： 疣足节肢 按节分布，数量多体部分布数量少 形态划一形态多样 与身体之间无关节附肢不分节身体之间有关节附肢分节 无肌肉附着有大量肌肉附着 具有发达的横纹肌 节肢动物的肌肉与体壁之间不形成连续的肌肉层，而是发展为分离的肌肉束。在节肢动物以前的动物肌肉都是平滑肌，从节肢动物开始形成横纹肌，获得高度发达的运动机能。 外骨骼 体壁含有几丁质是节肢动物的重要特征之一。节肢动物的体壁具有一定的硬度，起着相当于
杆状病毒——昆虫细胞表达系统
实验材料： 1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。 2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。 实验步骤： 一、昆虫细胞转染： 1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。 2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物： a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。 b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。 c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。 3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。 4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。 5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。 二、病毒贮液的制备： 1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。 2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量： 感染所需病毒贮液量(ml)= [MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)] 注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。 4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下： a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。 b. 每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。 c. 根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 d. 制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。 三、病毒贮液初步鉴定 1. SDS-PAGE蛋白电泳：取P2或P3病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行SDS-PAGE 蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。 2. western blot：以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。 3. 以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。方法详见CAT-ELISA 试剂和说明书。 结果 1. CAT-ELISA检测试剂盒成功检测出对照CAT质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细
杆状病毒表达系统(The Baculovirus Expression System)
Baculovirus Facility in Cambridge The Baculovirus Expression System The Baculovirus Expression Vector System (BEVS) has been widely used in research and scientific industrial communities for the production of high levels (up to 1000mg/mL) of properly post-translationally modified (folding, disulfide bond formation, oligomerization, glycosylation, acylation, proteolytic cleavage), biologically active and functional recombinant proteins. The Baculovirus Expression Vector System is based on the introduction of a foreign gene into nonessential for viral replication genome regio n via of homologous recombination with a transfer vector containing target gene. The resulting recombinant Baculovirus lacks one of nonessential gene (polh, v-cath, chiA etc.) replaced with foreign gene encoding heterologous protein which can be expressed in cultured insect cells and insect larvae. Baculovirus Facility in Cambridge offers services on protein expression and production - from recombinant baculovirus production to large scale protein expression. Several features make the Baculovirus Expression Vector System attractive for researchers: - High levels of heterologous gene expression are often achieved compared to other eukaryotic expression systems, particularly for intracellular proteins. In many cases, the recombinant proteins are soluble, post-translationally modified and easily recovered from infected cells late in infection when host protein synthesis is diminished. -The cell lines used for AcMNPV propagation grow well in suspension cultures, permitting the production of recombinant proteins in large-scale bioreactors. - Expression of hetero-oligomeric protein complexes can be achieved by simultaneously infecting cells with two or more viruses or by infecting cells with recombinant viruses containing two or more expression cassettes. - Baculoviruses have a restricted host range, limited to specific invertebrate species. They are safer to work with than most mammalian viruses since they are noninfectious to vertebrates.
杆状病毒介绍
杆状病毒 关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒 杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA 分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA 插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式： 一种为包含体病毒(occluded virus，OV)， 另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。 它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。
节肢动物
节肢动物 狼蛛 节肢动物（Millipede） arthropod 动物界中最大的类别，节肢动物门(Arthropoda)的动物统称，包括一百多万种无脊椎动物，几乎占全部动物种数的84％。成员多样。两侧对称的无脊椎动物，体外覆盖著部分由几丁质组成的表皮，能定期脱落，表皮是保护装置，起外骨骼的作用，为肌肉提供附著面。肌序复杂，有的特化以操纵飞行和发声。附肢的外骨骼具关节，因而称节肢动物。有许多特殊的感觉器；体腔退化而代之以血腔；神经系由背面的脑和一对腹神经索组成。已记述879,000种以上，其中约86％是昆虫。据估计，总数有1,000万种以上。分成四个亚门︰ 1. 三叶虫亚门(Trilobita)：三叶虫类(Trilobites)，在约5.7亿年前的古生代早期的海洋中占优势，在 2.8亿年前的二叠纪灭绝；体卵圆形，背腹扁平，分头、胸和尾节三部分；纵分为三叶。长 3.5～75公分。 2. 单肢亚门(Uniramia)：头部有触角、大腭和小腭。胸部附肢单肢或双肢。腹部有的与胸部不分，具附肢；或与胸部分开，附肢有或无。(1)烛纲(Pauropoda)：极小的多足类。两对附肢变为口器，8～11对步足。触角4节(极少6节)，末端分枝，并有多节的长鞭。体长最多为1.9公釐。(2)倍足纲(Diplopoda)：体窄长的多足类，腹部各节由两节合成，每节有两对足和气孔。头有大腭；小腭愈合成腭唇；有时有单眼；触角短，锤形；胸部是4个单节，生殖孔在第3节。体长0.3～28公分。(3)唇足纲(Chilopoda)：体窄长的多足类，有许多明显的腹节，各有一对足，第一腹节的附肢变为毒腭；生殖孔在末节。体长约0.5～26.5公分。(4)综合纲(Symphyla)：小型多足类，有3对口器，12对步足和一对後纺器，生殖孔在第4躯干节。体长最多为8公釐。(5)弹尾纲(Collembola)：昆虫状小节肢动物，分布广。口器外腭式；触角通常4节；眼简单；3个胸节有足；腹部6节，有分叉的弹器；通常无气管；无马氏管(malpighian tubule)。体长最多5公釐。(6)昆虫纲(Insecta)：三对附肢形成口器；头由6节组成，有一对触角，常有侧眼和中眼；胸部3节，各有一对足，在第2、3节有的具翅；腹部由11节组成，成虫无附肢；生殖孔在後。体长0.25公釐到33公分。 3. 甲壳亚门(Crustacea)：多数性；鳃呼吸；外骨骼坚固；有触角、大腭。 4. 有螯亚门(Chelicerata)：前体部无触角，但有钳状的螯肢和触肢(或称脚须); 胸部有单肢型步足；腹部如有附肢，则高度特化。(1)肢口纲(Merostomata)：大型海产种类，有书鳃(gill book); 前体部完全被背甲覆盖；後体部有一长刺。(2)蛛形纲(Arachnida)：前体部与後体部以一窄的腹柄相连，或两部愈合。前体部有螯肢、触肢和四对步足；後体部通常无附肢。以书
杆状病毒对昆虫有什么危害
杆状病毒对昆虫有什么危害 杆状病毒感染会让昆虫患病，目前发现的有： 1.颗粒病体 根据39蜂疗网调查目前仅见于鳞翅目昆虫。其自然侵染过程与细胞病变均类似于核型多角体病，但病虫症状与核型多角体病不同，病虫皮色变灰或乳黄，虫尸以腹部前端1～2对腹足握持植物枝条，虫尸以“∧”型倒挂。幼虫被感染后至少至4日龄才发病，死于化蛹前，病虫生存期常大于21天。 2.核型多角体病 现已发现280余种核型多角体病，约占昆虫病毒病总数的40％，大多侵染鳞翅目昆虫。 核型多角体病的自然感染过程为：昆虫吞食了被病毒污染的食物，病毒即进入中肠，在昆虫中肠碱性消化液的作用下，多角体被溶解，释放出病毒粒子，游离病毒粒子的囊膜与中肠上皮细胞绒毛的膜融合，核衣壳侵入细胞中，脱壳后，病毒的DNA经细胞核膜的核孔侵入细胞核内，开始其增殖过程。 随病毒的增殖，细胞表现的病理变化为：细胞核内染色质凝集成块，核仁增大，数目增多，RNA合成旺盛，合成出的RNA不断转移到细胞质中；凝集的染色质块集中于细胞核中部形成网状结构的病毒发生基质，在病毒发生基质中病毒的DNA大量合成。随后，在病毒发生基质表面核衣壳开始装配，并不断移到细胞核周围，大部分包入新形成的囊膜内，成为成熟的病毒粒子。最后在病毒发生基质周围形成一个环状带，在带上开始多角体的结晶，病毒粒子随机地包入多角体中，多角体约到一定大小后停止生长，在其表面形成了一层难溶的多角体膜。从多角体开始形成时起，病毒发生基质开始缩小，待多角体充满细胞核后，病毒发生基质消失，核膨大，破裂，细胞随之崩解。 小部分未被包入多角体的病毒粒子，可随细胞崩解进入昆虫血体腔。血体胶中病毒粒子的靶细胞为：气管皮膜细胞，脂肪细胞，肌肉细胞，真皮细胞，血细胞及神经、生殖腺、丝腺等几乎所有组织的细胞。 最后新形成的大量多用体充满了昆虫整个血体腔。 蛀虫幼虫被感染后，4～5天体液是乳白色，厌食，不喜运动，多数移到植物枝条顶部后死亡，虫体软化，脚失去握持力，仅以1～2对臀足附着在植物枝条上，最后松弛倒挂死之。体内组织完全溶解，变成黑褐色，表皮完整但脆弱易破裂。从感染到处亡约1～2周。
实验动物的选择与动物实验的设计说明
实验动物的选择和动物实验的设计 第一节实验动物选择基本原则 一、根据课题研究的目的、内容、水平选用相匹配的标准化动物 一切动物实验都是为科学研究服务的，选择实验动物首要的就是要根据研究的内容来选择实验动物。 蛙的大脑不发达，不可作高级神经活动的实验。但蛙的脊髓具有最简单的发射中枢，做神经反射弧实验，简单、直观、明确、容易分析。 二、必要的预试验有助于选择与本课题相适应的实验动物 动物预试验的作用在于： 1.初步观察动物是否适宜于本项目的研究 2.熟悉动物的生物学特性及饲养管理 3.检查与动物实验配套的实验条件、方法是否初步到位 三、充分利用与人具有某种相似性的实验动物 绝大多数生物学与医学研究的最终目的是要为人类服务的。因此在实际可能的情况下尽量选择那些生物学特征及解剖生理特点等与人类类似的实验动物。 一般来说，实验动物愈高等，进化程度愈高、其机能、代谢、结构愈复杂，反应就愈接近人类。 猴、拂拂、猩猩、长臂猿等灵长目动物是最近似于人类的理想动物。 1.结构功能的相似性 2.时象或年龄状态的相似性 3.群体分布的相似性 在以群体为对象的研究课题，有时要考虑到选择与人群基因型及表现型分布类型相似的动物类别。主要是一些封闭群动物，如:KM小鼠，Wistar大鼠，毕格犬等。 4.生态或健康状况的相似性 在正常生命过程的研究中，找到与人类生态情况相似的替代模型非常重要。现有的不同微生物学质量级别的普通动物、清洁动物、SPF动物、无菌及悉生动物分别代表着不同的微生态模式并具有不同特点，适用于不同研究目的。 5.疾病特点的相似性
实验动物有许多自发或诱发性疾病能局部或全部地反映与人类类似的疾病过程及特点，可用于研究相关的人类疾病。 6.操作实感的相似性 外科手术性的操作模型中或教学示教中，常选择体型较大的动物。犬为首选。 四、除利用与人具有的相似性以外的实验动物选择原则 1.特殊性原则 由于物种之差异，各种动物之间存在基因型、组织型、代谢型、易感性等方面的差别，这种差异有时可作为研究课题所需的一种指标或特殊条件。 2. 易化原则 进化程度高或结构机能复杂的动物有时会给实验条件的控制和实验结果的获得带来难以预料的困难。应依据易化原则选择那些结构功能简单而又反映研究指标特质的动物。 例如：在遗传研究中，用寿命短、繁殖快的果蝇取得了丰硕的成果，而同样方法若改用灵长目动物其难度是很难设想的。 有时为了删除系统作用背景对某器官或某功能进行研究，可用离体方法进行。3.相容或匹配原则 所谓“相容”或“匹配”是指所用动物的标准化品质应与实验设计、技术条件、实验方法等条件相适应。在设计实验时不但要了解实验仪器精度和灵敏性能。了解试剂的品质、性能以及试剂和仪器之间的匹配性能，也要了解动物或动物模型对实验手段的反应能力。 4.易获性原则 易获性是理想的实验动物条件之一。 虽然猫、狗、猪及灵长动物居于较高进化水平，各有其研究价值，尤其是灵长类动物在许多方面有不可替代的优越性。然而这些大动物则往往由于其较长生殖周期，低繁殖率、低产仔率等弱点而影响其易获性，因而亦影响其被选用，故通常不作首选。 5.重现性、均一性原则 重现性和均一性为实验结果质量品质所在。若实验结果不能再现或不稳定，则该
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 试剂盒内容物： Introduction： Overview： Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。 *一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。 *一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CA T基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。 Bac-to-Bac表达系统的优点： 使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点： *与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周 *减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率 *可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白 选择pFastBac菌体（Vector）： 大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。选择对于你的需要最合适的菌体。
指南用途： 指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导： 1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择 2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒 3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒 4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白 重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知识。 Bac-to-Bac表达系统 表达系统的成分： 表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党。基于Luckow1993年的方法，此系统利用了位点特意的专座子Tn7区简化和提高重组质粒DNA *系统的第一个成分是用来克隆目的基因的pFastBac TM菌株。基于pFastBac TM菌株的选择，表达基因被AcMNPV的PH或p10启动子控制，在昆虫细胞内高水平表达表达框被Tn7 的左右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和SV40多腺苷酸化信号，形成一个微型的Tn7 *第二个主要结构是Ecoli的DH10Bac TM品系，用来作为pFastBac TM菌株的宿主。DH10Bac TM细胞包含带有微型-attTn7靶位点的病毒质粒和辅助质粒（详细见下文）。一旦pFastBac TM表达质粒转入DH10Bac细胞，转化就会发生在pFastBac TM菌株的微型Tn7单位和微型-attTn7的靶位点之间产生重组质粒。这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化蛋白处。 如果你已经完成了转化反应，你需要分离这个高分子量的重组质粒DNA并将质粒DNA转染如昆虫细胞趋产生重组杆状病毒，用来进行初步表达实验。在杆状病毒株扩增和滴定后，高效价的病毒株可以用来感染细胞，进行大规模的重组蛋白的表达。 杆状病毒菌株： 病毒菌株（杆粒），bMON14272(136KB)，在DH10Bac Ecoli中包括： *一个低拷贝的微型F复制子 *卡那霉素的抗性标记 *一个来自于pUC载体的编码LacZa肽的DNA片段，用来接触病毒转座子，Tn7（微型attTn7）已经被插入。插入的微型attTn7不会中断LacZa肽的阅读框。 杆粒在具有卡那抗性的大的质粒Ecoli DH10Bac中扩增，在显色物质如Bluo-gal 或X-gal和诱导剂IPTG 存在时，能补充染色体LacZ的缺失形成蓝斑（LacZ+） 辅助质粒：DH10Bac Ecoli也包含辅助质粒，pMON7124(13.2kb)，他编码转移酶和四环素抗性基因。这个辅助质粒提供Tn7 转化功能。 图示Bac-toBac系统：下图刻画了重组病毒的产生和目的基因的表达